Die digitale Tröpfchen-PCR bietet im Vergleich zur quantitativen PCR eine verbesserte Genauigkeit und Sensitivität. Dies ist eine einfache Methode für die digitale Tröpfchen-PCR, die eine minimale Ausrüstung und kein Fachwissen erfordert. Die Partikel-Template-Emulgierung ist eine mikrofluidikfreie Methode der Emulgierung, die keine spezielle Ausrüstung erfordert.
Darüber hinaus erfolgt die Emulgierung über einen Zeitraum von Sekunden und skaliert bis zum Behältervolumen. Für handelsübliche Perlen fügen Sie 0,5 Gramm getrocknete Polyacrylamidpartikel, die mit der Partikelvorlagenemulgierung oder PTE kompatibel sind, zu 30 Milliliter sterilem Wasser in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und mischen Sie gut. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
Für die mikrofluidische Herstellung von Perlen gießen Sie einen Milliliter Fotolack auf die Mitte eines Drei-Zoll-Siliziumwafers und drehen Sie ihn dann 30 Sekunden lang mit 500 U / min, gefolgt von 1250 U / min für 30 Sekunden. Legen Sie den Wafer für 15 Minuten auf eine auf 95 Grad Celsius eingestellte Kochplatte, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Befestigen Sie die Fotomaske mit einem Deckglasobjektträger auf dem Siliziumwafer und belichten Sie den Wafer 2,5 Minuten lang unter einer kollimierten UV-LED.
Legen Sie die Waffel fünf Minuten lang auf eine auf 95 Grad Celsius eingestellte Kochplatte, um nach der Belichtung zu backen. Entwickeln Sie den Fotolack-Siliziumwafer, indem Sie ihn bis zu 15 Minuten lang in ein Bad aus 100% PGMEA tauchen. Spülen Sie den Wafer mit frischem 100% PGMEA, gefolgt von 100% Isopropanol.
Trocknen Sie die Waffel an der Luft, trocknen Sie sie dann eine Minute lang auf einer auf 95 Grad Celsius eingestellten Kochplatte und legen Sie sie in eine saubere Drei-Zoll-Petrischale. Mischen Sie die PDMS-Siliziumbasis und das Aushärtungsreagenz im Verhältnis 10: 1 und entgasen Sie dann das gemischte PDMS mit einem Exsikkator unter Vakuum, bis keine Luftblasen mehr sichtbar sind. Gießen Sie das entgaste PDMS in die Petrischale und stellen Sie sicher, dass der Siliziumwafer vollständig untergetaucht ist.
Entgasen Sie den Siliziumwafer und pdMS und härten Sie dann das PDMS aus, indem Sie den Siliziumwafer für mindestens 60 Minuten in einen auf 65 Grad Celsius eingestellten Ofen legen. Schneiden Sie einen PDMS-Block mit den mikrofluidischen Merkmalen mit einem Skalpell aus der Petrischale aus. Stanzen Sie die Ein- und Auslässe mit einem 0,75-Millimeter-Biopsiestempel in den PDMS-Block.
Entfernen Sie dann Staub und Partikel mit dem wiederholten Auftragen und Entfernen von Verpackungsband auf die Blockoberfläche. Reinigen Sie einen Glasobjektträger, indem Sie ihn mit 100% Isopropanol abspülen und anschließend die Oberfläche an der Luft trocknen. Plasma behandelt sowohl den Glasobjektträger als auch das PDMS eine Minute lang mit einem Millibar Sauerstoffplasma unter Verwendung eines Plasma-Bonders.
Befestigen Sie das PDMS auf dem Glasobjektträger, indem Sie das plasmabehandelte PDMS mit den Merkmalen nach unten auf den Glasobjektträger legen, die plasmabehandelte Seite nach oben. Legen Sie den Schieber für mindestens 30 Minuten in einen auf 65 Grad Celsius eingestellten Ofen, um die Verklebung abzuschließen. Behandeln Sie alle mikrofluidischen Kanäle mit einer fluorierten Oberflächenbehandlung, um die Oberflächenhydrophobie zu gewährleisten, und backen Sie das Gerät dann bei 65 Grad Celsius für mindestens 10 Minuten.
Laden Sie sowohl Polyacrylamid- oder PAA- als auch Hydrofluorether- oder HFE-lösungshaltige Spritzen in Spritzenpumpen. Verbinden Sie beide Spritzen über einen Polyethylenschlauch mit dem mikrofluidischen Gerät. Führen Sie die Tropfenerzeugungsvorrichtung aus und sammeln Sie einen Milliliter der Tröpfchen in einem 15-Milliliter-Sammelröhrchen und inkubieren Sie dann drei Stunden bei Raumtemperatur zur Polymerisation.
Entfernen Sie nach der Inkubation die untere Ölschicht durch Pipettieren. Geben Sie einen Milliliter 20% PFO in HFE-Öl als chemischen Demulgator in das 15-Milliliter-Auffangröhrchen. Nach dem Mischen das 15-Milliliter-Auffangröhrchen bei 2000 x g für zwei Minuten nach unten drehen.
Entfernen Sie die unterste Schicht durch Pipettieren und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Fügen Sie zwei Milliliter 2% Sorbitanmonooleat in Hexan in das 15-Milliliter-Sammelrohr auf und wirbeln Sie es. Drehen Sie das Rohr bei 3000 x g für drei Minuten und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, um die Tensidlösung zu entfernen.
Wiederholen Sie dies zweimal. Fügen Sie fünf Milliliter TEBST-Puffer hinzu und mischen Sie gut, drehen Sie dann bei 3000 x g für drei Minuten nach unten und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Wiederholen Sie dies dreimal und resuspendieren Sie dann in fünf Milliliter TEBST.
Bereiten Sie die Polyacrylamidpartikel für die Partikel-Template-Emulgierung durch Zentrifugieren bei 6000 x g für eine Minute vor, um die Partikel zu pelletieren. Entfernen Sie dann den Überstand durch Pipettieren und resuspenieren Sie das Pellet in sterilem Wasser. Wiederholen Sie dies dreimal, um sicherzustellen, dass alle TEBST-Reste entfernt werden.
Bereiten Sie die disperse Phase in einem frischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung einer PCR-Mastermischung, der entsprechenden Primer und einer Fluorescein-Hydrolysesonde vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Bei Raumtemperatur fünf Minuten lang unter sanfter Bewegung mit einem Rohrrotator inkubieren. Die disperse Phase bei 6000 x g für eine Minute zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Fügen Sie dem Pellet einen Mikroliter saccharomyces cerevisiae genomische DNA hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren oder kräftiges Klopfen. Geben Sie 200 Mikroliter 2% Fluortensid in HFE-Öl zur Emulgierung in das Röhrchen. Entfernen Sie das Pellet durch Pipettieren oder Klopfen des Rohrs und wirbeln Sie dann 30 Sekunden lang mit 3000 U / min.
Lassen Sie die Emulsionen eine Minute lang absetzen, entfernen Sie dann 100 Mikroliter der unteren Ölphase und ersetzen Sie dieses Volumen durch frisches 2% Fluortensid in HFE-Öl. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um es zu mischen. Wiederholen Sie dies dreimal oder öfter, bis kleine Satellitentröpfchen entfernt werden.
Nach zwei bis fünf Minuten Absetzen entfernen Sie die untere Ölphase. Ersetzen Sie dieses Volumen durch 5% Fluortensid in Fluorcarbonöl. 100 Mikroliter Proben in 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen pipettieren und die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler geben.
Pipettieren Sie die Probe auf einen Zählobjektträger für die Fluoreszenzbildgebung und bilden Sie die Probe ab. Die Emulgierung mit Partikelschablonen bietet eine hervorragende Monodispersität. Wenn der überschüssige Überstand entfernt wird, wird stabilisierendes Tensid zugegeben, und die Probe wird gewirbelt, um die Emulsion zu erzeugen.
Die resultierenden Tröpfchen bestehen aus Partikelkern und wässriger Probe, die Reagenzien und Probenmoleküle oder -zellen enthält, die für die Reaktion notwendig sind. Polydispersierte Tröpfchen mit Templating-Partikeln weisen auf einen unzureichenden Wirbel hin. Ein weiteres Problem ist die Erzeugung übermäßiger Satelliten, die die Verkapselungseffizienz verringern.
Satelliten sollten nicht mehr als 10 % des gesamten eingekapselten Probenvolumens ausmachen. Sie können durch Waschen mit frischem Öl aus der Emulsion entfernt werden. Der Nutzen von PTE kann in der digitalen PCR demonstriert werden, wenn Tröpfchen, die amplifizierte Targets enthalten, fluoreszierend werden, was eine direkte Quantifizierung von Targets ermöglicht.
Die fluoreszierenden Tröpfchen liefern nur wenige positive Ergebnisse, wenn das Ziel selten ist, und viele, wenn es reichlich vorhanden ist. Diese Ergebnisse sind mit kommerziell erhältlichen Polyacrylamidpartikeln wiederholbar und erzielen genaue Messungen über den gleichen Bereich. Die Entfernung von Überstand aus der dispersen Phase ist wichtig für die Probenverkapselung.
Die Kenntnis des Volumens des Pellets und des Überstandes kann helfen, die Schnittstelle zwischen den beiden zu identifizieren. Wenn Sie Zweifel haben, irren Sie sich auf der Seite des Entfernens des Überstandes.
