This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Ethik-Erklärung: Die Vollblut-Proben in dieser Studie verwendet werden, nicht am Menschen zu sein Forschung. Die Proben wurden für klinische Diagnosezwecke erhalten, die erfüllt waren, und der restliche Teil dieser Proben wurde für die FINA Forschungs Assay bereitgestellt. Die Proben wurden so codiert, daß die Forscher die Identität von Personen nicht in der Lage, ohne weiteres festzustellen waren. 1. Herstellung von FINA Probenvorbereitungsmodul <ol><li> Bereiten Sie Pad Blotting eine 35 x 35 mm 2 einer 2,6 mm dicken 100% Baumwolle - Pad durch Schneiden. Schneiden Sie ein Pad pro Probe. </li><li> Bereiten Kunststoff Paraffinfilm mit einem Papierträgerband durch ein Schneidstück Paraffinfilm (25 mm (h) von 50 mm (w)) und dann eine 7,14 mm Durchmesser Loch in der Mitte des Bandes Stanzen eines Hammer angetrieben Locher mit. Bereiten Sie eine Band pro Probe. </li><li> Bereiten Sie ein gebundenes Glas Bluttrennmembran (Capture-Membran) Scheibe durch einen 8,35 mm Durchmesser-Kreis Stanzenmit einem Hammer angetrieben Locher. Lochen eine Platte pro Probe. Die Scheibe hat eine Partikelrückhaltevermögen von 2,3 &amp; mgr; m. </li><li> Montieren Sie die FINA Probenvorbereitungsmodul durch die Aufnahmeplatte in der Mitte der Schreibunterlage mit einer Pinzette platziert. Legen Sie das Paraffin Filmband über die Capture-Scheibe, so dass das Loch des Paraffins Band in der Mitte der Fangplatte ausgesetzt verlässt. </li><li> Stellen Sie sicher, einen maximalen Kontakt zwischen der Platte und dem Löschblatt durch das Paraffin Band dehnen leicht die Schreibunterlage und Drücken des Paraffin Band zu bedecken fest an die Schreibunterlage zu bleiben, um alle Kanten der Platte. </li><li> Machen Sie so viele Module wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt. </li></ol> 2. Herstellung von qPCR-Schlauch <ol><li> Vorbereiten eines 5,1 mm-Bandscheibe, die die Zelle Einfangmembran auf der Seite der qPCR Röhre verankern wird die Membran von Blockierung der Fluoreszenzdetektion durch Stanzen eines Kreises von doppelt beschichteten polye zu verhindernster Diagnoseband mit einem Hammer angetriebenen Stempel aus einem Blatt des Bandes. Bereiten Sie eine Bandscheibe pro Probe. </li><li> Entfernen Sie eine Seite der Aufkleber Schiff der Band. Legen das Band in einem 200 &amp; mgr; l PCR-Röhrchen, das auf der einen Seite und in Richtung der Unterseite des Rohres haften. Entfernen Sie den zweiten Sticker-Liner. Das Rohr ist nun fertig vorbereitete Platte zu erhalten. </li><li> Produzieren Sie so viele Rohre wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt. </li></ol> 3. Contrive Blutprobe Hinweis: Wenn ein echter Testprobe vorbereitet wird, gehen Sie zu Schritt 4. <ol><li> Thaw 8E5-LAV - Zellen 15 eine einzige Kopie der HIV-1 - Provirus erhalten aus der Virologie Qualitätssicherung Labor beherbergen (VQA; Eile Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.). Hinweis: sie gespeichert sind, als gefrorene Zellpellets in einer Konzentration von 4.000 Zellen / &amp; mgr; l. Zellzahl wurde zuvor 9 wie beschrieben verifiziert. </li><li> bereiten serial Verdünnungsmedium (90% fötales Rinderserum, 10% Dimethylsulfoxid) auf Konzentrationen von 1 bis 400 Zellen / ul in einfriert. </li><li> Pipette 10 ul Zellen aus jedem der seriellen Verdünnungen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l Frisch HIV-1 negativen EDTA behandelt Vollblutprobe in jedes Röhrchen 10-4,000 eine Standardkurve von 8E5-LAV-Kopienzahlen zu erstellen. Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. </li></ol> 4. Führen Sie FINA-Extraktion <ol><li> Lyse Blutzellen durch Zugabe von Triton-X100) bis zu einer Endkonzentration von 1% (11 &amp; mgr; l 10% Triton-X100 bis 110 &amp; mgr; l Vollblut und Zellen aus Schritt 3.3). </li><li> Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. Das Blut sollte durchscheinend rot. </li><li> Pipettieren alle der Blutprobe auf die Capture-Platte. Hinweis: Eine wasserdichte Abdichtung zwischen dem Paraffin Band und der Einfangmembran stellt sicher, daß das Blut die Membran fließt, und einen guten Kontakt zwischen dem Erfassungs membrane und Schreibunterlage Montage sorgt für eine schnelle Probe Feuchtigkeitstransport. </li><li> Lassen Sie Probe durch den Filter zu tränken. Hinweis: Die Blut-Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Capture-Platte zu erfassen. Das Lysat wurde in die Scheibe eingetaucht, wenn es matt erscheint. </li><li> In 600-1.000 &amp; mgr; l 10 mM NaOH tropfenweise auf die Capture-Platte. Hinweis: Die Pufferwäsche kann auch als bulk Zugabe von 600 &amp; mgr; l zugegeben werden. Der Puffer wird ein Tröpfchen auf dem hydrophoben Paraffinband bilden und in etwa 20 sec auf die Platte durch das Loch Docht. Der Filter wird von rot auf weiß anzeigt, Clearance von Hämoglobin ändern. </li><li> Trennen Sie die Diskette aus dem Löschblatt mit einer Zange und ziehen Sie die Platte auf das Band in die vorbereitete PCR-Röhrchen. Wenn es eine rote Farbe auf dem Filter hinzufügen, 50-100 &amp; mgr; l Waschpuffer gelassen ist, den Filter zu löschen, bevor in die Röhre platzieren. Hinweis: Gelegentlich kam es Überdruck angewendet bei der Herstellung vondie FINA-Module Ergebnisse in Partitionierung der Membranschichten während der Trennung von der Schreibunterlage. Entsorgen Sie diese Disketten und bereiten eine neue Probe. </li><li> Nachdem der Filter in dem PCR-Röhrchen platziert wird, analysieren die Proben sofort. Alternativ trocken über Nacht in einem Karton mit Calciumsulfat Trocken, dann verschließen und in einen Folienbeutel mit Kieselsäure Trocken- und Speicher bis zur Analyse bereit. </li></ol> 5. qPCR-Reaktion <ol><li> Bereiten Sie 100 ul qPCR Mastermix pro Reaktion unter Verwendung von HIV - spezifische Primer und Sonden , wie zuvor beschrieben 9,11. Umfassen eine interne Amplifikationskontrolle für die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten Inhibitoren zu überwachen und zu überprüfen, ob eine negative Probe ein wahrer negativ ist. Stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig mit Mastermix abgedeckt ist und dass der Filter zur Seite des Rohres während der gesamten Reaktions fixiert bleibt. </li><li> Für die Amplifikation eine Echtzeit - PCR - Gerät , wie zuvor 9 beschrieben. </li></ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. 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M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. 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The authors have nothing to disclose.

EID verbunden schnelle Behandlung Zugang hat sich gezeigt , die Kindersterblichkeit zu reduzieren aufgrund einer HIV - Infektion 16. Aufgrund der Persistenz der mütterlichen Antikörper bei einem Säugling Blut haben Dienstprogramm schnellen HIV-Antikörper-Tests begrenzt den Status von HIV-exponierten Neugeborenen bei der Bestimmung. Die WHO empfiehlt , dass alle Kinder von HIV-1 - positiven Müttern geboren sollte bei 4-6 Wochen alt getestet werden, eine virologische Test 17 ​​verwendet wird . Wir haben die Entwicklung eines Assays für den Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA in Vollblutproben berichtet , die mit zeigten 100% Sensitivität und Spezifität in einem kleinen Feldauswertung von 61 South African Säuglinge 11 fähig Einzelkopie - Erkennung ist. Einhundert Mikroliter oder mehr Vollblut können über Finger oder Ferse - Stick und verarbeitet über die FINA - Module 18,19 gesammelt werden. Diese Blutproben können dann für mindestens einen Monat gelagert werden, vor der Verstärkung macht diese Methode ideal für Säuglinge zu testen, die weit von den Labors sind. In der Studie in Abbildung 3 wird eine Standardkurve von gekünstelt Proben von HIV-1 negativen Vollblut gespickt mit aufgetauten Zellen DNA - HIV-1 - Provirus beherberge dargestellt. Eine Einschränkung dieser Studie ist, dass einige der zur Probe gegeben Zellen bereits aufgrund der Frost / Tau-Lyse haben könnte, die möglicherweise die Nachweisgrenze des Ziel verbessert haben könnte. Eine strengere experimentelle Design wäre gewesen, die Probe haben, haben zu gekünstelt mit frisch gezüchteten Zellen, die genauer Vollblut nachgeahmt hätte. Die FINA Probenvorbereitungsmethode wurde zum Einbau in eine EID POC qPCR - Gerät (in Entwicklung) für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen 8; jedoch kann das manuelle Format hier beschrieben auch eine sinnvolle Ergänzung zu einem Probenvorbereitungsportfolio Labor sein. FINA nicht die Bind verwenden, waschen und Strategie in dri verwendet eluierened Blutflecken und andere papierbasierten Extraktionssysteme, der die extrahierten Nukleinsäuren verdünnt, was möglicherweise zu einer suboptimalen Nachweisempfindlichkeit 5. Die FINA System ist sehr flexibel und kann leicht für andere genetische Tests neben provirale HIV DNA-Nachweis angepasst werden. Geringere Mengen von Blut oder anderen biologischen Proben können für reichlich Ziele und höhere Mengen für weniger reichlich diejenigen verarbeitet werden. In unseren ursprünglichen Ausführungsform der FINA System erfassen wir die Zellen aus Vollblut eine Bluttrennungsmembran und dann durch die Zugabe von 10 mM NaOH 9 lysieren. Diese Version hat den Vorteil einer geringeren Benutzer Schritte, aber die Zellzahl / Blutvolumen, das verarbeitet werden kann, ist kleiner. Zusätzlich zu dem gebundenen Glasmembran in diesem Bericht, andere Bluttrennung oder Blutsammelfilterpapiere verwendet wurden mit diesem Verfahren erfolgreich verwendet haben, und mehrere verschiedene quantitative PCR Instrumente wurden auch in der f eingebettet gezeigt Vorlage zu amplifizierenilter Scheibe 9. Die einzige Bedingung ist, dass der Filter nicht die Fluoreszenz Lesen der Echtzeit-PCR-Instrument blockiert. Eine erhebliche Einschränkung der FINA Extraktion ist, dass es eine Größenbeschränkung auf den Durchmesser der Erfassungsmembran ist. Eine Scheibe mit einer Membran, die größer als 9 mm kann nicht ohne die Membran überlappend in dem Rohr in einem 200 &amp; mgr; l qPCR Röhrchen gegeben werden, die den Oberflächenbereich zu dem Reaktionsgemisch ausgesetzt begrenzt. Zusätzlich wird je größer der Scheibendurchmesser ist, desto qPCR Reaktionsvolumen erforderlich, um den Filter zu bedecken, was die Kosten erhöht und die Turn-Around-Zeit des Assays. Wenn der Filter zu klein ist, um effizient die DNA in der Probe zu erfassen, kann es verstopfen effizientes Waschen zu verhindern. Unter Verwendung der gebundenen Glas Einfangmembran konnten wir nur HIV-1 proviralen DNA und nicht die virale RNA aus Vollblut Proben zu erfassen (Daten nicht gezeigt). Wir wissen nicht, ob alternative Membranen oder Puffer könnte t verwendet werdeno fördern Isolierung von RNA anstelle von oder zusätzlich zu DNA. Wenn der Leser möchte nur DNA aus der Probe zu isolieren Dieses Protokoll erfordert nicht die enzymatische Entfernung von RNA mit einigen Protokollen erforderlich. Erkennen von sowohl HIV-1-RNA und DNA in klinischen Proben würden die Empfindlichkeit von EID und diesen Mangel an RNA-Detektion ist eine Einschränkung unseres diagnostischen Tests zu verbessern. Der wichtigste Schritt in der FINA Prozess zu einem neuen Test Anpassung ist , die Größe des Filters zur Validierung der Menge an DNA aufzunehmen, dh die Anzahl von Zellen in der Probe getestet werden. Im allgemeinen FINA Extraktion funktioniert am besten mit Proben mit einer kleineren Anzahl von Zellen, so dass kleinere Erfassungsplatten verwendet werden können. Um die Bindungskapazität des Filters bestimmen, fügen Sie einfach eine zweite Filterscheibe auf die FINA-Modul unter der Sammelmembran gestapelt. Fügen Sie die Probe und waschen Sie die Membranen wie in den Schritten 4,1-4,5. Platzieren Sie jede der DNA-Fängerplatten in einzelne qPCR Röhren und VerstärkerLiFY. Unter Verwendung einer Standardkurve, bestimmen die Prozent der Input-DNA auf jedem Filter aufgefangen. Die Größe des Filters kann auf die Bedürfnisse des Assays optimiert werden. Für die FINA provirale DNA Assay hier beschrieben, zu mehr als 99% der menschlichen genomischen DNA erfasst wird, wenn Zelllysat zu dem Filter (nicht veröffentlichte Beobachtungen) ermöglicht superior Detektionsfähigkeiten hinzugefügt wird. Neben EID, zukünftige Anwendungen von FINA könnte den Nachweis und die Quantifizierung von proviralen DNA als Biomarker für HIV-1-Überwachung mit Patienten umfassen, die aufgrund einer antiretroviralen Therapie virale Suppression erreicht haben. Behandlung und Überwachung von HIV-Eradikation abzielen könnten Reservoire von HIV-1-infizierten Zellen durch Screening anderen Eingänge neben peripherem Blut durchgeführt werden. Provirale HIV-Test könnte auch verwendet werden, Impfstoff Versuchspersonen für eine echte Infektion zu screenen. Die Blutproben sind stabil während der Lagerung auf FINA-Modulen und kann unter Feldbedingungen für den späteren Versand an ce gesammelt werdenntral Laboratorien für die PCR-Analyse dieses Verfahren ideal für epidemiologische Studien zu machen. Zusätzlich zu HIV-1-Erkennung, diese hochflexible Verfahren könnte auch Präzisions Medizin Ziele verwendet werden in biologischen Proben wie Pharmakogenetik Screening oder andere SNP-Nachweis oder zur schnellen Genotypisierung von Tiermodellen gefunden zu amplifizieren. Isotherme Amplifikationsverfahren wie Helicase abhängigen Amplifikation (HDA) oder loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) könnte auch mit FINA verwendet werden extrahierte Vorlage oder die DNA-embedded auf dem Filter kann als Vorlage für die herkömmliche PCR-Amplifikation verwendet werden.

Mehrere Berichte haben die Entwicklung von papier- oder membranbasierten Extraktionsverfahren für die Verwendung in Point-of-Care (POC) -Geräte 1-5 mit dem Ziel, die exquisite Sensitivität und Spezifität der molekularen Diagnostik zur Verfügung zu allen diskutiert. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Sexuell übertragbare Krankheiten Diagnostics Initiative prägte den Begriff ASSURED (Bezahlbar, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundliche, schnelle und robuste, Ausrüstung frei und Lieferung für diejenigen, die es brauchen) die idealen Eigenschaften eines POC zu beschreiben Test 6. Von diesen Richtlinien ist die Ausrüstung freie charakteristische besondere Herausforderung für die molekulare Diagnostik zu erreichen. Jede Innovation auf dem Gebiet wird jedoch voran das Ziel , die in den meisten Bedürftigen erreicht, und es gibt Hoffnung für kurzfristige Verbesserungen der Testleistung von bestehenden Technologie zur Anpassung 7. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die DNA aus Vollblut zu extrahierendass erfordert keine komplexe Chemie oder Laborinstrumente. Die FINA (Filtration Isolierung von Nukleinsäuren) Probenvorbereitung wurde ursprünglich um DNA aus Vollblut zu extrahieren Leukozyten entwickelt, um die HIV-1-Provirus als Teil einer Probe zu beantwortende Point-of-Care (POC) quantitative PCR zu erkennen (qPCR) frühkind Diagnose (EID) Plattform für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen 8-11. FINA Extraktion unterscheidet sich von herkömmlichen Reinigungsverfahren Silikamembranen oder Silika-beschichteten paramagnetischen Partikeln verwenden , um reversibel DNA in Gegenwart von chaotropen Mitteln 12 binden. Stattdessen verwendet FINA vertikale Filtration über eine Trennmembran direkt zelluläre DNA aus Vollblut zu extrahieren. Die Membran , die die eingeschlossene DNA enthält , kann direkt in einem PCR - Röhrchen gegeben werden und entweder sofort in einer PCR - Reaktion oder Luft für die spätere Amplifikation 9 getrocknet eingesetzt. Keine chaotropen Mitteln, Phenol oder Alkohole werden in der Probenextraktion verwendet, eliminating die umfangreichen Waschschritte benötigt starke qPCR - Inhibitoren aus dem Extraktionsprozess 13,14 abgeleitet zu entfernen. Die FINA Membran kann entweder Zellen 9 oder genomische DNA erfassen durch Zelllyse freigesetzt 11 , bevor die Probe auf die Membran gegeben wird. Für die Zell capture wird Vollblut direkt auf die Membran gegeben. Anschließend werden die Zellen in der Membran lysiert durch Zugabe von 10 mM NaOH. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nur drei Schritten durchgeführt: 1) Probenzugabe; 2) Zelllyse / Wäsche und 3) Filterscheibe Platzierung in qPCR Rohr. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Membran nur eine definierte Anzahl von Zellen direkt proportional zum Durchmesser der Membranscheibe halten kann. Um die Nachweisgrenze zu erreichen für EID benötigt wurden 100 ul Vollblut wird für die Probeneingabe erforderlich, die einen Filter beinhaltet, der zu groß ist, in einem qPCR Rohr platziert werden. Lyse der Blutzellen mit einem Reinigungsmittel, bevor die Probe in die Auflistung hinzufügenMembran fügt einen Verarbeitungsschritt, jedoch ermöglicht die Verwendung eines kleineren Filters für die gleiche Probengröße. Wir konnten eine hohe Reproduzierbarkeit, einzelne Kopie Erkennung und Quantifizierung von weniger als 10 Kopien des HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Blut Konfiguration 11 mit diesem Test zu demonstrieren. In diesem Bericht beschreiben wir die FINA-Protokoll, wie sie ursprünglich für den Laboreinsatz entwickelt. Die Membran / Filter-Sandwich als FINA Probenvorbereitungsmodul bekannt sind, können in großen Chargen und auf Halde für die spätere Verwendung vorbereitet werden. Wenn die Proben in diesem Prozess, 2 dauert min extrahiert werden und kann in unterschiedlicher Größe Chargen durchgeführt werden. Die qPCR können sofort ausgeführt werden oder die Filter die eingebettete DNA enthalten, können gespeichert werden, bis es bequem ist, qPCR auszuführen. Diese Methode ist sehr bequem für die Routineanalyse von Proben in niedrigen und hohen Ressourceneinstellungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, Filtration Isolierung von Nukleinsäuren, ist ein neuartiges Extraktionsverfahren, das über eine Trennmembran und absorbierendes Kissen zum Extrahieren der zellulären DNA aus Vollblut in weniger als 2 min vertikale Filtration verwendet. Die Blutprobe wird mit einem Detergens, behandelt kurz gemischt und mit einer Pipette auf die Trennmembran aufgebracht. Das Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Trennmembran zu erfassen. Die extrahierte DNA wird auf die Membran während einer einfachen Waschschritt zurückgehalten, wobei PCR-Inhibitoren Schlechten in das absorbierende Löschblatt sind. Die Membran, die die eingeschlossene DNA enthält, wird dann ohne weitere Reinigung der PCR-Reaktion zugesetzt. Diese einfache Methode nicht Laborausrüstung erfordern und kann leicht mit preiswerten Labormaterialien realisiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum hochempfindlichen Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Vollblut als ein Modell für frühfant Diagnose von HIV, die ohne weiteres auf andere genetische Ziele angepasst werden könnte.

Der Workflow für provirale DNA aus Vollblut extrahieren gespickt mit 8E5-LAV - Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die FINA Probenmodul und vorbereitet qPCR Rohr. Dieses Verfahren ermöglicht eine effiziente Amplifikation von HIV-1 - Provirus von 8E5-LAV - Zellen bei unterschiedlicher Kopienzahl, wie in der Standardkurve von künstlich Proben (Figur 3) dargestellt. PCR hatte einen Wirkungsgrad von 103%, wie aus Efficiency berechnet = -1 + 10 (-1 / Steigung). Die Gleichung der Linie war y = -3.25x + 27.95, mit einer Korrelation von R² = 0,996. Die provirale HIV DNA - Standardkurve repliziert auch in hohem Maße reproduzierbar Verstärkung haben, wie in Tabelle 1 zeigt. Darüber hinaus eine interne Kontrolle von 500 Exemplaren Hydroxypyruvat Reductase vorhanden ist , zu zeigen , dass es keine PCR - Hemmung ist aus extra Blut mit FINA, unabhängig von der Anzahl von Kopien von HIV-1-Provirus vorhanden ist (Abbildung 4). IC-Amplifikation wurde in allen 18 Proben getestet, mit einer durchschnittlichen Cq von 21,92 ± 0,25 und einem CV von 1% effizient erhalten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow für provirale DNA aus Vollblut Nachweis gespickt mit 8E5-LAV - Zellen zu qPCR. (A) von links nach rechts, die vorbereitete FINA - Modul nach dem Blut in die Capture - Membran hinzugefügt wird und nach dem Waschpuffer hinzugefügt wurde. (B) qPCR Rohre mit Fängerplatten stecken doppelt beschichtete Band mit qPCR Master Mix hinzugefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig2.jpg" /> Abbildung 2: FINA in-house - Modul und qPCR Rohrvorbereitung. </strong&gt; (A) Ein 8,35-mm - Durchmesser - Scheibe - Capture - Membran zwischen einem Quadrat 707 Blotting - Pad und eine dünne Schicht aus Paraffin Band eingelegt wurde , wurde ein 7,14-mm-Durchmesser - Loch in der Mitte enthält , so dass das Loch des Paraffins Band zentriert auf der Fangplatte für die direkte Anwendung von lysierten Blut durch pipettieren. (B) A 5,1 mm doppelt beschichtete Polyester - Diagnoseband an der Seite von 200 ul qPCR Rohr stecken. Der zweite Liner von Band wird entfernt für die Anwendung Capture - Platte , wenn bereit klebrige Oberfläche zu belichten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig3.jpg" /> Fig . 3: Standardkurve von HIV-1 proviralen DNA ersonnen Proben (A) Amplification Plots erhalten aus 100 ul 4 repliziert HIV-1 negative Vollblut versetzt mit 4000, 400, 40 und 10 8E5-LAV-Zellen mit 500 Kopien / Reaktion der internen Kontrolldurchgezogene Linien = Verstärkung Plots; Die gestrichelte Linie = Schwelle. Y-Achse ist die Fluoreszenzeinheiten und X-Achse ist qPCR Zykluszahl. (B) Standardkurven von Cq Werte von Amplifikationsplot berechnet gegenüber dem Log - Kopienzahl von 8E5-LAV - Zellen pro 100 &amp; mgr; l Vollblut. Die Gleichung der Linie: y = -3.25x + 27.95; R² = 0,996; PCR - Effizienz = 103,23% über Effizienz berechnet = -1 + 10 (-1 / Steigung) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig4.jpg" /> Abbildung 4: Interne Kontrolle gibt keine qPCR Hemmung 500 Kopien Hydroxypyruvat Reductase Amplification Kontroll - Plasmid pro Reaktion zugegeben.. SolideLinien = Verstärkung Plots; Die gestrichelte Linie = Schwelle. Durchschnittliche Cq von IC = 21,92 ± 0,25. Cqs reichte von 21,21 bis 22,32. Variationskoeffizient (CV%) = 1%; N = 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 8E5-Zellen LAV / </td></tr><tr><td> 100 &amp; mgr; l WB </td><td> Ave. cq </td><td> SD </td><td> LEBENSLAUF (%) </td></tr><tr><td> 4000 </td><td> 16.27 </td><td> 0,14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 19.54 </td><td> 0,15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 22.56 </td><td> 0,3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 24.83 </td><td> 0,15 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>Tabelle 1: Durchschnittliche Cq, Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient (CV%) von 4.000, 400, 40 und 10 Kopien von 8E5-LAV - Standardkurve mit FINA - Extraktion und HIV-1 - spezifische Primer und Sonden. N = 4. WB = Vollblut.

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Aufrufe.  Northwestern University.  Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden. 

Serie: Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Forschung

Biologie

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.