Mittel für die Entwicklung der Extraktion Pipette wurde zum Teil von einer internen Forschung und Entwicklung Zuschuss für DRP zur Verfügung gestellt.

1. Probenlyse <ol><li> Die Proben sollten in flüssiger Form vorliegen. Wenn Probe ist solide, zum Beispiel Lebensmittel oder Stuhl, sollte die Probe in einem flüssigen Medium wie Wasser oder Phosphat ausgesetzt werden Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Mischen Sie 500 ul der Probe mit 500 ul 6M Guanidinthiocyanat (pH 6,5) in einer 1,5-ml-Tube. </li><li> Drücken Sie den Kolben der Pipette ein Extraktionsverfahren, die Vertreibung der Umgebungsluft. </li><li> Ziehen Sie den ganzen 1 mL Probe in die Pipette Extraktion, über dem Sorptionsmaterial, indem sie die Glühbirne langsam zu erweitern. </li><li> Kehren Sie die Extraktions-Werkzeug, so dass die Perlen Sorbens und Probe Drain in der Birne. </li><li> Schleifen Sie die Sorbens-Kügelchen, die mit der Probe in der Glühbirne darauf achten, daß die Probe aus der Extraktion zu vertreiben Pipette. </li></ol> 2. Nukleinsäure-Extraktion (Abbildung 1, Teil A) <ol><li> Kehren Sie die Extraktion Pipette (Öffnung nach unten) und zu vertreiben, die Probe in der ursprünglichen 1,5 ml Tube. </li> &lt;li&gt; Ziehen Sie den ganzen 1 mL Probe in die Extraktion Pipette, die über das Sorbens, mit mäßiger Geschwindigkeit, dabei darauf achten, das Sorbens in den Hals der Pipette Extraktion zu halten. </li><li> Vertreibt die gesamte Probe in das 1,5 ml Tube durch Drücken der Glühbirne. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3, vorbei an der Probe über den Sorptionsmittel vier weitere Male für insgesamt 5 Durchgängen. </li><li> Nach dem fünften Durchlauf über das Sorbens, vertreiben die gesamte 1 mL Probe in 4 ml der Protein-Extraktions-Puffer (in einem 15 ml konischen Röhrchen), schließen Sie das Rohr, und beiseite stellen für die spätere Verwendung. </li><li> Waschen der isolierten Nukleinsäuren, indem 1 ml 95% Ethanol in den Sorbens dreimal Rücksendung der Ethanol in seine ursprüngliche Röhre auf letzte Passage. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,6 unter Verwendung einer zweiten 1 mL, 95% Ethanol waschen. </li><li> Drücken Sie kurz die Lampe für 5 Minuten, vorbei an der Luft in die Pipette, um die Extraktion von Nukleinsäuren / Sorbensbett trocknen. Wischen restliche Ethanol von der Spitze der Pipette Extraktion usingen ein Kimwipe. </li><li> Wiederherstellen der Nukleinsäuren, indem 250 ul 10 mM Tris (pH 6,8) über die Sorbens fünfmal. Die Tris-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung, wie PBS ersetzt werden. Die resultierende Lösung enthält die extrahierten Nukleinsäuren. </li></ol> 3. Protein-Extraktion (Abbildung 1, Teil B) <ol><li> Mischen Sie die Probe-und Protein-Extraktionspuffer Rohr von 2,5 Schritt durch Umdrehen und gehen etwa zwei bis drei Milliliter dieser 5 ml Probe über dem Sorbens Extraktion eines neuen Pipette. </li><li> Austreiben des gesamten Probe in der gleichen 15 ml konischen Röhrchen darauf achten, das Sorptionsmittel in den Hals der Extraktion Pipette zu halten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2, vorbei an der Probe über den Sorptionsmittel 15-mal. </li><li> Waschen des Sorbens und das gebundene Protein, indem 1 ml 95% Ethanol über das Sorptionsmittelbett dreimal Ausstoßen der Ethanol in seiner ursprünglichen Rohres. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3,4 unter Verwendung einer zweiten 1 mL, 95% Ethanol waschen. </li><html><li> Drücken Sie kurz die Lampe für 5 Minuten, vorbei an der Luft in der Gewinnung Pipette, um das Protein / Sorbensbett trocknen. Wischen restliche Ethanol von der Spitze der Pipette unter Verwendung der Extraktion einem Kimwipe. </li><li> Recover, die das Protein, indem man 250 ul PBS über die Sorbens fünfmal. Der PBS-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung, wie 10 mM Tris (pH 6,8) ersetzt werden. Die resultierende Lösung enthält, die das Protein der Probe. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="1A" /> Abbildung 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Inhalt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Werkzeug-, Chemie-und Protokoll in diesem Bericht beschriebenen repräsentieren die erste bekannte Beispiel eines Strom-frei, Multi-Extraktion Makromolekül, das in Feld-basierte Point-of-Care-Anwendungen genutzt werden können. Beide Typen können Makromolekül eine Reihe von nachgeordneten diagnostische oder analytische Vorrichtungen angewendet werden. Zum Beispiel sind die isolierten Nukleinsäuren PCR Qualität (2 und 3), während die Protein-Komponente der Probe immunreaktiv ist (Abbildung 4). Die Verwendung dieser Absauganlage in herber oder Ressource begrenzte Bereiche der Welt könnte drastisch reduzieren die Belastung durch Krankheiten auf die dort lebenden Bevölkerungen. Diese Extraktion System könnte auch in Krankheitsüberwachung Programme in der ganzen Welt zu helfen, indem sie eine robuste und dennoch schnelle und kostengünstige Methode zur Probenaufbereitung in herber oder entfernten Standorten. Ein wichtiger Aspekt der oben beschriebenen Extraktionsverfahren ist, dasses kann vom Benutzer geändert werden. Zum Beispiel in Fällen, wo die Probe eine Größe größer oder kleiner als die ersten 500 μLs (Schritt 1.2), kann der Benutzer das Volumen der Reagenzien entsprechend. Das heißt, das volumetrische Verhältnis der Reagenzien zu der Probe Größe sollte konstant bleiben, während die absoluten Mengen geändert werden kann. Außerdem können Anpassungen in der Anzahl der Durchgänge über die Sorbens auch nach Ermessen des Benutzers erfolgen. Zum Beispiel, wenn ein größeres Probenvolumen verwendet wird, wobei das Gas in den Sorbens öfter als aufgeführt (Schritte 2.4 und 3.3) erhöht die Wahrscheinlichkeit des Makromoleküls Typ (Nucleinsäure oder Protein) Kontaktieren des Sorbens. Der Anstieg der Passagen sollten erhöhen die Effizienz zu erfassen, bis Sorbens Sättigung erreicht ist. Wir haben festgestellt, dass der Extraktions-Werkzeug und die damit verbundenen chemischen einige Einschränkungen, die bedeutendste davon, dass die Protein-Extraktions-Chemie ineffizient für die Verwertung von hochglykosylierte ist habenProteine. Für den Fall, dass der stromabwärtige Diagnose eines glykosylierten Proteins abzielt, kann dieses System nicht ideal für die Identifizierung. Darüber hinaus werden die oberen und unteren Grenzen für die Gewinnung für entweder Nukleinsäuren oder Proteine ​​noch bestimmt wird, und die Optimierung im Gange, um Rückgewinnung zu maximieren. Die weitere Entwicklung des Werkzeugs wird der Überwindung dieser aktuellen Wissenslücken.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Guanidinthiocyanat </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-Propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109.827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

Traditionelle und entstehende Krankheitserreger wie Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, oder Prion-basierten Krankheiten sind von großem Interesse für Regierungen, Industrie und medizinische Fachkräfte weltweit. Zum Beispiel sind EHECs, mit Shigella kombiniert, verantwortlich für den Tod von etwa 325.000 Kinder pro Jahr und sind besonders häufig in den Entwicklungsländern, wo Labor-basierte Identifikation, gemeinsam in den Vereinigten Staaten, nicht verfügbar ist 1. Die Entwicklung und den Vertrieb von Low-Cost, konnte Feld-basierte Point-of-Care-Tools, um bei der schnellen Identifizierung und / oder Diagnose von Krankheitserregern oder Krankheitsmarker helfen dramatisch verändern Krankheitsverlauf und die Prognose der Patienten. Wir haben ein Werkzeug, um Nukleinsäuren und Proteinen aus einer Probe durch Festphasenextraktion (SPE) zu isolieren, ohne Elektrizität oder assoziierten Laborgeräte 2 entwickelt. Die isolierten Makromoleküle können für die Diagnose verwendet werdensis entweder in einem Labor oder nach vorne über das Feld-basierte Punkt-of-Care-Plattformen. Wichtig ist, bietet diese Methode für den direkten Vergleich von Nukleinsäuren und Proteinen Daten aus einer ungespalteten Probe und bietet ein Vertrauen durch Bestätigung der Genom-und Proteomanalyse. Unsere Isolation Werkzeug verwendet den Industriestandard für die Festphasen-Isolierung von Nukleinsäuren, die BOOM-Technologie, die von Nukleinsäuren aus einer chaotropen Salzlösung, in der Regel Guanidinisothiocyanat, durch Bindung an Siliciumdioxid basierende Teilchen oder Filter 3 isoliert. CUBRC proprietären Festphasenextraktion Chemie wird verwendet, um Protein aus chaotropen Salzlösungen zu reinigen, in diesem Fall aus dem Abfall oder Durchflussgefäße nach Nukleinsäure-Isolierung 4. Durch die Verpackung Chemikalien in eine kleine, kostengünstige und einfache Plattform gut charakterisierten, haben wir ein tragbares System zur Nukleinsäure-und Protein-Extraktion, die unter einer var durchgeführt werden können, erzeugtiety von Bedingungen. Die isolierten Nukleinsäuren sind stabil und können zu einer Position, zur Verfügung steht für die PCR-Amplifikation transportiert werden, während der Proteingehalt kann sofort der Hand gehalten oder anderen immunologischen-basierten Assays analysiert werden. Die rasche Identifizierung von Krankheiten Marker im Bereich erheblich verändern könnte der Patient Ergebnis, indem er den richtigen Verlauf der Behandlung in einem früheren Stadium des Fortschreitens der Krankheit. Das Werkzeug und ein Verfahren beschrieben, eignen sich zur Verwendung mit nahezu jeder Erreger und bieten dem Anwender die Redundanz der Multi-Makromolekül-Typ-Analysen bei gleichzeitiger Reduzierung der logistischen Aufwand.

Nukleinsäure-Isolierung: Isolierte Nukleinsäuren sind PCR-amplifizierbare und frei von Protein Verunreinigungen. Beispiel 1: Die gewonnenen Nukleinsäuren sind für die Verwendung in PCR-basierte Anwendungen. Zum Beispiel zeigt 2 die Verstärkung des Shiga-Toxin-Gene mit enterohämorrhagischen E. zugeordnet coli O157: H7-Stamm EDL-933 (ATCC # 35.150) von einer Nukleinsäure / Protein-Extraktionsverfahren unter Verwendung der Extraktion Pipette. Die Shiga-Toxin-Gene stx 1 und stx 2 sind auf gemäßigten Bakteriophagen Lambda-like und defekten Bakteriophagen in diesem und anderen enterohämorrhagische E. gefunden coli-Stämme unter der Kontrolle des P R Promotors 5 6 7 8. Die Aktivierung des SOS-Reaktion in E. coli führt zur Induktion und / oder Toxinproduktion 9 Prophagen. Wir haben eine modifizierte Version des Multiplex-PCR-Assay von Feng et al genutzt werden. 11 zur Identifizierung des stx 1 und stx 2 Gene sowohl in Kultur und Spike Abwasserproben. Die Spuren A und B in 2 zeigen die Ergebnisse einer PCR-Amplifikation eines unverarbeiteten Kulturprobe (Spur A) und einer verarbeiteten Kulturprobe (Spur B). Diese Ergebnisse sind praktisch identisch Sinn gibt es keinen Verlust der Treue in der verarbeiteten oder isolierten Nukleinsäuren. Wir nächste Stachelwalze Rohabwasser (Spur D) oder isolierten Nukleinsäuren aus dotierten Abwasser (Spuren E &amp; F) verstärkt. Diese Daten zeigen, dass die isolierten Nucleinsäuren in größere Verstärkung im Vergleich zu den nicht isolierten Nukleinsäuren aus dotierten Abwasserproben geführt. Wir schließen daraus, dass entweder PCR-Inhibitoren natürlich im Abwasser nach der Isolierung vor der Aufhebung oder dass die Nukleinsäuren wurden nach der Isolierung eingeengt. Eine Kombination dieser beiden Hypothesen ist ebenfalls möglich. UV-Spektroskopie wurde als nächstes verwendet werden, um zu zeigen, dass die isolierten Nukleinsäuren relativ frei waren of Mengen an Protein. Abbildung 3 zeigt die UV-Spektren von zwei E. coli O157: H7-Nukleinsäure-Extraktionen markierten Isolierung ein und Isolierung b, im Vergleich zu der normalisierten Spektrums der Bakterienkultur, markierten prä-Isolation. Die UV-Spektren der isolierten Nukleinsäuren ähnelt der Spektren reiner Nukleinsäuren, mit einem berechneten Verhältnis der Extinktion zwischen 260 nm und 280 nm 1.8 10 nähert. Diese Daten zeigen, dass es eine sehr kleine Mengen an Protein in der Nukleinsäure-Fraktion gewonnen unter Verwendung der Technik beschrieben. Proteinisolierung: gewonnene Protein aus der Nukleinsäure / Protein Isolationsexperiment immunreaktiv ist und elektrophoretisch identisch reines Protein. Beispiel 2: Das isolierte Protein-Fraktion wurde in der RapidChek E. angewendet coli O157 Lateral-Flow-Assay-Streifen (SDIX, Inc.). Kontrollen zeigen eine positive Identifikation in allen Proben beherbergt, E. coli<html> O157, mit oder ohne STX Induktion (Abbildung 4, Spuren B bzw. C). Die Daten in Abbildung 4 zeigen auch positive Ergebnisse für die Proben, beherbergen E. coli O157, die für Nukleinsäuren und Proteine ​​dann mit der Pipette Extraktion verarbeitet wurden. Diese Daten zeigen, dass das isolierte Protein von jeder Probe immunreaktiv ist damit das Auslösen einer positiven Resonanz. PCR-Amplifikation (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde auf die Protein-Proben durchgeführt, um zu zeigen, dass das isolierte Protein-Fraktion frei von kontaminierenden Nukleinsäuren war. Die Ergebnisse für diese Experimente waren alle durch Gelelektrophorese negativ. Daraus schließen wir, dass der Proteingehalt der Probe von kontaminierenden Nukleinsäuren wurde abgetrennt. Diese Ergebnisse, im Ganzen mit denen für die Nukleinsäure-Isolierung Schritt zeigen, dass die Nukleinsäuren-und Protein-Gehalt in separaten Fraktionierung Schritte werden beschrieben isoliert genommen. t &quot;&gt; Beispiel 3:. Das isolierte Protein geeignet ist für die Elektrophorese 10 Abbildung 5 zeigt eine Coomassie gefärbt 8% Acrylamid-Gel mit BSA (5, Spuren A und C) und BSA geladen aus 6 M Guanidin-Isothiocyanat-Extraktion unter Verwendung der Pipette und zugehörigen isoliert Protokoll. Die elektrophoretische Mobilität des isolierten Proteins ist identisch mit der Kontrollproben. Wir schließen daraus, dass das Extraktionsverfahren ändert nichts an der kovalenten Struktur des isolierten Proteins. <img alt="Abbildung 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Abbildung 1, Teil A: Darstellung eines typischen Nukleinsäure Extraktionsverfahren Die Probe wird mit 6 M Guanidin-Thiocyanat in das Probenröhrchen vermischt und in den Sorbens fünfmal.. Nach dem letzten Durchgang, wird die Probe auf der Protein-Puffer zugegeben. Die Sorptionsmittel und gebundenen Nukleinsäuren werden zweimal mit Ethanol gewaschen. Die Probe wird dann Luft dRied und eluiert aus dem Sorbens. <img alt="Abbildung 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Abbildung 1, Teil B: Darstellung eines typischen Protein-Extraktions-Verfahren wird die Probe mit Proteinisolierung Puffer aus Schritt 1, Abbildung 1, Abbildung A über das Sorbens von einer zweiten Extraktion Pipette 15 Mal übergeben wird gemischt.. Der Rest des Verfahrens ist identisch mit der Nukleinsäure-Extraktion-Protokoll. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> 2:. Negatives Bild eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel Multiplexsignal Shiga-Toxin 1 und 2-Gen-Amplifikation wurde unter Verwendung Kulturproben (Bahnen A und B) oder Rohabwasser Proben mit E. versetzt coli O157: H7 (Spuren D, E und F). Die Proben wurden entweder direkt an ein PCR-Gefäß (Bahnen A und D) oder den Proben zugegeben wurden unter Verwendung der Isolation-Verarbeis und die extrahierten Nukleinsäuren wurden zur PCR-Reaktionsgefäß (Proben B, E und F) zugegeben. Das PCR-Protokoll ist eine Modifikation des einen von Feng et al 11 beschrieben. Unsere Modifikation nur die von der STX-1 (unteres Band) und stx 2 (oberes Band) Primerpaare amplifiziert gezielten Ausstieg aus alle anderen Primerpaare. Lane C ist die 1 Kb Leiter von BioRad. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Abbildung 3: UV-Spektroskopie Ergebnisse von E. coli O157: H7 Nukleinsäuren isoliert mit der Extraktion berichtet Pipette Die isolierten Nukleinsäuren markiert sind, eine Trennung und Isolation. b. Das UV-Spektrum der Probe wurde auch vor Nukleinsäureextraktion getestet und markierten prä-Isolation. Die Spektren wurden unter Verwendung eines Hitachi U3010 Spektrophotometer und der zugehörigen Software-Paket. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt;. Abbildung 4: Farbfoto von RapidChek Teststreifen Der Proteingehalt der Proben in Abbildung 2 verwendet wurde unter Verwendung des Pipetten-Extraktion und getestet für Immun-Reaktivität von Lateral-Flow-Assay. AC Lanes sind unverarbeitete Kontrollen, das heißt, Zellkultur wird auf den Teststreifen wurde ohne Nukleinsäure oder ein Protein Extraktion zugegeben. Ein Lane ist E. coli BL21 DE3 pLysS als negative Kontrolle, Spuren B und C zeigen, E. coli O157: H7, die unbehandelt (B) oder mit Mitomycin C für 4 Stunden (C) behandelt worden war. Lanes D bis H zeigen die Ergebnisse der Addition der extrahierten Proteins auf die Lateral-Flow-Teststreifen. Lanes D und E wurden sondiert mit Proteinextrakt aus E. coli BL21 DE3 pLysS entweder ohne (D) oder mit Mitomycin C behandelt (E) als negative Kontrollen. Lanes FH zeigen die Ergebnisse, wenn das extrahierte Protein aus E. coli O157: H7 verwendet. Das Protein wurde von unbehandelten (F), oder 2 Stunde (G) oder 4 Stunden (H) Mitomycin C behandelten Kulturen extrahiert.Positive Ergebnisse produzieren eine doppelte rote Linie. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Bild 5:. Fotografie eines mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE BSA wurde von der Lösung unter Verwendung der Extraktion Pipette und beschriebenen Protokollen isoliert. Lanes A und C sind Kontrollbahnen von 250 ug / ml und 500 pg / ml. Spuren B und D zeigen gewonnen BSA aus Lösungen, die die gleichen Konzentrationen wie ihre jeweiligen Steuerelemente.

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Ein Gerät mit Chemikalien werden beschrieben, um sequentiell Isolierung von Nukleinsäuren durch Proteine ​​aus einer Probe ohne Einsatz von Elektrizität an. Das Werkzeug besteht aus einem Sorptionsmittel innerhalb einer Transferpipette gehalten, während die Isolation Chemie auf Festphasenextraktion Prinzipien beruhen. Die isolierten Makromoleküle durch Immun-basierten und PCR-basierten Assays analysiert werden.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Aufrufe.  CUBRC, Inc.. Ein Gerät mit Chemikalien werden beschrieben, um sequentiell Isolierung von Nukleinsäuren durch Proteine ​​aus einer Probe ohne Einsatz von Elektrizität an. Das Werkzeug besteht aus einem Sorptionsmittel innerhalb einer Transferpipette gehalten, während die Isolation Chemie auf Festphasenextraktion Prinzipien beruhen. Die isolierten Makromoleküle durch Immun-basierten und PCR-basierten Assays analysiert werden.

Serie: Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...