Wir möchten, dass Mohammad Saleem, Jing Wu und Krishnan Raghunathan für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch Priya Begani für die Unterstützung während der Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von National Institutes of Health gewährt R01 AI071727 (AO) und R01 GM110052 (SLV) unterstützt.

Tag 1: Expression von Gag - Proteinen Mit dem Weizenkeim - Lysat-basierten In - vitro - Transkriptions-Translations - System 1. Herstellung von HIV-1 Gag <ol><li> Entfernen Sie alle Reagenzien des kommerziellen Weizenkeim CECF Kit von Gefrierschränken (Weizenkeim Lysate bei -80 ° C gelagert werden, andere Reagenzien bei -20 ° C). Tauen Sie sie auf Eis und mischen Sie die Komponenten wie in Tabelle 1 gezeigt. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (Feeding mix) </td><td></td></tr><tr><td> Feeding-Lösung </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Aminosäuren </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> Methionine </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 1000 ul </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix-2 (Lysate mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> wheatgerm Lysate </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNase freies Wasser </td><td> 7 ul </td></tr><tr><td> Aminosäuren </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Methionine </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Plasmid DNA in TE-Puffer (1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Reaktionspuffer </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammensetzungen von Mischungen für Weizenkeim Reaktionen erforderlich. Hinweis: Wenn das Experiment entwickelt, um die Wirkung von RNA-Entfernung durch RNase auf Gag Membranbindung, ersetzen Ribonuklease-Inhibitoren mit RNase-freiem Wasser zu untersuchen. Plasmid DNA sollte entsprechend den Anweisungen des Herstellers frei von Verunreinigungen sein. Jedoch plasmids hergestellt unter Verwendung konventioneller, aber nicht Endotoxin-frei, Plasmidisolation Kits erfolgreich eingesetzt wurden. Die Anweisungen des Herstellers empfiehlt auch DNA in Nuklease-freies Wasser gelöst werden. Bei der Verwendung von DNA in TE suspendiert [10 mM Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1 mM EDTA], vermeiden niedrigere Konzentrationen von DNA verwendet, da EDTA in TE die Ausbeute auswirken kann. Plasmide, in TE-Puffer 0,8-1 ug / ul in einem Konzentrationsbereich von erfolgreich verwendet worden sind, gelöst. <ol start="2"><li> Zuerst fügen Sie die Futtermischung (Mix-1) in die Reaktionskassette (transparente Kammer). Dann fügen Sie das Lysat (Mix-2) in die andere Kammer (rot). Führen Sie keine Blasen, während die Gemische in ihre jeweiligen Kammern Zugabe, da diese zu einer ineffizienten Austausch von Lösungskomponenten führen kann und damit die Effizienz der Reaktion zu verringern. </li><li> Decken Sie die Kammern mit der Klebefolie mit dem Kit zur Verfügung gestellt. </li><li> Legen Sie die Reaktionskassette in den Kassettenhalter und Incubate die Baugruppe für 24 h bei 24 ºC bei einer konstanten Schüttelgeschwindigkeit von 900 Upm in einer Eppendorf-Thermomixer R. </li></ol> Tag 2: Bereiten Sie GUVs von Elektroformation und Ernte Weizenkeim Lysate 2. Herstellung von GUVs <ol><li> Aliquotieren Lipide in anorganischen Lösungsmitteln gelöst, wie Chloroform oder Mischungen aus Chloroform und Methanol in Glasfläschchen mit Schraubverschluss ausgekleidet mit Teflon-Liner und mit Parafilm umwickelt. Griff Lipide mit Hamilton-Typ Glasspritzen, oder falls vorhanden, Chloroform beständige Kunststoffspitzen. Nehmen Glasphiolen die Lipide enthalten, für GUV Zubereitung aus der -20 ºC Gefrierschrank verwendet werden. <ol><li> Sobald die Fläschchen auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht werden, stellen Sie sicher durch visuelle Inspektion, die die Lipidsuspensionen klar sind. Die Qualität von Lipiden, insbesondere saure Lipide wie Palmitoyl-Oleoyl Phosphatidylserin (POPS) und PI (4,5) P 2, ist wichtig für die erfolgreiche Experimente. Verwenden Sie keine Lipide, die sindin Aliquots für länger als 2 Monate. </li></ol></li><li> Vorwärmen einen Wärmeblock auf die gewünschte Temperatur. Diese Temperatur muß mindestens 5 ºC höher ist als die Schmelztemperatur (T m) des Lipid (e) mit der höchsten T m liegen. </li><li> Berechne die Lipidmengen benötigt entsprechend den gewünschten molaren Lipid-Verhältnissen. Für das Studium hier HIV-1 Gag Bindung, verwenden Sie die folgenden Molverhältnisse wie in Tabelle 2 dargestellt. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lipid - Mix </td><td> Molverhältnis </td><td> Volumen (in ul) </td><td> Auf Konzentration </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; + 20 + 40 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8.3 + 6.25 + 58.19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P 2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Volumina verschiedener Lipide GUVs zu erhalten. <ol start="4"><li> Fügen Sie die gewünschten Mengen von Lipiden in einem sauberen Schraubdeckelröhrchen Glasfläschchen. </li><li> Verwendung ITO-beschichtete Objektträger mit den Abmessungen 25 x 50 x 1,1 mm 3 und Widerstand 70-100 Ω (wie im Katalog beschrieben). Legen Sie zwei ITO-beschichtete Folien auf eine saubere Bank. Jeder Elektroformation Kammer erfordert zwei Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasplättchen. Stellen Sie sicher, dass die leitende Seite des Glasobjektträger wird durch Prüfen der Widerstand mit einem Multimeter nach oben zeigen. Es sollte einen Wert von ca. 200 Ω zeigen. Achten Sie darauf, die Oberfläche der Folien sauber sind, indem sie mit 70% Ethanol mit fusselfreien Tüchern sanft abwischen. </li><li> Reinigen der Außenfläche einer Nadel einer Spritze durch rinsing es mit Chloroform und legen Sie die Spritze auf dem Wärmeblock. </li><li> Legen Sie eine neue ITO-beschichtete Glasobjektträger auf dem Wärmeblock mit leitenden Seite nach oben und lassen Sie es auf die gewünschte Temperatur in der Regel ca. 2-3 min äquilibrieren. Nicht über die ITO-beschichtete Glasobjektträger für ein potentielles Risiko wiederzuverwenden, dass die ITO-Schicht auf den Glasobjektträger können bei Reinigungsverfahren beschädigt werden. </li><li> Verwenden Sie ein Volumen von 40 bis 50 &amp; mgr; l der Lipidmischung für jede Folie für eine einheitliche und dennoch schnelle Ausbreitung der Lipide auf dem Glasträger. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform. <ol><li> Legen Sie eine Hälfte des Gesamtvolumens der Lipidmischung auf dem Glasträger und sofort die Lipid verteilt die gereinigte Spritze (Schritt 2.6) ein einheitliches Lipidfilm zu verlassen (Bewegen der Nadel 2-3 mal in der Folie). Verbreiten Sie den Lipidfilm sanft (aber schnell) eine Beschädigung der dünnen ITO-Beschichtung zu vermeiden. Uneinheitliche Verbreitung oder grobe Verbreitung zu suboptimalen führen kannErträge oder Rechen Heterogenität der GUVs. </li><li> Daher gewährleisten gleichmäßige Verteilung durch die Lipidfilm nach Ausbreitung kontrollieren, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. Wenn die Trübung der Folie übermäßig ungleichmäßige erscheint, wiederholen Sie die Prozedur eine neue Folie verwendet wird. </li></ol></li><li> Legen Sie die beschichteten Objektträger in einer Petrischale mit der beschichteten Seite nach oben zeigt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,6-2,9 für den Rest der Mischung eine andere ITO-beschichteten Objektträger verwendet wird. </li><li> Legen Sie die Petrischale, die sowohl die Folien in einem herkömmlichen Vakuumtrocknungskammer für 60-90 min zu entfernen jede Spur von organischen Lösungsmitteln. </li><li> Während dieses Prozesses, stellen Sie den Inkubator auf die gleiche Temperatur wie die des Wärmeblock (65 ºC in den meisten Fällen) und vorwärmen 300 mM Saccharose-Lösung in den Inkubator. </li><li> Nach dem Trocknen bringen die Petrischale auf die Bank und legen Sie den Glasobjektträger auf eine saubere Oberfläche. </li><li> Reinigen Sie vorsichtig mit einem PDMS - Dichtung (Abbildung 1) unter Verwendung von 70% igem Ethanol und trocken es compledig. </li><li> Legen Sie sie auf die Lipid - beschichteten Glasobjektträger , wie in Abbildung 1 gezeigt und sanft und fest drücken , so dass die Dichtung bildet eine wasserdichte Abdichtung. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Lücken zwischen der PDMS-Dichtung und der Folie. Dies resultiert in der Bildung einer flachen Kammer, die das Sucrose-Lösung hält. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Abb . 1: Das Layout der ITO-beschichtete Glasobjektträger für Elektroformation verwendet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="16"><li> Füllen Sie die Kammer mit vorgewärmten Saccharoselösung ohne Blasen. </li><li> Legen Sie die andere beschichtete Folie auf oben, um eine dichte Abdichtung zu machen. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen gibt. Die Endmontage sollte wie folgt aussehen in Abbildung 2. Befestigen Sie die Kammer using Bindemittel-Clips. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Schematische Darstellung der Elektroformation Kammer (Seitenansicht) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="18"><li> Entfernen Sie überschüssige Saccharose durch Absaugen und Reinigen Sie die Folien mit fusselfreien Tüchern. Befestigen Sie die Folien an die Kupferschiene, so dass die leitenden Seiten in gleichmäßigen Kontakt mit der Bar sind. Stellen Sie sicher, dass nur eine leitfähige Seite des Glasobjektträger in Kontakt mit einem Kupferstab ist. </li><li> Verbinden Sie die Kupferschiene an den Funktionsgenerator Ausgang die Krokodilklemmen mit. Platzieren Sie die Baugruppe im Inneren des Inkubators die Montage zu ermöglichen, auf die gewünschte Temperatur äquilibrieren. </li><li> Anwenden eines Sinuswellenfrequenz von 10 Hz und einer Potentialdifferenz von 1 V für 90 min. Ensure , die die Spannung V 1 mit einem Multimeter ist wie in Figur 3 gezeigt. Fortsetzung des Prozesses für 90 min. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Die Positionen , an denen die Elektroden vom Multimeter zur Messung von Frequenz und Strom gesetzt werden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="21"><li> Nach 90 min, langsam verringern die Frequenz 2 Hz und weiter Elektroformation für weitere 10 min. Während dieser Zeit der Ernte in vitro - Translationsreaktionen (Schritte 3,1-3,2). </li><li> Schalten Sie den Funktionsgenerator aus und lassen Sie die Baugruppe abkühlen langsam auf Raumtemperatur (durch den Inkubator Abschalten und Verlassen der Inkubator Tür leicht geöffnet). </li><li> Nach dem Abkühlen ziehen Sie die Kabel an den Generatorvon den Ausziehschienen. GUVs kann sehr zerbrechlich sein und müssen daher sehr vorsichtig behandelt werden. bringen Sie vorsichtig die Montage auf der Bank. </li><li> Bauen Sie die Kammer, indem Sie vorsichtig die obere Rutsche mit einer Pinzette entfernen. Ernten Sie die Saccharose enthaltende Suspension GUVs mit einem Schnitt 1.000 ul Spitze und den Transfer in ein sauberes Röhrchen. Behandeln Sie das Rohr vorsichtig Unterbrechung der GUVs zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie die GUVs sofort. GUVs sind für mindestens 90 min nach der Ernte stabil, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert. </li></ol> 3. Ernte In - vitro - Translationsreaktionen <ol><li> Ernte der in vitro - Translationsreaktionen enthält gewünschten Proteine ​​aus dem roten Kammer einer Mikropipette in ein Rohr verwendet wird . </li><li> Um aggregierte Proteine ​​zu entfernen, drehen Sie die Lysate bei 16.200 × g für 15 min auf einer Tischzentrifuge und vorsichtig den Überstand in ein anderes Röhrchen übertragen. </li></ol> 4. GUV-Bindungsassay <ol><li> Unter Anwendung eines Cut Spitze, mischen 51; l von in vitro Reaktionen Übersetzung übersetzt Proteine ​​und 5 ul GUVs in einem Rohr und inkubiere bei Raumtemperatur für 2-3 min enthält. </li><li> Bringen Sie ein PDMS Blatt mit einem kleinen Loch (3-4 mm Durchmesser) auf einem sauberen Deckglas und gewährleisten dichte Abdichtung durch sanft und fest gegen die Deck drücken. </li><li> Legen Sie die 10 &amp; mgr; l Mischung aus Schritt 4.1 in das kleine Loch. </li><li> Bild das Gemisch unter einem inversen epi- oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur. Hinweis: Um die Verdampfung zu verhindern, kann die Bilderzeugungsraum durch eine Deckglas abgedeckt. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. 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We declare that we have no conflicting interests.

Der GUV-Bindungstest, wie oben beschrieben stellt eine gute Alternative in Szenarien, in denen andere Protein-Lipid-Interaktion Tests haben ihre Grenzen. Dieser Test ermöglicht es uns, mit nativen Länge Acylketten in der Lipiddoppelschicht Kontext und zwar ohne langwierige Flotation Zentrifugation durch mit hoher Dichte Saccharosegradienten oder andere post-Bindung Verarbeitung von Gag-Lipid-Wechselwirkungen zwischen myristoylierten voller Länge Gag und saure Lipide zu untersuchen Komplexe. Ein weiterer Vorteil ist , dass das Verhalten von Gag kann in einer komplexen Mischung (beispielsweise in Gegenwart von cytosolischen Komponenten) untersucht werden, die nicht ohne weiteres in anderen Echtzeit - Techniken wie Oberflächenplasmonresonanz basierenden Assays erreicht wird. Daher kann man argumentieren, dass die hier beschriebenen Test Echtzeit-Beurteilung von Gag-sauren Lipid-Wechselwirkungen in einem nativen Kontext als andere Assays auf dem Gebiet verwendet werden können. Jedoch gibt es Beschränkungen bei dem Verfahren zugeordnet sind, wieGut. Um sicherzustellen , dass GUVs in einer gegebenen Zubereitung haben ähnliche Zusammensetzung zueinander und zu der ursprünglichen Mischung, Elektroformation muß deutlich oberhalb der Übergangstemperatur der Lipide durchgeführt werden, die die höchste Übergangstemperatur in der Mischung vorhanden 25,26 aufweisen. Es ist jedoch möglich , dass die Exposition von Lipiden zu höheren Temperaturen für längere Zeit zu Lipid Bruchs 25,27 führen kann. Daher ist die Qualität der GUVs zu steuern, zusätzlich zur visuellen Inspektion durch den Einschluss von fluoreszierendem Lipid Farbstoffe aktiviert (zB, DID), ist es wünschenswert , die Funktionalität des Lipids von Interesse zu testen [zB PI (4,5) P 2 ] unter Verwendung einer Lipid-spezifischen Sonde. Zusätzlich mit GUV Zusammensetzungen, die Anlass geben Trennung bei einer bestimmten Temperatur zu Phase ist darauf zu genau getroffen werden, um eine gewünschte Temperatur aufrechtzuerhalten, wenn das Protein-GUV Interaktion beobachtet wird. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass Lösungen von höherer Ionenstärke sind inkompatibel mit der elektroBildung hier beschriebene Protokoll und daher GUVs werden in 300 mM Saccharose - Lösung 26 gezüchtet und gehalten. Bemerkenswerterweise jedoch haben einige Studien erfolgreich Puffer bei einem physiologischen Ionenstärke in ihrer modifizierten Elektroformation verwendeten Protokolle 28. Ein kritischer Aspekt ist die Menge an Gag. Ein Kaninchen-Retikulozyten-Lysat-basierten System wird häufig zur Herstellung von full-length HIV-1 Gag in Liposom Flotation Assays verwendet. Jedoch war die Menge an YFP-markierten Volllängen-Gag in diesem System erhalten unzureichend zur Visualisierung von Gag-Bindung an GUVs. Um dieses Problem anzugehen, das Weizenkeim-Lysat basierenden zellfreien Transkriptions-Translations-System, das etwa 8-10 fach höhere Menge an Gag ergibt, wurde in der aktuellen Test verwendet. wenn GUV Bindungsexperimente müssen jedoch in Abwesenheit von eukaryotischen Zell-Lysat-Komponenten durchgeführt werden, kann man gereinigte Proteine ​​verwenden, um mit einem Fluorophor markiert, wie vor kurzem gemacht wurde (nachstehend beschrieben). Es hat sich gezeigt , daß spezifische und effiziente Bindung von Gag an Membranen ein kooperatives Verfahren durch verschiedene Faktoren wie Myristat, RNA, Lipid - Kopfgruppen und Acylketten und Gag-Gag - Wechselwirkungen ( beschrieben in Referenz 29) geregelt wird. Die in - vitro - System beschreiben hier kann erweitert werden , um die Rolle von Faktoren einzeln oder in Kombination zu adressieren , die Reihenfolge der Ereignisse im kooperativen Prozess der Gag Membranbindung zu verstehen. Bisher ist der beschriebene Assay - System eine unerwartete Rolle von ungesättigten PI (4,5) P 2 Acylketten aufgeklärt von Gag in Bindungs ​​aber nicht die eines kanonischen Säugerzell-origin PI (4,5) P 2 -bindenden Domäne ( die pleckstrin Homologie - Domäne von Phospholipase C Delta 1) 24, eine Erkenntnis , die nicht durch Liposom Flotation Assays offenbart hatte. GUV-basierte Assaysysteme sind auch verwendet worden andere Aspekte der Biologie Gag zu verstehen. Mit einem Gag-Derivat ein künstliches induzierbaren multim enthältmerisation auslösen Motiv und GUVs mit Floß artigen und nicht-Floß ähnlichen Domänen, Keller et al. untersuchten die Beziehung zwischen Gag Partitionierung &quot;Floß-like &#39;Domains und Multimerisierung 30. Eine Studie von Carlson et al. Hat die GUV - System und gereinigt und fluoreszenzmarkierte Gag verwendet , um die Reihenfolge der Rekrutierung verschiedener endosomaler Sortierkomplexe für Transport (ESCRT) Proteine ​​, die durch membrangebundenen Gag 31 erforderlich zu verstehen. Vor kurzem berichteten andere Studie Rekonstitution des Gag-induzierte Vesikel Knospungsvorgang auf dem GUV Gag mit einem Fluorophor 32 konjugiert werden. HIV-1 Gag Multimerisierung führt zur Bildung von submembrane Gag Gitter daß die Membranen während der Montage zu krümmen gedacht wird. Daher kann mit einer weiteren Verbesserung in Gag-GUV Assaysysteme, die Beziehung zwischen Membran Krümmungsänderungen und Gag Membranbindungs, die wohl am wenigsten gut verstanden Aspekt HIV Montage kann fo wie getan wird analysiert werdenr andere zelluläre Krümmung empfindliche Proteine ​​33. Zusammengefasst dieses Protokoll verwenden, kann man ausreichende Mengen an myristoyliert voller Länge Gag erhalten und zu visualisieren Gag GUV Membranen binden. Dieses Protokoll kann ferner verschiedene Stadien der HIV-1 Montage und Knospung Prozesse zu untersuchen entwickelt werden.

Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) ist ein umhülltes Virus, das an und Knospen aus der Plasmamembran (PM) in den meisten Zelltypen assembliert. Die Montage von HIV-1 - Viruspartikel wird durch das 55 kDa viralen Kernprotein genannt Pr55 Gag (gag) angetrieben. Gag wird als ein Vorläufer-Polyproteins synthetisiert besteht aus vier Hauptstrukturdomänen, nämlich, matrix, Capsid, Nucleocapsid und p6 sowie zwei Distanz Peptide SP1 und SP2. Bei der Montage ist die Matrix (MA) Domäne verantwortlich für die Ausrichtung der Gag an den Montageort, das Kapsid (CA) Domäne Gag-Gag-Interaktionen vermittelt, rekrutiert der Nucleocapsid (NC) Domäne virale genomische RNA und p6 Rekruten Wirtsfaktoren, dass die Hilfe Viruspartikel scission aus der Plasmamembran. Gag erfährt auch eine co-translationale Modifikation durch die Zugabe einer 14-Kohlenstoff-Fettsäure oder Myristat-Rest an seinem N-Terminus. Membranbindung von Gag ist eine wesentliche Voraussetzung für die virale Montage, da mutants, die defekt in der Membran sind verbindlich versagen Viruspartikel zu erzeugen. Wir und andere haben gezeigt, dass die Membranbindung von Gag dargestellt durch bipartite Signale innerhalb der MA-Domäne vermittelt wird: die N-terminalen Myristat-Einheit, die mit der Lipid-Doppelschicht und einem Cluster basischer Reste innerhalb der MA-Domäne bezeichnet als stark basische Region hydrophober Wechselwirkungen vermittelt ( HBR) , die mit sauren Lipiden auf der PM 1-4 zusammenwirkt. Studien der Gag-Membran - Wechselwirkungen unter Verwendung ektopische Expression von Polyphosphoinositid 5-phosphatase IV (5ptaseIV), ein Enzym, das die Hydrolyse von PM-spezifische saure Phospholipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] katalysiert zu Phosphatidylinositol-4-phosphat, schlug in Zellen , die Gag-PM Lokalisierung von PI (4,5) P 2 3,5 vermittelt wird. Jedoch, mit dem Ziel in - vitro - Studien auf das Verständnis mehr mechanistischen Details Gag-PI (4,5) P 2 Wechselwirkungen haben bewiesen , für eine Reihe von Gründen in Frage zu stellen. FürBeispiel Reinigung von voller Länge myristoyliert HIV-1 Gag für biochemische Experimente hat sich zumindest teilweise aufgrund der Tendenz von Gag technisch schwierig während der Reinigung zu aggregieren. Daher verkürzte Formen von HIV-1 Gag, wie Myr-MA oder Myr-MA-CA, oder das nicht-myristoylierten Form häufig in Untersuchungen verwendet wurden , die Gag - Reinigung ( zum Beispiel Kernspinresonanz, Protein footprinting erfordern und Oberflächen Plasmonresonanz 6-9). Alternativ gekoppelt ist , in vitro Transkriptions-Translations - Reaktionen verwendet wurden , 1,2 voller Länge myristoyliert HIV-1 Gag in andere biochemische Studien herzustellen. Typischerweise in diesem System wird ein Gag-kodierenden Plasmid wird mit eukaryotische Zelllysate (zB Kaninchen - Retikulozyten - Lysaten) , die frei von jeglicher Zellmembranen und messenger RNAs transkribiert und translatiert , sondern die Maschinen für die Transkription und Translation enthalten. Nach der Reaktion enthält Gag Zelllysate werden bei mir gemischtmbranes zur Analyse von Gag Wechselwirkungen mit Lipiden. Zusätzlich zu der Leichtigkeit , mit voller Länge zur Herstellung myristoyliert Gag, Methoden der in vitro Transkriptions - Translations - System verwenden , haben den Vorteil , dass Gag - Synthese und nachfolgende Membranbindungsreaktionen in einem &quot;eukaryotischen Cytosol-like &#39;Milieu auftreten , die eine bessere physiologische Bedingungen darstellen. Diese Eigenschaft trug den Studien zu , die zeigten , dass RNA - Moleküle an die MA - Domäne gebunden regulieren Gag in kompetitiver Weise 1,2,10-12 zu saure Lipide zu binden. Da jedoch in diesen Zellysaten die Gesamtmenge der Gag-Proteine ​​erhalten werden, nicht hoch ist, ist die metabolische Markierung von Proteinen mit radiomarkierten Aminosäuren für deren Nachweis notwendig. Je nach Methode Gag-Lipid-Wechselwirkungen zu messen, eine Vielzahl von Membranpräparationen verwendet wurden. Jede dieser Methoden hat ihre Stärken und Schwächen. Die meisten NMR-basierte Assays erfordern die Verwendung von Lipiden mit kurzen acylKetten , die wasserlösliche (zB C4- und C8-PI (4,5) P 2) 6,8 sind. Während NMR Methoden Bindung von Gag zu den Lipiden zu testen , die in Zellen gefunden langen Acylketten aufweisen entwickelt werden, haben sie bisher nur mit 8,13 myristoylierten oder nonmyristoylated MA verwendet. Alternativ Liposomen aus Lipiden , die native Länge Acylketten haben wurden in biochemischen Methoden wie Liposomen Flotation oder fluoreszierende Liposom Perle Bindungsassays 2,3,10,14-16 verwendet. Jedoch in diesen Assays verwendeten Liposomen haben kleine Durchmesser, und somit deren Membranen haben steile und positive Krümmungen. Im Gegensatz dazu ist während der frühen Phase der Partikelanordnung in HIV-1-infizierten Zellen bindet Gag an die PM, die nahezu auf der Skala von Gag planar und induziert anschließend negative Krümmung während Knospung. Daher Liposomenmembranen mit steilen und positive Krümmung vielleicht nicht ideal Lipid-Doppelschichten zu Gag-Lipid-Wechselwirkungen untersuchen. Wie für Liposom flichtation Assays ist eine weitere mögliche Einschränkung, dass die Exposition von Gag-Lipid-Komplexen zu hypertonischen Saccharosegradienten während der Zentrifugation die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können. Um diese Einschränkungen zu mildern und ein komplementäres experimentelles System bereitstellen, Assays für die Bindung an Gag giant unilamellaren Vesikeln (GUV), wurden in den letzten Jahren entwickelt. GUVs sind einzelne Lipid-Doppelschicht-Vesikel, deren Durchmesser erstrecken sich bis zu mehreren zehn Mikrometern. Somit gleicht die Krümmung dieser Membranen der PM auf der Skala von Gag. Außerdem ist es aufgrund seiner großen Größe, die unter optischen Mikroskopen Sichtprüfung ermöglicht, Binde- Membran von fluoreszenz getaggt oder markiert Gag-Proteine ​​dieser Vesikel beim Mischen kann leicht ohne nachfolgende Verarbeitung Gag-Lipid-Komplexe bestimmt werden. Wir beschreiben hier ein Protokoll HIV-1 Gag Membran zu untersuchen Bindung mit GUVs von einem Elektroformation Verfahren erhalten. Verschiedene Methoden wie sanfte Feuchtigkeit, Gel-unterstützte Trink, microfluidic Jetting und Elektroformation 17-22 wurden verwendet GUVs zu erhalten. Für das hier beschriebene Protokoll wird die Elektroformation Verfahren in erster Linie wegen seiner Effizienz bei der Bildung GUVs mit sauren Lipiden und seine relative Einfachheit der Verwendung, ohne die Notwendigkeit von teuren Aufbauten verwendet. Da die Visualisierung von Gag ein fluoreszierendes Reporter erfordert, ist genetisch gelb fluoreszierendes Protein (YFP) an den C-Terminus von Gag (Gag-YFP) zugegeben. Gag-YFP Proteine ​​werden durch in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen in wheat germ Lysaten erhalten auf der Basis der kontinuierlichen Austausch kontinuierlichen Strömung (CECF) Technologie. In dieser Technologie wird sowohl die Entfernung von inhibitorischen Nebenprodukte der Reaktionen und Zufuhr von Reaktionssubstraten und Energiekomponenten sind in einer Dialysebasierten Mechanismus erreicht. Bei diesen Reaktionen wird ein Plasmid, kodierend Gag-YFP unter der Kontrolle eines T7-Promotors verwendet. Bemerkenswert ist , wie bereits gezeigt, Weizenkeim Lysaten unterstützen Myristoylation ohne zusätzliche Komponenten 23,24. Myristoyliert Gag-YFP zur Visualisierung von Gag auf GUV Membranen 24 Mit dieser Methode war es möglich , ausreichende Mengen an in voller Länge zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll , mit dem HIV-1 Gag zu PI - Bindung (4,5) P 2 -haltigen GUV Membranen können ohne langwierige nachfolgende Verarbeitung folgende Bindungsreaktionen untersucht und schlagen vor , dass diese Methode bereits existierenden Gag-Membran - Bindungstests ergänzt und kann sein erweitert, um weitere Bindung HIV-1 Gag-Membran zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Meterman</td>
			<td>30XR</td>
			<td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Instek</td>
			<td>GFG-8216A</td>
			<td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO</td>
			<td>CG-90IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>21516-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80400</td>
			<td>Gauge 22S, Syringe number 702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td>
			<td>Sylgard, 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td>
			<td>BiotechRabbit, 
			Berlin, Germany</td>
			<td>BR1401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&#160;</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700041P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-PI(4,5)P2&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

Das Strukturprotein von HIV-1, Pr55 Gag (oder Gag), bindet an die Plasmamembran in Zellen während der Virus - Montageprozesses. Membranbindung von Gag ist ein wesentlicher Schritt für die Viruspartikelbildung, da ein Defekt in Gag Membranbindungs ​​führt zu einer starken Beeinträchtigung der viralen Partikelproduktion. Zu gewinnen sind mechanistischen Details Gag-Lipid - Membran - Wechselwirkungen in vitro - Verfahren basiert auf NMR, Protein Fußabdrucks, Oberflächen - Plasmonresonanz, Liposom - Flotation Zentrifugation oder Fluoreszenz Lipid Wulst Bindung so weit entwickelt. Jedoch jede dieser in - vitro - Verfahren hat seine Grenzen. Um einige dieser Beschränkungen und bieten einen komplementären Ansatz zu den bisher etablierten Methoden zu überwinden, entwickelten wir ein in - vitro - Test , bei dem Interaktionen zwischen HIV-1 Gag und Lipidmembranen finden in einem &quot;zellähnlichen&quot; Umfeld. In diesem Test wird die Bindung an Gag Lipidmembranen visuell analysiert YFP-Tagged Gag in einem Weizen synthetisierten Keim-basierten in vitro - Translationssystem und GUVs durch eine Elektroformation Technik hergestellt. Hier beschreiben wir den Hintergrund und die Protokolle myristoylierten voller Länge Gag Proteinen und GUV Membranen, die für den Assay zu erhalten, und Gag-GUV Bindung durch Mikroskopie zu detektieren.

<html> Unter Verwendung des obigen Protokolls stellten wir GUVs bestehend aus POPC + POPS + Chol (Molverhältnis: 4,66: 2,33: 3). Diese Zusammensetzung wurde auf etwa reflektieren die PS und Cholesterin Konzentrationen des PM ausgewählt. Robuste und effiziente Bindung von Gag wurde nur beobachtet , wenn Gehirn-PI (4,5) P 2 in die POPC + POPS + Chol - Gemisch (POPC + POPS + Chol + brain-PI (4,5) P 2 [Molverhältnis eingeschlossen wurde : 4: 2: 3: 1] in diesem Beispiel) (Abbildung 4, Tafeln B und D mit A und C) zu vergleichen. Gag-YFP zu GUVs Bindung bestehend aus POPC + POPS + Chol + brain-PI (4,5) P 2 durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität auf der Membranoberfläche zu erkennen ist. Dieser Anstieg kann auch in der Fluoreszenzintensitätsprofile (4, unten) , die entlang der Linie Überqueren der Grenze GUV (XX &#39;in ​​4C und D) zu sehen ist. Last / 54293 / 54293fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4: Gag bindet an Gehirn-PI (4,5) P 2 -contianing GUVs Konfokales Querschnitt POPC + POPS + Chol (A und C) und POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P 2. GUVs (B und D). Aufteilung der Gag-YFP ist in grün dargestellt. Vergrößerte Bilder der ausgewählten GUVs (gelbe Kästen) sind in Platten C und D. Die Fluoreszenzintensität Profile gezeigt zufällig ausgewählten Linien gezeichnet entlang, um die entgegengesetzten Seiten des GUVs (X zu X &#39;) kreuzen werden unter den Bildern gezeigt. Bar = 5 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K Aufrufe.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

Serie: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.