Name: three-dimensional culture assay to explore cancer cell invasiveness and satellite tumor formation
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation at JoVE.com

Work partially funded by Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 to SG and CJD) and the Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 to SG). We would like to thank Dr. Richard Poulin for editorial assistance and Mrs. Chanel Dupont for technical assistance.

HINWEIS: Keine Ethik Betracht, da tierische und menschliche Krebszellen erworben wurden oder uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt. 1. Erstellen Collagen Stecker (Pseudo-Primärtumor) <ol><li> Bereiten Sie eine Kollagen-Dispersion. Typ I aus Rattenschwanzsehnen (RTT) Kollagen kann entweder extrahiert und sterilisiert werden , wie zuvor 17 berichtet, oder gekauft haben . Disperse gefriergetrocknet RTT Kollagen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N Essigsäure) mit einem Mixer (High-Speed-Einstellung, fünf 2 min läuft) für eine gleichmäßige Durchmischung. </li><li> Harvest (Trypsin-EDTA, in der Regel) und verwenden Trypanblau-Ausschluss für das Zählen lebender Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Stellen Sie die gewünschte Zelldichte (5 x 10 4 Zellen pro Stecker). </li><li> Bereiten Sie alle Lösungen (NaOH, fötale Rinderserum, DMEM 5x, NaHCO 3) getrennt (Tabelle 1) unter sterilen Bedingungen und gekühlt auf Eis halten. Anmerkung: Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Lösungen wichtig ist osmotischen Schocks oder saure in Zellen zu verhindern. </li><li> Führen Zelldispersion (1,25 x 10 &amp; sup6 ; Zellen) in die endgültige Kollagenlösung (5 ml) so schnell wie möglich. Gut mischen (durch Pipettieren oben und unten), während Luftblasen zu vermeiden, und dann verteilen schnell 200 ul der ready-to-use-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. schlagen Sie vorsichtig die Multi-Well-Platte auf der Arbeitsfläche Oberfläche der Zellkultur Haube Luftblasen zu entfernen und die Lösung gleichmäßig in den Vertiefungen zu verbreiten. </li><li> Nach dem Befüllen alle Vertiefungen (dieser Schritt dauert etwa 15-20 Minuten pro 96-Well-Platte), bewahren Sie sie in den Inkubator. </li><li> Die Platte bei 37 ° C von 2 h bis über Nacht. Collagen Gelierung (dh Fibrillogenese) tritt innerhalb von 30 min. Hinzufügen Kulturmedium (100 &amp; mgr; l / Vertiefung) zu der Kultur einer Inkubation über Nacht durchzuführen. </li></ol> 2. Erste Schicht von Fibringelstruktur <ol><li> Fibrinogenlösung Vorbereitung. HINWEIS: Die gleiche Charge von Fibrin-Gel sollte idealerweise für reproduzierbarer Resul verwendet werdents, wie Fibrin-Gel-Bildung zwischen verschiedenen Chargen von kommerziellen gefriergetrocknetem Fibrinogen kann variieren. <ol><li> Verwenden Sie immer eine frisch zubereitete Fibrinogen-Lösung. Bringen Sie die gefriergetrockneten Fibrinogen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Flasche Hydrat eine Kristallbildung zu vermeiden. </li><li> Progressiv das Fibrinogen in vorgewärmten (37 ° C) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen mit Ca 2+ / Mg 2+ bei einer Arbeitskonzentration von 3 mg / ml (erwägen , einen 15% Überschuß des Mindest Endvolumen erforderliche Vorbereitung : zB 17.25 mg in 5,75 ml einer 5 ml - Lösung). <ol><li> In vorgewärmten HBSS tropfenweise auf den ersten Fibrinogenfragmenten löslich zu machen. Break down größere Fragmente mit einem Spatel in den Becher. Agitieren den Becher von Zeit zu Zeit das Mischen zu erleichtern. Verwenden Sie keine Rührerplatte während des Verfahrens verwendet werden. Man löst das verbleibende Pulver durch Pipettieren der Suspension auf und ab. </li></ol></li><li> Halten Sie die Fibrinogenlösung lauwarm während steriLIZING die Lösung, indem sie durch ein 0,22 um-Filter geleitet. Hinweis: Wenn die HBSS nicht warm genug ist oder das Fibrinogen nicht vollständig gelöst ist, kann die Lösung den Filter verstopfen. Setzen Sie gegebenenfalls Filter ein- oder zweimal, was die Fibrinogenkonzentration verringern kann und damit Fibringerinnsels Steifigkeit. </li><li> Suspend die Zellen von Interesse (zB Endothelzellen) in ready-to-use Fibrinogen - Lösung , während seine endgültige Einstellen der Lautstärke, als alternatives Verfahren. </li></ol></li><li> Vorbereiten der Thrombin-Lösungen. <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung in ddH 2 O (50 NIH - Einheiten / ml), dann sterilisieren es einen 0,22 &amp; mgr; m - Filter. </li><li> Verwenden Sie ein Fibrinogen / Thrombin-Verhältnis ≥1: 0,0075 (v / v), um das Fibrin-Gel zu erzeugen. </li></ol></li><li> Die Erzeugung des Fibringelstruktur. <ol><li> Halten Sie das sterile Fibrinogen und Thrombin-Stammlösungen auf Eis während all den nächsten Schritten. Die Fibringele können in Platten mit 24 Vertiefungen zu bilden. </li><li> Unverzüglich Overlay the Oberfläche jeder Vertiefung mit der Fibrinogen-Lösung (200 &amp; mgr; l / Well) während der Luftblasenbildung zu vermeiden. Verfahren 6 Vertiefungen zu einer Zeit. </li><li> Sobald vollständig die Fibrinogenlösung, die Oberfläche der Vertiefungen bedeckt, in einem 45 ° -Winkel der Platte kippen und 1,5 ul Thrombinlösung in die erste Vertiefung mit Hilfe des Thrombins in der Mitte des Bohrlochs fallen und dann auf die Platte leicht geschwenkt horizontal 1-2 sec. <ol><li> Lassen Sie die Platte in einer stabilen Position unter der Laminar - Flow - Haube (5-10 min) , bis die Gelierung / Gerinnungsprozess abgeschlossen ist (NB: Polymerisation darf nicht gestört werden, zum Beispiel indem man die Platte in den Inkubator zu transportieren). </li></ol></li><li> Sobald die ersten sechs Bohrungen polymerisiert haben, wiederholen Sie die gleiche Sequenz (dh die drei vorhergehenden Schritte) für die nächsten sechs Brunnen , bis alle Vertiefungen verarbeitet wurden. </li></ol></li></ol> 3. Zweite Schicht von Fibringelstruktur und Sandwiched Collagen Stecker <ol><li> OptionA: (Mit Hilfe des Collagen-Plug sofort). <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die erste Schicht aus Fibrin-Gel in allen Vertiefungen zart polymerisiert wurde von der Platte zu kippen. Legen Sie die 96-Well-Platte das Kollagen Gelpfropfen Seite an Seite mit der 24-Well-Platte (mit den Fibringelen), die Übertragung der Kollagen-Stecker zu erleichtern. </li><li> Geben Sie einen Tropfen HBSS in jede Vertiefung der Platte, die die Kollagen-Stecker enthalten. </li><li> Entfernen Sie jede Kollagen Stecker aus dem Bohrloch mit einer dünnen Nadel an einer Spritze befestigt (als Griff verwendet wird) oder mit einem Mikro-Löffel (siehe Video). Bringen Sie jede Kollagen-Stecker auf die erste Fibringelstruktur Schicht mit einem oder zwei Mikrolöffel, gleichzeitig aber dafür sorgen, dass das Kollagen Stecker gut in das Bohrloch zentriert ist und dass die Sterilität ist sehr gepflegt. </li><li> Überlagern, die zuvor gebildete Fibrin-Gel mit der zweiten Schicht von Fibrinogen-Lösung (300 ul / Vertiefung) und die Einführung des Thrombins wie in 2.3 beschrieben, wird ein minimal 1 zu halten. 0,0075 Verhältnis und eine Sequenz von sechs Vertiefungen in einer Zeit &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Option B (Beschichtung der Collagen-Stecker mit einer dünnen Schicht von Wachstumsfaktor-reduziert Basalmembran (GFRBM)). <ol><li> Kühle alle hergestellten Lösungen und Instrumente vorher und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis (zB Pipetten, Spitzen, Reagenzgläser) während seit gefrorenen Aliquoten GFRBM Handhabung sind sehr empfindlich gegen zu hohe Erwärmungsrate während des Auftauens (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) . </li><li> Nach der Entfernung von den Plattenvertiefungen, tränken jedes Kollagen Stecker für 2 Minuten in einer 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis, die 100 &amp; mgr; l einer reinen GRFBM Lösung. </li><li> Übertragen jeder beschichteten Stecker auf die erste Fibrinschicht, während es gewährleistet ist gut zentriert ist, wie oben beschrieben. Inkubieren der Steck enthaltenden Platten bei 37 ° C für 5 min die GRFBM zu ermöglichen, ein Gel zu bilden. Fügen Sie die zweite Fibrinschicht, wie in Schritt 3.1.4. </li></ol></li></ol> 4. Zellkulturmedium Bedingungen <ol><li> Füllen Sie jede Vertiefung mit Kulturmedium (400 ul). Die Kulturmedien und Ergänzungen werden auf der Grundlage der Zelllinie und Versuchsbedingungen gewählt werden. </li><li> Hinzufügen Aprotinin, ein Antifibrinolytikum, um Kulturmedium in einer Endkonzentration von 100 Kallikrein-Inhibitor-Einheiten (KIE) / ml. HINWEIS: Bewahren Sie die Platten in einer Zellkultur-Inkubator unter den Bedingungen für die Zelllinie getestet verwendet. </li><li> Füllt Kulturen mit frischem Medium jeden zweiten Tag oder nach dem Versuchsplan, und fügen Sie Aprotinin. Vor Zugabe von frischem Medium, kippen leicht die Platte (bei 30-35 ° Winkel) und neigen die Pipette gegen die Seite des Bohrlochs während sorgfältig das konditionierte Medium unter ständiger Beobachtung Absaugen. </li></ol>

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The authors have no disclosure.

Als wichtige technische Fußnote ist es wesentlich, dass kein Spalt an der Grenzfläche zwischen dem zentralen vorhanden ist, und die peripheren Gelen. Andernfalls könnte es die Fähigkeit der Zellen zu reduzieren, um das Fibrin-Gel wandern / eindringen. Ein Raum zwischen dem Kollagen und Fibrin-Gelen kann während der ersten 24 Stunden der Kultur bilden, wenn Thrombin wurde nicht in geeigneter Weise verdünnt worden ist. Es ist auch möglich, dass die Zelllinie in Kultur getestet könnte das Kollagengel führen, zu ko...

Die grundlegenden und biomedizinischen Eigenschaften der Invasion von Krebszellen / Migration und anschließende Metastasierung Einrichtung zu untersuchen , ist Gegenstand einer intensiven Forschung 1,2. Metastasierung ist die letzte Stufe der Krebs und seine klinische Management bleibt schwer zu fassen. Ein besseres Verständnis der Metastasierung auf zellulärer und molekularer Ebene wird die Entwicklung effizienterer Therapien 3 ermöglichen. Mehrere Eigenschaften von metastatischen Zellen können in vitro 4 einschließlich ihrer stemness und potentielle einen Übergangszustand (beispielsweise epithelioid-mesenchymale Transition) zu migrieren und dringen in und aus dem Primärtumor 5 zu erwerben , untersucht werden. Allerdings hat die in - vitro - Beurteilung der Invasion / Metastasierung Prozesse eine Herausforderung , da sie praktisch den Beitrag des Blut / lymphatischen Kreislauf schließt. Organotypischen Kulturen, die Tumorfragmente in Collagengele einbetten haben früschlauen verwendet worden, um Krebs Aggressivität zu überwachen. Obwohl die Komplexität von Tumoren erhalten wird (beispielsweise das Vorhandensein von Nicht-Krebszellen) werden Tumorfragmente des begrenzten Diffusionsmedium ausgesetzt wird , um Stichprobenvariation und zu einem übermäßigen Wachstum von Stromazellen 6. Ein alternatives Verfahren besteht in Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) in Krebszellen wachsen, die die dreidimensionale (3D) Zellumgebung imitiert. Die Proliferation von Brustkrebszelllinien in einem Kollagen-Gel und / oder einer Basalmembran-Matrix abgeleitet ist unter den besten charakterisierten Beispiele von 3D-Zellkultur. Durch die Verwendung von bestimmten 3D - Zellkulturumgebungen, die desorganisierte Anordnung für Brustkrebszellen beobachtet unter Standardbedingungen gezüchtet kann 7-10 zur spontanen Bildung von Brust Acini und röhrenförmige Strukturen umgekehrt werden. Darüber hinaus sammelten die Bildung von vielzelligen Tumorsphäroide abgeleitet von einem Adenokarzinom Krebszellen mit verschiedenen Techniken (zB hängende Tropfen, schwimmend Sphäroiden, Agar Einbettungs) jetzt die am häufigsten verwendeten 3D - Zellkulturtest 11-13 darstellt. Jedoch ist dieser Test durch den eingeschränkten Satz von Krebszelllinien begrenzt, die Sphäroide und durch den kurzen Zeitraum zur Verfügung zu studieren Zellen unter diesen Bedingungen bilden kann. In dieser visualisierten Technik stellen wir hier ein anspruchsvolles 3D - Zellkulturassay , wo Krebszellen von Interesse in einem Kollagengel eingebettet sind , die in vitro Bildung eines pseudo-primären Tumors zu ermöglichen , die mit einer Basalmembran stammenden Matrix beschichtet werden alternativ kann. Einmal gebildet, wird die pseudo-primären Tumors dann in einer azellulären Matrix (Fibrin - Gel im vorliegenden Fall) sandwichartig angeordnet, die die Krebszellen ermöglicht die Schnittstelle zwischen den beiden Abteilen Matrix kreuzen (siehe Abbildung 1). Interessanterweise sekundäre tumorartige Strukturen aus dem Pseudo-Primärtumor erscheinen zusammen mit aggressiven Krebszellen mit Ursprung in derFibrin-Gel. Eine solche 3D - Kultursystem bietet die Flexibilität , beispielsweise zu untersuchen, erforderlich, Antikrebsmittel, die Genexpression und die Zell-Zell- und / oder Zell-ECM - Wechselwirkungen 14-16. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Abbildung 1:.. Überblick über die Methode Schematische Zusammenfassung der Methode der 3D - Zellkultursystem als Modell für Krebsstudien zu generieren <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Freeze-dried collagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan &lt;i&gt;et al&lt;/i&gt;., ref.#14)</td></tr><tr><td>Fibrinogen (freeze-dried)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F8630</td><td>Type I-S, 65 - 85% protein with &amp;ge; 75% of protein is clottable</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>605157</td><td>&amp;nbsp;Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Previously from BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Micro-spoons</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td></tr><tr><td>96 well plate, round base</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, Canadian origin.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table>

three-dimensional culture assay to explore cancer cell invasiveness and satellite tumor formation

Säugerzellkultur in Monolayern wird weithin verwendet, um verschiedene physiologische und molekulare Prozesse zu untersuchen. dieser Ansatz jedoch zu wachsenden Zellen studieren erzeugt oft unerwünschte Artefakte. Daher Zellkultur in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung, die oft extrazelluläre Matrixkomponenten verwenden, erwies sich als eine interessante Alternative wegen seiner Ähnlichkeit mit dem nativen in vivo Gewebe oder Organ. Wir entwickelten ein Kultursystem 3D - Zelle zwei Abteilen unter Verwendung, nämlich (i) eine zentrale Kammer Krebszellen enthält , in einem Kollagengel wirkenden eingebettet als pseudo-primäre macrospherical Tumors und (ii) einem peripheren zellfreien Kammer aus einem Fibrin - Gel, dh eine extrazelluläre Matrixkomponente , die sich von der in der Mitte verwendet werden, in denen Krebszellen (invasion vorne) wandern und / oder mikrosphärischen Tumoren bilden darstellt sekundäre oder Satelliten Tumoren. Die Bildung von Satelliten-Tumoren im peripheres Kompartiment istbemerkenswert korreliert mit der bekannten Aggressivität oder metastasiertem Ursprung der nativen Tumorzellen, die diese 3D-Kultursystem einzigartig macht. Dieser Zellkulturansatz könnte als Krebszelle Invasivität und Motilität, Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen und als ein Verfahren zur Beurteilung anti-Krebs-Medikament Eigenschaften zu bewerten.

Wie bereits erwähnt, ist ein interessantes Merkmal dieser 3D - Zellkulturassay , daß Krebszellen nicht nur aus dem Kollagenstopfen zum benachbarten Fibringel wandern kann, sondern auch sekundäre Tumoren (beispielsweise Satelliten - tumorartige Strukturen) herzustellen. Diese können direkt mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop bei niedrigen und hohen Vergrßerungen durch das Gel Dicke beobachtet, insbesondere mit einem großen Arbeitsabstand Kondensor (Abbild...

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Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

three-dimensional-culture-assay-to-explore-cancer-cell-invasiveness

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Aufrufe.  CHU de Québec Research Centre. Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Serie: Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Forschung

Medizin

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Krebsforschung

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

3D Culture Basement Membrane Assay: Culturing Cancer Cells on 3D Basement Membrane Protein Matrix to Study Cell Invasion

Source: Cvetkovi&#263;, D., et al. <a href="https://www.jove.com/v/51341/quantification-breast-cancer-cell-invasiveness-using-three">Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model.</a> J. Vis. Exp. (2014).
This video provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment.

3D-Kultur-Basalmembran-Assay: Kultivierung von Krebszellen auf einer 3D-Basalmembran-Proteinmatrix zur Untersuchung der Zellinvasion

Source: Cvetkovi&#263;, D., et al. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (2014).
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Breast Cancer

In vitro studies

3-Dimensional Culture of Lung Carcinoma Cells: A Method To Study Cell-Matrix Interactions

Source: Chen, S. et. al. <a href="https://www.jove.com/v/60644/multidimensional-coculture-system-to-model-lung-squamous-carcinoma">Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the technique of 3-D culture of lung carcinoma cells to study the cell-matrix interactions. In the protocol, we will perform the 3D culture of TUM622 lung carcinoma cells to explore its potential of forming organoids in vitro.

3-dimensionale Kultur von Lungenkarzinomzellen: Eine Methode zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen

Source: Chen, S. et. al. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (2020).
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