Name: a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting
Uploaded: 2015-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
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1. Erzeugung von Spheroids <ol><li> Vorbereitung Einzelzellsuspension für hängende Tropfen Kulturen durch Ablösen haftKrebsZellKulturen von ~ 70% Konfluenz unter Verwendung eines PBS-Wasch durch Belichtung mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung. <ol><li> Neutralisieren die Trypsin-Lösung mit Zellkulturmedien und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Aliquots der Zellsuspension. Anmerkung: Die spezifische Zellkulturmedien werden auf der Zelllinie abhängig getestet. Folgen ATCC Medienempfehlungen, wobei die Zellkulturmedien typischerweise DMEM + 10% FBS. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstoff-Tabelle gefunden werden. </li><li> Führen eine Verdünnung für die Aussaat von 500-1000 Zellen pro 20 ul Tropfen der Zellkulturmedien ermöglichen. </li></ol></li><li> Erwerben Sie 10 cm Schüssel und 5 ml sterilem PBS auf den Grund. Hinweis: Dieser Schritt schützt den hängenden Tropfen aus der Verdampfung. Kostengünstigere &quot;bakteriologischen grade&quot; Gerichte können an Stelle der Zellkultur Geschirr verwendet werden, wie Zellen nicht conthandeln die Kulturfläche. </li><li> Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 20 ul Tropfen der verdünnten Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Deckels übertragen. <ol><li> Pipette 40 Tropfen (5 Reihen von 8 Tropfen) auf dem Deckel des 10 cm-Schale. </li></ol></li><li> Kehren Sie die Deckel und Platz über der Kulturschale. Der hängende Tropfen Kulturen bei 37 ° C inkubieren 72 h bis Sphäroide zu erzeugen. <ol><li> Klappen Sie den Deckel in eine selbstbewusste, dennoch kontrolliert. Hinweis: Invertierung des Deckels zu schnell oder zu langsam, kann dazu führen, die Tröpfchen zu verschieben. Einige Zelllinien können Sphäroiden in 48 Stunden oder weniger zu bilden, während andere erfordern mehr als 72 Stunden, um kompakte Aggregate zu erzeugen. </li></ol></li></ol> 2. Einbetten von Sphäroiden in 3D-Matrix <ol><li> Auftauen eines Aliquots Wachstumsfaktor reduziert Basalmembran Stoffe bei 4 ° C über Nacht vor dem Einbetten der Sphäroide. <ol><li> Optional: Layer Vertiefungen mit ECM im voraus, um mögliche Sphäroid Wechselwirkung mit dem Gewebe zu verhindern cultuwieder auftauchen. <ol><li> Jeweils 200 ul ECM pro Well auf einer 24-Well-Platte. </li><li> Kippen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass das ECM umfasst die gesamte Erdoberfläche. </li><li> Überschüssige ECM Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette. </li><li> Die Platte, bis die Brunnen sind trocken: 3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Sammeln der Sphäroide durch Kippen des Deckels der Gewebekulturschale und das Poolen der Medien. Übertragen Sie die Medien mit den Sphäroiden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Gestatten 10 min für die Sphäroide, sich am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Sphäroiden sollte mit dem Auge sichtbar sein. </li><li> Mischungs 100 ul der Basalmembran Materialien mit 100 ul kaltem (4 ° C) Kollagen vom Typ I in einem separaten vorgekühlte Röhrchen. Halten der Mischung bei 4 ° C entweder Gel verfestigt vorzeitig zu verhindern. <ol><li> Verwenden Sie vorgekühlte Pipettenspitzen, wenn die Übertragung kleiner Volumina. </li><li> Geben Sie vorsichtig, wenn SieMischen der Basalmembran Materialien und Kollagen Typ I, um Luftblasenbildung zu verhindern. Anmerkung: Luftblasen können Abbildungs ​​später in dem Protokoll zu behindern, wenn sie in dem Gel eingebettet werden. </li></ol></li><li> Absaugen Sphäroide aus der 40 ul Bodenabschnitt des Mikrozentrifugenröhrchens, und verbinden sich mit der Basalmembran Stoffe / Kollagen Typ I-Gemisch. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasenbildung beim Mischen zu verhindern. Anmerkung: Die Lösung, die von 100 ul Basalmembran Materialien 100 ul Kollagen Typ I, und 40 ul der Sphäroide genügend Material für 4 unabhängige 3D Kulturen zu schaffen. Dies kann nach oben oder unten skaliert werden. </li><li> Pipette 40 ul Tropfen der viskosen Mischung in die Zentren der Vertiefungen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen. Halten Sie die Platte Ebene, um die Mischung aus Laufen in die Seite des Bohrlochs zu verhindern. Hinweis: Eine einzelne Spalte auf der 24-Well-Platte - 4 Brunnen - wird empfohlen, für jede Bedingung getestet werden. </li><li> Legen Sie die Platte intoa 37 ° C-Inkubator und lassen Sie ungestört für 30 Minuten. Die 3D-Kultur wird in diesem Zeitraum zu polymerisieren. </li><li> Langsam tauchen die 3D-Kulturen in 1 ml Zellkulturmedien. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Medien ist warm, wenn Sie die Ware in die Vertiefungen zur weiteren Förderung Gelpolymerisation. </li><li> Wichtiger Schritt: die Medien, um die 3D-Kulturen hinzuzufügen vorsichtig. Pipettieren der Medien zu schnell in die Vertiefungen können zur Ablösung der 3D-Kulturen aus dem Gewebekulturoberfläche führen. </li></ol></li></ol> 3. Überwachung und Analyse der Spheroid Invasion <ol><li> Bild Invasion aus der Sphäroide in das umgebende 3D-Matrix bei vom Forscher beschlossen Zeitpunkten. Erwerben Fotografien mit einem inversen Mikroskop mit 20-facher Objektivlinse. Anmerkung: Ideal Zeitpunkten in Abhängigkeit von der Zelllinie getestet abweichen. Invasiveren Zellinien ihre Austritt aus den Sphäroiden kurz nach der Plattierung zu beginnen, und daher nehmen anfängliche Fotografies innerhalb von ein paar Stunden nach der Plattierung. Im Allgemeinen werden Fotografien bei 0 h (nach der Beschichtung), 24 h und 48 h entnommen. Invasion, schließt in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Plattierung. </li><li> Quantifizieren invasive Möglichkeit, anhand der Bildanalyse-Software wie Bild J. <ol><li> Analyse Invasion als der Zellenabstand von der Kante des Sphäroids. <ol><li> Verwenden Sie den Straight Draw-Tool, um den Radius und / oder maximale invasive Entfernung zu markieren. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot; in der oberen Menüleiste und klicken Sie auf &quot;Messen&quot;, um die Längenmessung anzuzeigen. </li></ol></li><li> Analysieren Invasion als der Gesamt invasive Bereich außerhalb der Sphäroid. <ol><li> Verwenden Sie die Freihand-Zeichenwerkzeug, um die Grenze des Sphäroids und / oder Gesamt invasive Bereich zu verfolgen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot; in der oberen Menüleiste und klicken Sie auf &quot;Messen&quot;, um die Flächenmessung anzuzeigen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ein Plugin wie ROI Manager Tools, um Messungen für einen Stapel von Bildern erstellen. </li></ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

In dieser Studie wurde die Leistung einer Reihe von Krebszelllinien in einem Sphäroid Invasionstest (Tabelle 1). Im Allgemeinen finden wir, dass Sphäroidbildung ist in den mehr epitheliale gerichteten Zelllinien, bei denen die Anwesenheit von Zell-Zell-Verbindungen fördert die Bildung von einem Sphäroid-like-Architektur verbessert. Bekannten Zelllinien, welche eine epitheliale-mesenchymale Transition erfahren haben, wie MDA-MB-231-Zellen nicht Sphäroide im Drop Kultur wahrscheinlichste hängenden b...

Wird festgestellt, dass Krebszellbeweglichkeit prädiktiv ist metastatischen Potential, da ein solches Verhalten erleichtert Invasion durch die Basalmembran und den Eintritt in das Kreislaufsystem 1. Die meiste Forschung auf Motilität hat, wie sich Zellen in einem zweidimensionalen (2D) Einstellung, obwohl es immer weitgehend anerkannt, dass die Bewegung von Zellen in einer dreidimensionalen (3D) Matrix ist repräsentativ dafür, wie diese selben Zellen tatsächlich fokussiert verhalten in vivo 2. 3D-Kultursysteme werden zunehmend eingesetzt, um zelluläre Verhaltensweisen, die von Zellmorphologie reichen, um das Wachstum Kinetik und Arzneimittelempfindlichkeit 3 studieren. Der Wunsch, die Invasion von Krebszellen im Rahmen einer 3D Milieu überwacht wurde zur Synthese der zuvor festgelegten Verfahren, bei denen die Erzeugung von 3D-Zellaggregate (Sphäroide) über den hängenden Tropfen Kulturverfahren 4, gefolgt von Einbettung dieser Sphäroide in ein 3D extrazellulärem führten Matrix (ECM) von Kollagen und Basalmembran Materialien 5 zusammengesetzt. Diese Methode dient, auf diese vorher festgelegten Techniken durch Bereitstellung eines optimierten Ansatz, die leicht verwendet werden kann, um das Eindringen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu vergleichen verbessern. Weitere traditionelle Wege, um Zellbeweglichkeit in vitro zu beurteilen sind die kratz gewickelt Assay und die Transwell Assay 6. Erstere Assay zeigt Zellmotilität in einem 2D-Einstellung und ist daher unabhängig von einer Vielzahl von Funktionen kritisch für die in vivo-Invasion, zum Beispiel Proteaseaktivität 7. Die Transwell-Assay kann besseres Modell Zellinvasion, wenn die auch Einsätze mit ECM Substrate jedoch nur einen einzelnen Parameter beschichtet, dh das Auftreten von Zellen, die auf der gegenüberliegenden Membranoberfläche gemessen wird, und viele Nuancen der Zellinvasion sind daher nicht leicht beobachtbar. Im Gegensatz zu diesen Techniken ist die Krebszelle Sphäroid Invasionsassay (Abbildung 1 &lt;/ strong&gt;) ermöglicht die Echtzeit-Überwachung der Zellinvasion in einer Umgebung, die nicht nur physiologisch relevant, sondern erlaubt auch die wichtigen Zelllinie spezifische Merkmale sichtbar zu machen, wie einzelne vs. kollektiven Zellmigration 8. Dieses Verfahren bietet auch Vorteile gegenüber Standard-3D-Kulturwachstums-Assays. Die Erzeugung von Zellaggregaten über die Hängetropfenmethode zunächst schränkt Zellbewegung, so dass Zellen Anreize zu erobern, nachdem diese Einschränkung aufgehoben werden. Darüber hinaus einmal, dass Zwang angehoben wird, wird Zell Egress gehen in eine einheitliche Richtung, die dann bequem quantitativ bestimmt werden kann. Die für die Krebszelle Sphäroiden Assays verwendet beliebtesten ECM Materialien sind Matrigel und Kollagen Typ I, wobei jede dieser Komponenten hat wichtige und unterschiedliche Rollen bei der Beeinflussung metastatischen Verhalten. Matrigel ist eine sekretierte Proteingemisch von Engelbreth-Holm-Swarm-Maus Sarcomazellen erzeugt und in baseme angereichertnt Membranproteine ​​wie Laminin, Entactin und Kollagen Typ IV 9. Aus diesem Grund Matrigel wird fortan als &quot;Basalmembran Materialien.&quot; Diese Basalmembran Materialien liefern wichtige Liganden für Integrin Haftung während Invasion von Krebszellen 10 zusätzlich zu vielen anderen Proteinen, die eine Reihe von Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle 11 auszuüben brauchte. Im Vergleich Kollagen Typ I, die gemeinhin aus sauren Aufschlüssen von Sehnen und anderen dichten Kollagenstrukturen 12 hergestellt wird, ist eine viel einfachere Matrixmaterial, das als Hauptstrukturelement des Bindegewebes und Stroma Stützgewebe und Organen des Körpers dient. Es hat sich gezeigt, dass die physikalischen Eigenschaften von Kollagen können eine Reihe von Merkmalen der Zellmotilität regeln; zum Beispiel die Ausrichtung der Kollagenfasern in den Tumor-Stroma-Schnittstelle ermöglicht die Krebszellen zu migrieren anschließend entlang dieser Fibrillen, wenn eindringende in das Stroma 13. In dem Assay hier präsentierten sowohl Typ I-Kollagen und Basalmembran-Materialien werden als Werkzeuge, um 3D-Zell-Stroma-Interaktionen zu untersuchen nutzt. Die Wirkung der Inhibierung oder Stimulierung von Bahnen, die Invasion überwacht, nachdem die Zellen in die 3D-Matrix eingebettet werden, zu steuern. Zellen können während des Wachstums in den hängenden Tropfen oder bei Übertragung der 3D-Kultur, abhängig davon, ob eine längere Behandlung erforderlich, um Invasion modulieren vorbehandelt werden. Für kürzere Behandlungs, ist es empfehlenswert, dass das Medikament mit dem Sphäroid Suspension nach der Erfassung, sowie die Medien, die den 3D-Kulturen umgeben wird, um eine angemessene Arzneimittelexposition zu den Zellen erleichtern gemischt werden. Als nächstes kann normal oder Tumor-assoziierten Stromazellen mit dem Matrixmaterial vermischt werden, um ihre Rolle bei der Modulation der Tumorzellinvasion zu bewerten, oder um festzustellen, wie parakrine und autokrine Signalisierung Einflüsse Zellverhalten. Diese Idee wurde in einer Studie gezeigt, wo die Co-Kultur von colüber Krebs und Endothelzellen in hängenden Tropfen zu einer Gefäßnetz innerhalb der Sphäroide 14. Schließlich kann das ECM Komponenten auch verändert werden, da Invasion von Krebszellen wird durch verschiedene Substrate 15 belastet. Die unten dargestellten Verfahren wird somit ein Rahmen für die Beurteilung Invasion von Krebszellen unter einer Vielzahl von Bedingungen. Allgemein wurde festgestellt, dass nicht alle Zelllinien Sphäroide in den hängenden Tropfen zu erstellen und epithelialen gerichteten Zelllinien bilden in der Regel regelmäßige Sphären.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Verwendung des Sphäroids Invasionsassay (Abbildung 1), eine Reihe von Krebszelllinien wurden auf ihre Fähigkeit zur Sphäroide als auch für die Höhe der Zelle Austritt nach der Implantation in einer 3D-Matrix gezeigt, die aus Basalmembran Materialien und Typ I-Kollagen zu bilden getestet (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht jeder Krebszelllinie wird wohlgeformt Sphäroiden, wo Zelllinien besitzen eine epitheliale Morphologie in vitro neigten dazu, regelmäßige ...

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A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

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Serie: A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Forschung

Medizin

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Krebsforschung

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

3D-Modelle in der Krebsbiologie: Invasionsdynamik in Heterospheroiden

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Wechselwirkung zwischen Krebs und Immunzellen während des Fortschreitens von Kopf- und Halskrebs

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Untersuchung von Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Interaktionen in einem 3D-Kollagenmatrix-Setup

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Zusammenfassung

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Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay