Diese Arbeit wurde von einem Forschungsstipendium des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) (Zuschuss Nr. 13GW0043C) und einem Europäischen Amt für Luft- und Raumfahrtforschung und -entwicklung (EOARD, Grant # FA9550-15-1-0443) unterstützt.

1. RPE-Zellkultur <ol><li> Isolierung von RPE-Zellen aus Schweineaugen <ol><li> Erhalten Sie frisch entkernte Schweineaugen aus dem örtlichen Schlachthaus. Halten Sie sie kühl (4 ° C) und in einer dunklen Umgebung. </li><li> Entfernen Sie extrazelluläre Gewebe mit einer Schere und tränken Sie die Augen in einer antiseptischen Lösung für 5 min. </li><li> Legen Sie die Augen in sterilisiertem phosphatgepufferten Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS (-)) bis zur Verwendung. </li><li> Mit einem Skalpell, dringen Sie die Sklera bei etwa 5 mm hinter dem Hornhaut limbus. Resect den ganzen vorderen Teil des Auges durch Schneiden mit Schere den ganzen Weg durch, parallel zum Hornhaut limbus. </li><li> Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges ( dh die Hornhaut und das Objektiv) und den Glaskörper. Füge 1 ml PBS (-) hinzu und neide die neurale Retina vorsichtig ab. HINWEIS: Diese &quot;Augenschale&quot;, bestehend aus Sklera, Aderhaut und RPE, ist nun fertig. </li><li> Vorgewärmtes (37 ° C) 0,25% Trypsin in P hinzufügenBS (-) zur Augenschale. Stellen Sie das Volumen so ein, dass etwa 80% der Augenschale mit dieser Trypsinlösung gefüllt ist. </li><li> Inkubieren Sie die Augenschale mit der Trypsinlösung in einem 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Augenschale vom Inkubator und ersetzen Sie die 0,25% Trypsinlösung durch eine PBS (-) - Lösung mit 0,05% Trypsin + 0,2% Ethylendiamintetraessigsäure Tetranatriumsalz (EDTA · 4N). Inkubieren Sie die Augenschale im Inkubator für 45 min. ANMERKUNG: Nach 45 min werden die RPE-Zellen entweder einfach lose an die Bruch-Membran gebunden oder bereits abgelöst und in der Trypsin-EDTA-Lösung schwimmen. </li><li> Sammle die RPE-Zellen durch sanftes Pipettieren. Sammeln Sie die Zellen und die Lösung in einem konischen Röhrchen, gefüllt mit 10 ml Kulturmedium (DMEM-Hochglukose mit L-Glutamin), einschließlich 10% Schweineserum, Antibiotikum / Antimykotikum und Natriumpyruvat (1 mM). HINWEIS: Das Serum kann die Wirkung von Trypsin neutralisieren. </li><li> Zentrifuge dieZellsuspension bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Den Überstand entfernen und 10 ml frisches Medium zugeben. Noch zweimal unter den gleichen Bedingungen zentrifugieren </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein neues Medium hinzu, so dass die Zellkonzentration 5 x 10 &amp; sup5; Zellen / ml ergibt (bestimmt durch Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers). Mischen Sie gut durch sanftes Pipettieren. </li><li> Verteilen Sie die Zellsuspension in Zellkulturschalen. Verwenden Sie 3 ml pro 60 mm Durchmesser Kulturschale. HINWEIS: Diese Kultur heißt Durchgangsnull (P0). </li><li> Halten Sie die Zellen in einem 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C. Ändern Sie die Hälfte des konditionierten Mediums zu jedem zweiten Tag auf frisches Medium. </li><li> Subkultur (Schritt 1.2), wenn es konfluent wird. </li></ol></li><li> Subkultur der RPE-Zellkultur <ol><li> Das Kulturmedium entfernen und die Zellen zweimal mit PBS (-) spülen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit PBS (-) - Lösung mit 0,05% Trypsin + 0,2% EDTA iNa 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Die RPE-Zellen werden durch sanftes Pipettieren abgetrennt und die Zellsuspension in einem konischen Röhrchen, gefüllt mit 10 ml Kulturmedium, einschließlich 10% Schweineserum, gesammelt. </li><li> Die Zellsuspension bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein neues Kulturmedium hinzu, wodurch die Zellkonzentration 5 x 10 5 Zellen / ml (bestimmt durch Zählen der Zellzahl mit einem Hämocytometer). Verteilen Sie die Zellen in neuen Kulturschalen von 60 mm Durchmesser, wie in Schritt 1.1.13 beschrieben. HINWEIS: Die Zellkultur ist nun Passage 1 (P1). </li><li> Nachdem die Konfluenz erreicht ist, subkultur die P1-Kultur zu P2, unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie in den Schritten 1.2.1-1.2.5 beschrieben. Aus der P2-Kultur werden die Zellen auf kleineren Kulturschalen (30 mm Innendurchmesser) anstelle von 60 mm Durchmesser Kulturschalen gesät. </li><li> Für die Experimente verwenden Sie P2- oder P3-Kulturen. </li></ol></li></ol> 2. ThulIum Laser Bestrahlung <ol><li> Aufbau der Bestrahlungsstation <ol><li> Verbinden Sie eine Thulium-Laservorrichtung (1,94 μm, Leistungsbereich: 0-20 W) mit einer 0,22-NA, 365 μm Kerndurchmesser-Faser. </li><li> Mechanische Befestigung der Faserspitze an dem Metallarm, der horizontal an der vertikalen Metallpfosten der Bestrahlungsstation befestigt ist. Setzen Sie den senkrechten Pfosten so ein, dass sich die Spitze der Laserfaser oberhalb der heißen Platte befindet, auf der die Zellkulturschale während der Bestrahlung platziert werden soll. </li><li> Legen Sie ein weißes Papier auf die heiße Platte und drehen Sie den Zielstrahl auf (λ = 635 nm, max = 1 mW, Durchmesser auf Papierniveau ≈ 30 mm). Markieren Sie den Umfang des Zielstrahls auf dem weißen Papier, so dass die Position, wo die Kulturschale während der Bestrahlung platziert werden soll, bekannt ist. HINWEIS: Die z-Ebene der Faserspitze kann veränderbar sein. Ohne jede zusätzliche Abbildungsoptik wurde der Laserfleckdurchmesser auf der Zellkulturebene, 12 cm unterhalb der Faserspitze, angeordnetS etwa 30 mm, was fast dem Innendurchmesser der Zellkulturschale entspricht. Eine schematische Darstellung des Aufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt . </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Thulium-Laser-Bestrahlungsstation. Eine Kulturschale wird auf die Heizplatte gelegt. Die Zellen werden 12 cm unterhalb der Thulium-Laserfaserspitze platziert, so dass die Strahlgröße nahezu identisch mit dem Innendurchmesser der Kulturschale (ca. 30 mm) ist. Der Laserbestrahlungsvorgang wird durch eine zeitgesteuerte Routine der maßgeschneiderten Systemdesignplattform gesteuert. Die Leistungseinstellung muss vor dem Start des Bestrahlungsprogramms ermittelt werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <olStart = &quot;2&quot;&gt; <li> Laserbestrahlung der Zellkultur <ol><li> 1 h vor der Bestrahlung, ersetzen Sie das Kulturmedium vollständig mit 1,2 mL frischem Medium. HINWEIS: Dies ist ein CRITICAL STEP und muss unbedingt eingehalten werden. </li><li> Legen Sie die Bestrahlungsstation ( dh die Heizplatte und den Pfosten, mit dem die Laserfaser fixiert werden soll) auf eine saubere Bank. </li><li> Entfernen Sie die Zellkulturschale aus dem Inkubator und legen Sie sie auf die markierte Position auf der Heizplatte (Schritt 2.1.3). </li><li> Schutzbrille tragen. Schalte den Thulium-Laser ein. Stellen Sie die Leistung wie gewünscht auf die Laservorrichtung ein (einstellbar von 0 - 20 W). Schalte die Emission ein. </li><li> Starten Sie eine System-Design-Plattform, die die Laser-Bestrahlung und Timing-Protokoll (ergänzende Datei) steuert. </li><li> Unmittelbar nach dem Auflegen der Kulturschale auf die Heizplatte klicken Sie auf die &quot;Vorheizzeit&quot;, um den Timer für 140 s zu starten (&quot;Vorheizzeit 1&quot;); Dies wird die Kultur Mitteltemperatur bei 3 halten7 ° C vor der Bestrahlung HINWEIS: Nach 140 s schaltet sich ein Signalton ein, und der nächste Timer (&quot;Vorheizzeit 2&quot;) startet automatisch 8 s. Während dieser 8 s kann der Prüfer die Kulturschale öffnen. Nach 148 s Vorheizen wird eine 10-s-lange Laserbestrahlung auf die Zellkultur automatisch durchgeführt. Im Notfall rüsten Sie das Lasergerät mit einer Kraft-Taste aus, um den Laser sofort zu stoppen. Dies ist ein KRITISCHER SCHRITT und muss unbedingt eingehalten werden. Ein besonderer Vorsicht ist die Öffnung der Abdeckung der Schale kurz vor der Bestrahlung, zu Beginn der 8-s-Vorheizzeit. Das Öffnen der Abdeckung kann die mittlere Oberfläche sehr schnell abkühlen. </li><li> Nach der Bestrahlung sofort die Deckel wieder auf die Kulturschale legen, die Kulturschale auf die Heizplatte für weitere 7 s ablassen und in den 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C zurücklegen. </li></ol></li><li> Messung der Temperaturverteilung an derZellulärer Pegel (Temperaturkalibrierung) <ol><li> Machen Sie kleine Löcher (ca. 300 μm Durchmesser) in der Nähe des Bodens auf vier Seiten (alle 90 °) einer 30 mm Durchmesser Kulturschale (ohne Zellen); Benutzen Sie die Spitze einer Nadel (20G), die mit einem Bunsenbrenner erwärmt wird. Die Löcher mit dem elektrischen Isolationsband von außen abdichten und ein kleines Loch mit einer feinen Nadel herstellen, so dass nur ein feines Thermoelement (200 μm Durchmesser) durch dieses Loch unter wasserdichten Bedingungen eingeführt werden kann. </li><li> An der Außenseite des Kulturschalenbodens 2 senkrechte Durchmesser zeichnen und den Kreuzungspunkt ( dh die Mitte der Unterseite) als Koordinaten Null (0) einstellen. Markieren Sie alle 3 mm radial nach außen aus der Schale ( dh 0, 3, 6, 9, 12 und 15 mm) in jede Richtung entlang der Linien ( Abbildung 2 , blaue Punkte); Die Anzahl der Punkte sollte insgesamt 21 sein. </li><li> Füllen Sie die Zellkultur mit 1,2 ml neuem Kulturmedium. Lege die Kultur dAuf eine heiße Platte bei 37 ° C aufsetzen, ein feines Thermoelement (200 μm Durchmesser) in das Seitenloch einführen und die empfindliche Spitze auf eine markierte Position bringen, die gemessen werden soll. </li><li> Schutzbrille tragen. Schalte den Thulium-Laser ein und schalte manuell die Leistung ein (zwischen 0 und 20 W, in 0,1-W-Schritten) des Lasers. HINWEIS: Für die Temperaturkalibrierung sollten Messungen mit der Leistung in Schritten von 3 W ausreichen. </li><li> Schalten Sie die System-Design-Plattform ein und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Tempo erhöhen&quot; (Zusatzdatei), um die Temperaturmessung zu starten. </li><li> Gleiches Vorgehen wie in Schritt 2.2.6 durchführen. HINWEIS: Das Steuerprogramm misst die Temperatur des eingesetzten Thermoelements alle 100 ms und zeigt den Temperaturverlauf während der Bestrahlung im GUI. </li><li> Führen Sie diese Verfahren für alle 21 Messpunkte und bei verschiedenen Leistungseinstellungen durch. Wiederholen Sie die ganze Prozedur dreimal für alle Punkte und für alle Macht einzahlenGs zuverlässige Daten zu erhalten. </li><li> Exportieren Sie die Temperaturdaten als CSV-Daten, die eventuell in eine Tabellenkalkulation konvertiert werden können. Durchschnitt die maximale Temperatur am Ende der Bestrahlung für die dreifachen Messungen an jedem Punkt. Durchschnitt die Werte aus den Punkten auf dem gleichen Kreis (insgesamt 4 Punkte, außer dem Mittelpunkt). </li><li> Zeichnen Sie die erhaltene durchschnittliche maximale Temperatur auf einem Graphen, so dass der Abstand von der Mitte der Schale (mm) als x-Achse und der Temperaturerhöhung (ΔT, ° C) als y-Achse. Verwenden Sie die Fit-Funktion eines mathematischen Software-Programms, um ein Gauß-Modell an die Rohdaten anzupassen. Erstellen Sie eine Gaußsche Anpassung der Temperaturverteilung. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Punkte für die Temperaturkalibrierung in einer Zellkultur Dish. Die Temperaturdaten wurden in der Mitte und bei 5 gemessenRadiale Punkte über 4 verschiedene Winkel (blaue Punkte). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Biologische Assessments für Zellreaktionen nach verschiedenen thermischen Bestrahlungen <ol><li> Beurteilung der Zelllebensfähigkeit ( dh leben, apoptotisch und tot) nach verschiedenen Leistungseinstellungen und der Bestimmung der Zelltodschwelle <ol><li> Zu den angegebenen Zeitpunkten ( dh 3, 24 und 48 h nach der Bestrahlung) werden die Zellen mit PBS (-) gewaschen und ein handelsübliches Kit zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit ( dh vital, apoptotisch, tot) nach dem Hersteller verwendet Protokoll. </li><li> Eine Färbelösung durch Zugabe von 5 μl Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Lanxin V, 5 μl Ethidiumhomodimer III und 5 μl Hoechst 33342 auf 100 μl 1x Bindungspuffer (alle sind KitKomponenten). Bereiten Sie genug Färbe-Lösung vor, um die Zellen zu bedecken. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min. </li><li> Die Zellkultur zweimal mit dem Bindungspuffer waschen, den Bindungspuffer durch PBS (-) ersetzen und die Kultur auf die Stufe eines Fluoreszenzmikroskops stellen. </li><li> Schalten Sie den Lichtweg auf die Okularlinse, wählen Sie den 4 &#39;, 6-Diamidin-2-Phenylindol (DAPI) -Filter, schalten Sie das Beleuchtungslicht ein und finden Sie die fokussierte Ebene mit dem 4x-Objektiv. </li><li> Ändern Sie den Lichtweg zur Kamera, finden Sie das Bild auf dem Computerbildschirm in der Mikroskop-Imaging-Software und stellen Sie den Fokus ein. </li><li> Verwenden Sie die Stichfunktion ( dh die Funktion, um mehrere Bilder über die Schale aufzuzeichnen und dann ein einzelnes, großes Bild zu erzeugen) der mikroskopspezifischen Software, um das Fluoreszenzbild der gesamten Zellkulturschale zu erhalten. Verwenden Sie 3 verschiedene Filter-Sets - DAPI, FITC und Tetramethylrhodamin (TRITC) - zum Bild Hoechst 33342-positive Zellen (alle Zellkerne), FITC-Annexin V-PositiVe-Zellen (apoptotisch) und Ethidium-Homodimer-III-positiven Zellen (tot). </li><li> Messen Sie den Radius (mm) der toten (Ethidium-Homodimer-III-positiven) Region und den äußeren / inneren Radius der apoptotischen (Annexin-V-positiven) Bandform-Region in den gefärbten Zellkulturen. Tragen Sie diese Radien auf die passende Gaußsche Funktion der Temperaturverteilung für die entsprechende Leistungseinstellung an. Berechnen Sie die genaue Temperatur am Rand des toten oder apoptotischen Bereichs, um die Schwellentemperaturen für den Zelltod und die apoptotische Veränderung zu klären. </li></ol></li></ol>

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	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bei der Erörterung von temperaturbedingten biologischen Zellreaktionen ist nicht nur die Temperatur, sondern auch die Zeitdauer der erhöhten Temperatur von Bedeutung, da die meisten biochemischen Prozesse zeitabhängig sind. Besonders auf dem Gebiet der laserinduzierten Hyperthermie in der Ophthalmologie ist es aufgrund des kurzen Zeitbereichs - von Millisekunden bis zu Sekunden - schwierig, zelluläre thermische Effekte mit präziser Temperaturkontrolle zu untersuchen. Daher ist ein Laserbestrahlungsaufbau, der für ...

Das Verständnis der temperaturabhängigen zellbiologischen Reaktionen ist für erfolgreiche Hyperthermie-Behandlungen von großer Bedeutung. Retinale Laser-Photokoagulation mit einem thermischen Laser, in der Ophthalmologie verwendet, ist eine der etabliertesten Laser-Behandlungen in der Medizin. Sichtbares Licht, meist von grün bis gelb Wellenlängen, wird in der Netzhaut Laserbehandlung verwendet. Das Licht wird durch das Melanin in retinalen Pigment-Epithel- (RPE-) Zellen stark absorbiert, die die äußerste Zellmonoschicht der Retina bilden. Es gab jüngstes Interesse bei Ärzten und Forschern in einer sehr milden thermischen Bestrahlung (sub-sichtbare Photokoagulation) als neue therapeutische Strategie für verschiedene Arten von Netzhautstörungen 1 , 2 . Nach diesem Trend liegt unser Interesse an der sub-letalen Erwärmung von RPE-Zellen unter präziser Temperaturregelung, einer Technik namens temperaturgesteuerte photothermische Therapie (TC-PTT). Neueste optoAkustiktechnologie aus unserem Institut hat die Echtzeitmessung von Temperaturerhöhungen an bestrahlten Stellen in der Netzhaut ermöglicht. Dies ermöglicht die Kontrolle über die Temperaturerhöhung während der Bestrahlung 3 . Da jedoch eine sub-letale Hyperthermie auf der Netzhaut, die durch das Erhitzen von RPE-Zellen sub-lethally verursacht wurde, bisher aufgrund der Unmöglichkeit der Messung und Kontrolle der Temperatur nicht berücksichtigt wurde, haben die temperaturabhängigen Zellreaktionen von RPE-Zellen nach der thermischen Laserbestrahlung Wurde bislang sehr wenig studiert. Darüber hinaus wurde nicht nur die Temperaturdifferenz nicht im Detail diskutiert, sondern auch der Unterschied im Zellverhalten der überlebenden Zellen nach sub-letaler und tödlicher Bestrahlung. Um wissenschaftliche Erkenntnisse über TC-PTT-basierte Behandlungen zu sammeln, wollen wir die temperaturabhängigen biologischen Reaktionen der RPE-Zelle und ihre Mechanismen unter Verwendung von in vitro- Versuchsaufbauten erläutern. Für tSein Zweck ist es notwendig, einen Zelle-Heizungsaufbau herzustellen, der die folgenden Bedingungen erfüllt: 1) eine Möglichkeit für schnelle Temperaturerhöhungen, 2) eine präzise kontrollierte Zeit und Temperatur und 3) eine relativ hohe Anzahl von untersuchten Zellen für biologische Experimente . Hinsichtlich des Heizverfahrens ist ein klinischer Laser, wie ein frequenzverdoppelter Nd.YAG-Laser (532 nm), leider für die Zellkulturerwärmung ungeeignet. Dies liegt an der stark reduzierten Anzahl von Melanosomen in kultivierten RPE-Zellen. Die Laserlichtabsorption könnte inhomogen sein, und die Temperaturerhöhung auf zellulärer Ebene ist zwischen den Experimenten variabel, auch wenn sie mit derselben Strahlungsleistung bestrahlt wird. Mehrere frühere Studien berichteten über die Verwendung von schwarzem Papier unter dem Tellerboden während der Bestrahlung 4 oder die Verwendung von zusätzlichen Melanosomen, die vor den Experimenten 5 , 6 durch die Kulturzellen phagozytiert werden. Viele vonDie in vitro biologischen Studien zur Beurteilung von hyperthermieinduzierten Zellreaktionen wurden unter Verwendung einer Kochplatte, eines Wasserbades oder eines CO 2 -Inkubators mit einer Temperatureinstellung 7 durchgeführt . Diese Verfahren erfordern eine lange Heizperiode, da es einige Zeit dauert ( dh mehrere Minuten), um die gewünschte Temperatur zu erreichen. Weiterhin ist es mit diesen Verfahren schwierig, auf zellulärer Ebene eine detaillierte thermische Geschichte ( dh Temperatur multipliziert mit der Zeit) zu erhalten. Darüber hinaus kann sich die Temperatur unter den Zellen an verschiedenen Positionen in einer Kulturschale aufgrund der variablen Temperaturdiffusion unterscheiden. In den meisten Fällen wurde diese zeitliche und räumliche Temperaturinformation während der Hyperthermie bei biologischen Analysen nicht berücksichtigt, obwohl die biologische Zellreaktion durch die Temperatur und die Zeitdauer der erhöhten Temperatur kritisch beeinflusst werden kann. Um diese Probleme zu überwinden,Dünnwellen-Thulium-Laser wurde hier verwendet, um die Zellen zu erhitzen. Die Thulium-Laserstrahlung (λ = 1,94 μm) wird stark von Wasser 8 absorbiert und die Zellen am Boden der Kulturschale werden ausschließlich durch thermische Diffusion thermisch stimuliert. Die Laserfaser mit einem Durchmesser von 365 μm ist etwa 12 cm über der Kulturschale, ohne jegliche Optik. Der Laserstrahldurchmesser divergiert so, dass er nahezu dem Innendurchmesser der Kulturschale (30 mm) an der Oberfläche des Kulturmediums entspricht. Mit einer konsistenten Menge an Kulturmedium ist es möglich, die Zellen mit der Temperaturerhöhung zu bestrahlen Von hoher Wiederholbarkeit. Variable Leistungseinstellungen ermöglichen die Bestrahlung mit bis zu 20 W und die mittlere Temperatur auf zellulärer Ebene kann bis zu ΔT ≈ 26 ° C in 10 s erhöht werden. Durch Modifizieren der Bestrahlungsbedingungen ist es auch möglich, das Laserstrahlprofil zu ändern, um die Temperaturverteilung zu variierenIn einer Kulturschale. So ist es beispielsweise möglich, mit einer Gauß-artigen Temperaturverteilung wie in der aktuellen Studie oder mit einer homogenen Temperaturverteilung zu untersuchen. Letzteres kann für die Untersuchung der Effekte von temperaturabhängigen Zellreaktionen genauer für subtotale Temperaturerhöhungen, aber nicht für Zelltodstress oder Wundheilungsreaktionen vorteilhaft sein. Insgesamt kann die Thulium-Laser-Bestrahlung die Untersuchung verschiedener Arten von biologischen Faktoren wie Gen / Protein-Expression, Zelltodkinetik, Zellproliferation und Zellfunktionalität nach verschiedenen thermischen Expositionen ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

Ein originelles Verfahren zur Erwärmung von kultivierten Zellen mit einem 1,94 μm kontinuierlichen Thulium-Laser für die biologische Beurteilung wird hier vorgestellt. Die Thulium-Laserstrahlung wird stark von Wasser absorbiert und die Zellen am Boden der Kulturschale werden durch thermische Diffusion erwärmt. Eine Laserfaser mit einem Durchmesser von 365 μm wird etwa 12 cm oberhalb der Kulturschale ohne jegliche Optik eingestellt, so dass der Laserstrahldurchmesser nahezu dem Innendurchmesser der Kulturschale (30 mm) entspricht. Indem man in jedem Experiment eine konsistente Menge an Kulturmedium hält, ist es möglich, die Zellen mit einer hoch reproduzierbaren Temperaturerhöhung zu bestrahlen. Um die Temperaturerhöhung und ihre Verteilung in einer Zellkulturschale für jede Leistungseinstellung zu kalibrieren, wurde die Temperatur während 10 s der Bestrahlung an verschiedenen Positionen und auf zellulärer Ebene gemessen. Die Temperaturverteilung wurde mit einer mathematischen Grafiksoftware dargestelltProgramm, und sein Muster über die Kulturschale war in Gaußsche Form. Nach der Laserbestrahlung konnten verschiedene biologische Experimente durchgeführt werden, um temperaturabhängige Zellreaktionen zu bestimmen. In diesem Manuskript wird die Viabilitätsfärbung ( dh die Unterscheidung von lebenden, apoptotischen und toten Zellen) eingeführt, um die Schwellentemperaturen für die Zellapoptose und den Tod nach verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen. Die Vorteile dieser Methode sind die Präzision der Temperatur und die Zeit des Heizens sowie die hohe Effizienz bei Heizzellen in einer ganzen Zellkulturschale. Darüber hinaus ermöglicht es das Studium mit einer Vielzahl von Temperaturen und Zeitdauern, die durch ein computerisiertes Betriebssystem gut kontrolliert werden können.

Temperaturverteilung nach verschiedenen Leistungseinstellungen Alle Temperaturentwicklungen für jede einzelne Bestrahlung wurden bei der Temperaturkalibrierung überwacht. Aus diesen Daten wurde die maximale Temperatur am gemessenen Punkt erhalten und als T max (° C) definiert. Wie in Fig. 3A gezeigt , wurde das Programm zu dem Zeitpunkt ausgeführt, an dem die Kulturschale auf die Heizp...

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Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Ein ursprünglicher experimenteller Aufbau zum Erwärmen von Zellen in einer Kulturschale unter Verwendung von 1,94 μm kontinuierlicher Laserstrahlung wird hier eingeführt. Mit dieser Methode können die biologischen Reaktionen von retinalen Pigmentepithel- (RPE) -Zellen nach unterschiedlichen thermischen Expositionen untersucht werden.

Ununterbrochener Thulium-Laser zum Erwärmen von kultivierten Zellen zur Untersuchung zellulärer thermischer Effekte

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

continuous-wave-thulium-laser-for-heating-cultured-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Aufrufe.  University of Luebeck.  Ein ursprünglicher experimenteller Aufbau zum Erwärmen von Zellen in einer Kulturschale unter Verwendung von 1,94 μm kontinuierlicher Laserstrahlung wird hier eingeführt. Mit dieser Methode können die biologischen Reaktionen von retinalen Pigmentepithel- (RPE) -Zellen nach unterschiedlichen thermischen Expositionen untersucht werden. 

Serie: Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Forschung

Biologie

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren<em&gt; C elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...