Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.

1. Nanopartikel (NPs) Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen und Monozyten <ol><li> Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) vor der Markierung mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu ≥80% Konfluenz ergänzt. Ähnlich Kultur THP-1 - Zellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 - Medium mit 10% FBS auf eine Dichte von ~ 10 6 Zellen / ml ergänzt. </li><li> Last Silica-Nanopartikel (~ 500 &amp; mgr; m) mit Calceinfarbstoff-Lösung (200 &amp; mgr; M) über Nacht Rühren mit. Fabrizieren PLGA-Calcein AM (CAM) mit einem Protokoll zuvor beschrieben. 22 <ol><li> Man löst 250 ug CAM und 100 mg PLGA (50:50) in Chloroform bei 4 ° C. </li><li> Generieren Sie einzelne NPs Emulsion, die eine High-Speed-Homogenisator (13.600 · g, 60 sec) bei Raumtemperatur. Man dampft das Chloroform in einer chemischen Haube (≥3 hr) vor Sammlung mit Zentrifugation (3.400 × g für 5 min), Waschen (Doppel distiWasser gefüllt), Gefriertrocknung und Lagerung bei -20 ° C. </li></ol></li><li> CAM-PLGA NPs (1 mg) oder Calcein Siliciumdioxid NPs (150 ug) in 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung bei Raumtemperatur inkubieren 15 - 20 min. </li><li> Zentrifuge bei 3.400 xg für 5 min überschüssige PLL Überstand vor NPs Resuspension in 1 ml der jeweiligen Kulturmedium zu entfernen. </li><li> Inkubieren der NPs mit Zellen (MSCs oder THP-1, ~ 1 - 2 mal 10 6 Zellen insgesamt) für etwa 24 Stunden (0,1 mg · ml -1 Markierungskonzentration). </li><li> Dissoziieren und Ernte der markierten anhaftende MSCs unter Verwendung von 2 ml von 0,25% Trypsin (5 min, 37 ° C) und Abschrecken mit 6 ml DMEM. Drehen , um die Zellen bei (1000 xg, 4 min) und resuspendieren zu einer Konzentration von 10 5 - 10 6 Zellen / ml für mikrofluidische Verarbeitung. Verwenden Sie markierten THP-1 - Zellen (10. Mai - 10. JUNI Zellen / ml) direkt für die Mikrofluidik Reinigung. </li></ol> 2. Mikrofluidik-Vorrichtung Vorbereitung <ol><li> Vorrichtung Fabrication <ol><li> Fabrizieren die mikrofluidische Spiraleinrichtung (500 &amp; mgr; m (w) × 115 &amp; mgr; m (h)) mit Polydimethylsiloxan (PDMS) von einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Standard weichen Lithographieschritte. 23 </li><li> Mischen Sie 30 g Base Prepolymers und 3 g Mittel gründlich in einem Wägeschiffchen aushärtet. De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator für 60 Minuten alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Mischung auf den Siliziumwafer Masterform mit dem spiralförmigen Kanal Design strukturiert sorgfältig zu einer Höhe von ~ von 5 bis 10 mm. </li><li> De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator Vakuum erneut 60 min alle Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Blasen beseitigt werden. </li><li> Härten des PDMS-Mischung in einem Ofen bei 80ºC für 2 Stunden, bis das PDMS eingestellt ist. Sicherstellen, dass der Wafer nicht während der Aushärtung haben eine konstante Bauhöhe gekippt wird. </li><li> Schneiden Sie die PDMS-Spirale Gerät mit einem Skalpell und vorsichtig schälen die PDMS-Platte aus der Urform. </li><li> Trim, die Kanten der Vorrichtung mit einem Skalpell zum Bonden glatte Oberfläche zu gewährleisten. </li><li> Stanzen zwei Löcher (1,5 mm) für die Einlässe und zwei Löcher (1,5 mm) für die Auslässe auf der PDMS-Gerät mit einem 1,5 mm-Biopsie Tanze verwendet wird. </li><li> Waschen Sie das Gerät mit Isopropanol (IPA) alle Ablagerungen zu entfernen und das Gerät in einem 80 ° C Ofen für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Reinigen Sie die Bodenfläche der PDMS-Gerät (mit Kanalfunktionen) unter Verwendung von Klebeband. </li><li> Sauber einer Seite eines Glasobjektträger (2 &quot;von 3&quot;) unter Verwendung von Klebeband. </li><li> Vorsichtig legen und die gereinigten Oberflächen der PDMS-Gerät und Glasträger in der Kammer eines Plasmareiniger aussetzen und unterziehen sie für 60 Sekunden Vakuum. Als nächstes schalten Sie die Plasmaleistung auf Maximum und den Kammerdruck zu senken, bis die Kammer rosa Farbe dreht. <ol><li> Expose die Oberflächen Luftplasma für 60 Sekunden. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf den freiliegenden Oberflächen der PDMS und Glas, die feste Bindung ermöglicht, wenn sie in Physic gebrachtal Kontakt. Schalten Sie den Plasma-Gerät aus und lassen Sie den Druck aus dem Plasma-Reiniger das Gerät und Glasträger abzurufen. </li></ol></li><li> Bond, die PDMS-Gerät und Glasobjektträger zusammen mit dem Plasma ausgesetzten Oberflächen fest gedrückt und sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen den beiden Oberflächen gefangen sind. </li><li> Erhitzen Sie das gebundene Gerät eine Heizplatte eingestellt bei 80 ° C für 2 Stunden mit der Bindung zu stärken. </li></ol></li><li> Gerätebetrieb <ol><li> Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 15 bis 20 cm für die Einlass- Spritzen und Befestigen einer Spritzenspitze (Gauge 23) an einem Ende jedes Schlauch. </li><li> Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 5 - 10 cm für die Auslässe und heften sich an den Austrittsöffnungen des PDMS-Gerät. </li><li> Vor Laufen zu probieren, das Gerät manuell prime mit einer Spritze 70% Ethanol enthält, bis sie aus dem Ablaufschlauch fließt. Ermöglichen das Ethanol sit für 30 sec bis 1 min, das Gerät zu sterilisieren. </li><li> Last 30 ml gefilterter(0,2 um Poren) Mantel-Puffer (Phosphat-gepufferte Saline (PBS) mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)) in die 60 ml-Spritze und sichern die Spritze auf Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 60 ml, Volumen: 60.000 ul). Anmerkung: Die Zugabe von BSA zu PBS ist Zell-Zell-Bindung und unspezifischer zwischen Zellen und der PDMS-Gerät Bindung zu minimieren. </li><li> Last 3 ml der markierten Zellen in die 3-ml-Spritze und sichern Sie die Spritze auf einem separaten Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 3 ml, Volumen: 3000 ul). </li><li> Überprüfen Sie, dass keine Luftblasen in den Spritzen gefangen sind, eine stabile Strömung zu gewährleisten. Entfernen Sie alle Luftblasen durch vorsichtiges paar Tropfen Flüssigkeit Ausstoßen aus der Düse. </li><li> Schließen Sie die Einlass Spritze Spitzen und Schläuche an die Spritzen und fügen Sie sie in die jeweiligen Einlässe der Vorrichtung (Hülle und Probeneingang). Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen entlang dem Schlauch sind. </li><li> Montieren Sie die Geräte auf einen Inverted Phasenkontrastmikroskop für die Echtzeitbildgebung während der Zellsortierprozess. </li><li> Sichern Sie sich einen kleinen Abfallbecher und zwei 15-ml-Röhrchen bei dem Gerät auf dem Mikroskoptisch unter Verwendung von Klebstoffen. </li><li> Die Austrittsschläuche in den Abfallbecher. </li><li> Stellen Sie den Stromverhältnis für die Probe zu Hülle Puffer bis 1:10 und starten die beiden Spritzenpumpen den Sortierprozess zu initiieren (Beispiel: 120 ml / min für die Probenspritze und 1200 ml / min für die Hülle Spritze; Kanalströmungsgeschwindigkeit ~ 0,38 m / sec ). </li><li> Führen Sie das Gerät für 1,5 min für die Strömungsgeschwindigkeit zu stabilisieren. Dies kann durch die Anwesenheit von inertially fokussierten Zellen in der Nähe der Kanalinnenwand unter Hellfeld mit Phasenkontrast mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (-: 10-50 us 10.000 Frames pro Sekunde (fps), Belichtungszeit ~ 5000) bestätigt werden. </li><li> Positionieren Sie die Austrittsschläuche in verschiedene Röhrchen, die die Eluenten aus der Zelle Auslass und Abfallausgang zu sammeln. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+technology+for+tracking+cells'+status+&amp;+function.">Aptamer technology for tracking cells' status &amp; function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).</li><li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+Regenerative+Medicine.">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li><li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+imaging+in+regenerative+medicine.">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li><li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles:+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation.">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li><li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotoxicity:+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity.">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li><li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates.">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li><li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1/Th2+immunity+and+strain+background.">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li><li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors.">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li><li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+metamaterials:+Microfabricated+arrays+to+steer,+refract,+and+focus+streams+of+biomaterials.">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis.">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li><li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices.">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li><li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis.">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li><li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+inertial+focusing,+ordering,+and+separation+of+particles+in+microchannels.">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li><li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics.">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li><li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li><li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams.">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li><li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures.">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826 (2013).</li><li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles.">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li><li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency.">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li><li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces.">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259 (2013).</li><li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics.">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li><li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference-free+Micro/nanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation.">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li><li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels.">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li><li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels.">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das DFF Zellreinigung hier beschriebene Technologie ermöglicht eine schnelle und kontinuierliche Trennung der markierten Zellen in einem Hochdurchsatz Weise. Diese Trennung Ansatz ist ideal für große Probenvolumen oder hohe Zellkonzentration Probenverarbeitung und ist besser als herkömmliche Membranbasis Filtration, die zu einer Verstopfung nach längerem Gebrauch anfällig ist. In ähnlicher Weise Affinität basierende magnetische Trennung erfordert eine zusätzliche Markierung von Zellen Schritte, die aufwendig un...

Zellen , die durch agenten geladen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist eine einfache, genomische Integration frei und vielseitige Methode zur Bioimaging - Fähigkeit zu verbessern und zu erweitern / Ergänzung seiner nativen therapeutischen Eigenschaften in der regenerativen Medizin - Engineering. 1-3 Cellular Modifikationen erreicht werden durch die Kennzeichnung Plasmamembran oder Zytoplasma mit einem Überschuss Konzentration des Mittels belasteten NPs die Bindungsstellen zu sättigen. Jedoch ist ein Hauptnachteil dieses Verfahrens , die signifikante Mengen an ungebundenen Partikel in Lösung verbleibt nach dem Zellmarkierungsverfahren, die möglicherweise eine genaue Identifizierung von partikel manipulierten Zellen vermengen können oder therapeutische Ergebnisse erschweren. 4,5 Zusätzlich Exposition gegen NPs enthält transformierende Mittel (Wachstumsfaktoren, Kortikosteroide, etc.) bei zu hoher Konzentration kann Zytotoxizität und misdirected Exposition verursachen unerwünschte Folgen auf nicht-Zielzellen induzieren kann. partikuläre Träger Selbst umfassend of &quot;biokompatibel&quot; Materialien [zB Poly (milch co-Glykolsäure), PLGA] kann auch potente Immunzell - Reaktionen unter bestimmten Bedingungen anstiften. 6 Dieses bei Personen mit eingeschränkter Immunität besonders riskant ist (zB rheumatoide Arthritis) , die möglicherweise Verzögerungen systemische Clearance Nanopartikels. 7 somit effiziente Entfernung von freien Teilchen vor der Einführung des partikel manipulierten Zellen ist von großer Bedeutung Toxizitätsprofil zu minimieren und misdirected Exposition gegenSubstanz beladenen Partikel in vivo reduzieren. Herkömmliche Gradientenzentrifugation wird oft zu trennen manipulierten Zellen von freien Teilchen verwendet, ist aber umständlich und im Batch-Modus betrieben werden. Darüber hinaus kann durch Zellen erfahrenen Scherspannungen während des hochtourigen Zentrifugation und die Bestandteile des Dichtegradientenmedium kompromittieren Integrität Zelle und / oder Beeinflussung des Zellverhaltens. 8 Microfluidics ist eine attraktive Alternative mit sevrere Trenntechnologien einschließlich deterministische seitliche Verschiebung (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 und acoustophoresis 12 kleine Partikel Trennung und Pufferaustausch - Anwendungen entwickelt wurde. Jedoch leiden diese Methoden von geringem Durchsatz (1-10 &amp; mgr; l · min - 1) und sind anfällig für Probleme zu verstopfen. Aktive Trennungen wie Dielektrophorese-basierten Verfahren benötigen auch Unterschiede in der intrinsischen dielektrophoretischen Zellphänotypen oder zusätzliche Zellmarkierungsschritte zur Trennung erzielen. Ein vielversprechender Ansatz beinhaltet Trägheits Mikrofluidik - die seitliche Wanderung der Partikel oder Zellen über rationalisiert an bestimmten Positionen durch dominante Auftriebskräfte (F L) bei hohen Reynolds - Zahl (Re) 13 Aufgrund der hohen Strömungsverhältnisse und überlegene Größe Auflösung zu konzentrieren. ist es oft für größenbasierte Zellseparation 14,15 und Pufferaustausch - Anwendungen genutzt werden . 16-18 However, Pufferaustauschleistung bleibt mit ~10-30% Verunreinigung Lösung schlecht wie die getrennten Zellen in der Regel zwischen ursprünglichen und neuen Pufferlösungen an die Grenze dicht bleiben. 16-18 Noch wichtiger ist , hat auf die Größenverteilung von Zielzellen ähnlich sein zu erreichen , präzise Trägheits Fokussierung und Trennung von der ursprünglichen Pufferlösung , die ein Problem insbesondere bei der Verarbeitung von heterogenen großen Zelltypen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs) darstellt. 19 Wir haben bereits eine neue Trägheits Mikrofluidik Zellsortierung Technik bezeichnet Dean Flow Fractionation (DFF) zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) 20 und Bakterien 21 aus Vollblut unter Verwendung eines 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanalgerät entwickelt. In diesem Video-Protokoll, werden wir den Prozess der Etikettierung THP-1 (humane akute monozytäre Leukämie-Zelllinie) Suspension monozytären Zellen (~ 15 &amp; mgr; m) und MSCs (10-30 &amp; mgr; m) mit Calcein-l beschreibenoaded NPs, gefolgt von der Herstellung und dem Betrieb der DFF Spiralmikrovorrichtung zur effizienten Rückgewinnung von markierten Zellen und das Entfernen von ungebundenem NPs. 22 Diese einstufigen Reinigungsstrategie ermöglicht eine kontinuierliche Rückgewinnung von markiertem Suspension und haft in frische Pufferlösung ohne Zentrifugation suspendierten Zellen. Darüber hinaus kann es bis zu 10 Millionen Zellen verarbeiten · ml -1, eine Zelldichte zugänglich für die regenerative Medizin - Anwendungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Cell lines &#38; Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">THP-1 monocyte cells (THP-1)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Name</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Reagents &#38; Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">0.01% poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">3 mL Syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">302113</td>
			<td>Syringe 3ml Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">60 ml Syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td>Syringe 60ml Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:127px;">Biowest</td>
			<td style="width:119px;">P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Calcein, AM (CAM)</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Calcein</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">#P/7507/17</td>
			<td>HPLC Grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516Q/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FIS#12-550D</td>
			<td>75 X 25 X 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:127px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:127px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">21200702044</td>
			<td>18mm x 25m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Silica NPs (&#8764;200 &#956;m)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">748161</td>
			<td>Pore size 4 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Syringe Tip</td>
			<td style="width:127px;">JEC Technology</td>
			<td style="width:119px;">7018302</td>
			<td style="width:167px;">23GA .013 X .25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:127px;">Spectra-Teknik</td>
			<td style="width:119px;">06419-01</td>
			<td>.02X.06&#34; 100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:368px;">Name</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:127px;">Harris Uni-Core</td>
			<td>69036-15</td>
			<td>1.50 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dessicator</td>
			<td style="width:127px;">Scienceware</td>
			<td style="width:119px;">111/4 IN OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">High-speed Camera</td>
			<td style="width:127px;">Phantom&#160;</td>
			<td style="width:119px;">V9.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Inverted phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:127px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:127px;">Chemyx</td>
			<td style="width:119px;">CX Fusion 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic buffer exchange for interference-free micro/nanoparticle cell engineering

Engineering-Zellen, die mit wirkstoffbeladenen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist ein zunehmend beliebte Methode nativen therapeutischen Eigenschaften zu verbessern, Bio-Bildgebung ermöglichen und Zell-Phänotyp steuern. Eine kritische noch unzureichend angesprochen Problem ist die beträchtliche Anzahl von Teilchen, die nach der Zellmarkierungs ungebunden bleiben, die nicht leicht durch herkömmliche Zentrifugation entfernt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der bio Abbildungshintergrundrauschen und transformierende Wirkung auf benachbarte Nicht-Zielzellen vermitteln. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie bezeichnet als Dean Flow Fractionation (DFF), um effizient markierten Zellen von freien Nanopartikeln in einem hohen Durchsatz Weise trennen. Die entwickelte Spiralmikrovorrichtung ermöglicht eine kontinuierliche Sammlung (&gt; 90% Zell recovery) von gereinigten Zellen (THP-1 und MSCs) in neue Pufferlösung suspendiert, während&gt; 95% Abreicherung von ungebundenen Fluoreszenzfarbstoff zu erreichen oder farbstoffbeladenen NPs (silica oder PLGA). Dieses einstufige, größenbasierte Zellreinigungsstrategie ermöglicht hohe Zellverarbeitungsdurchsatz (10 6 Zellen / min) und ist sehr nützlich für die großvolumige Zelle Reinigung von Mikro- / Nanopartikel - Zellen entwickelt , störungsfreie klinische Anwendung zu erzielen.

Nach der Markierung NPs die Zellen mit Bio - Bildgebungsmittel beladene über Nacht, die markierten Zellen (die freie Teilchen) werden geerntet und gereinigt durch DFF Spirale Mikroeinrichtung zum freien NPs in einem einstufigen Verfahren (1A) zu entfernen. Der 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanal wird durch Engineering-Software entwickelt und mikro Su-8 verwenden. Die strukturierte Silizium - Wafer wird dann als Vorlage für die PDMS Replik Formen mit weichen Lithograp...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering at JoVE.com

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen.

Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

microfluidic-buffer-exchange-for-interference-free-micronanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Aufrufe.  Nanyang Technological University.  Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen. 

Serie: Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Systematische Analyse von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video