Unser Protokoll beschreibt ein hochauflösendes Mikromahlverfahren zur Herstellung eines mikrofluidischen Acrylgeräts zur quantitativen Immundetektion von Analytkonzentrationen, die mit der Goldstandard-ELISA-Technik vergleichbar sind. Das Highlight ist die Herstellung eines einfachen und kostengünstigen thermoplastischen mikrofluidischen Gerätes ohne Reinraum, das kürzere Assay-Zeiten und qualitativ gute Nachweisgrenzen ermöglicht. Beginnen Sie mit dem Oberflächenschleifen.
Schneiden Sie 9 x 25 Millimeter Rechtecke aus 1,3 Millimeter dickem PMMA mit dem 800 Mikrometer großen Schaftfräsermeißel. Befestigen Sie eines dieser Rechtecke vorsichtig mit doppelseitigem Klebeband an der piezoelektrischen Plattform. Schließen Sie den Z-Sensor an und platzieren Sie ihn auf der Oberfläche des PMMA-Rechtecks.
Wählen Sie den Erkennungsstift aus und bewegen Sie ihn über die Sensoroberfläche. Senken Sie den Stift manuell ab, ohne den Sensor zu berühren. Aktivieren Sie den Z-Null-Erkennungsmodus.
Drehen Sie den 200-Mikrometer-Schaftfräser bei 14, 500 U/min. Senken Sie es langsam auf die Ursprungskoordinate auf der z-Achse. Setzen Sie dann die z-Achse 30 Mikrometer unter dem Ursprung zurück.
Legen Sie diese Koordinate als neuen Z-Ursprung fest. Klicken Sie in der Mikrofräsmaschinensoftware auf die Schaltfläche Schneiden, um das Schnittfeld zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen und wählen Sie die TXT-Datei mit einem zuvor erstellten Code zum Schleifen der Acryloberfläche aus.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgabe, um den Vorgang zu starten. Für das Fräsen der Fünf-Mikrometer-Beschränkung stellen Sie zunächst die Drehzahl des Schaftfräsers auf 11.000 U/min ein. Heben Sie dann die Plattform mit der Schnittstelle der piezoelektrischen Plattform um 6,5 Mikrometer an.
Bewegen Sie den Schaftfräser um 500 Mikrometer entlang der y-Achse. Setzen Sie die piezoelektrische Plattform mit der Steuerschnittstelle auf ihren Anfangswert auf der z-Achse zurück. Führen Sie als Nächstes das Fräsen von Mikrokanälen durch, indem Sie die zuvor erstellte Designdatei aus der Konstruktionssoftware öffnen.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Drucken, rufen Sie das Eigenschaftenmenü auf und klicken Sie auf das Farbfenster, das der Schicht entspricht, die das zu bearbeitende Design enthält. Legen Sie die Fertigungsparameter im Werkzeugfeld fest. Für das Fräsen von Löchern wechseln Sie zum 800-Mikrometer-Schaftfräser.
Aktivieren Sie die Designschicht der Bohrungen mit 1,2 Millimeterdurchmesser, indem Sie auf das entsprechende Farbfenster klicken und die entsprechenden Fertigungsparameter auswählen. Bearbeiten Sie zwei zusätzliche Löcher an kontralateralen Ecken des Rechtecks für die umgekehrte Ausrichtung des Acryls auf einer neuen Plattform. Drehen Sie das Acryl um und kleben Sie es mit doppelseitigem Klebeband über den Adapter mit den bearbeiteten Säulen.
Öffnen Sie die Datei mit dem Entwurf der Löcher für die gegenüberliegende Fläche aus der Konstruktionssoftware. Fräsen Sie die restliche Hälfte der Reagenzein- und -austrittslöcher mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern und einer Tiefe von 0,7 Millimetern. Reinigen Sie beide Acryl-Rechteckplatten mit Isopropylalkohol und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab.
Tauchen Sie das Acryl für 10 Minuten in ein Ultraschallbad. Trocknen Sie beide Acrylplatten und kleben Sie sie mit doppelseitigem Klebeband auf die Innenseite eines Glas-Petrischalendeckels. Legen Sie dann den Boden der Glas-Petrischale in eine größere Glas-Petrischale.
Gießen Sie einen Milliliter Chloroform in den Boden der Petrischale und platzieren Sie schnell den Deckel mit den Acrylplatten. Fügen Sie sofort destilliertes Wasser auf den Boden der größeren Petrischale bis zur Höhe des Petrischalendeckels hinzu. Lassen Sie das Acryl eine Minute lang Chloroformgas einwirken.
Kippen Sie dann die Petrischale, um die Wasserdichtung zu brechen, und legen Sie die Petrischale sofort frei. Zur Verklebung richten Sie beide Acrylfarben mit den Chloroform-exponierten Seiten von Angesicht zu Angesicht aus und bilden Sie ein Sandwich. Legen Sie die Acrylfarben für zwei Intervalle von zwei Minuten in die Presse und ändern Sie die Ausrichtung des Acryls.
Befestigen Sie dann zwei bis drei Zentimeter Schlauch an jedem der Löcher des Geräts mit sofort trocknendem Flüssigkleber. Füllen Sie die Kanäle mit destilliertem Wasser mit einer Spritze. Tauchen Sie das Gerät für 10 Minuten in ein Ultraschallbad.
Entleeren Sie dann das Wasser in den Gerätekanälen und verwenden Sie eine Spritze, um 5% BSA-Lösung einzuführen. Bereiten Sie eine Suspension von Eisenmikropartikeln mit einem Durchmesser von 7,5 Mikrometern in 5% BSA vor. Inkubieren Sie den Chip und die Mikropartikelsuspension mit der Blockierlösung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur.
Als nächstes führen Sie die Mikropartikel mit einer Spritzennadel durch den Seitenkanalauslassschlauch in den Chip ein. Platzieren Sie den Chip vertikal und drehen Sie ihn dann in zwei Schritten von 90 Grad, so dass die Mikropartikel auf die Beschränkung von fünf Mikrometern abzielen und sich verdichten. Versiegeln Sie alle Schläuche des Acrylgeräts mit Hitze.
Schneiden Sie den Einlassschlauch ab, bis nur noch wenige Millimeter übrig sind. Füllen Sie die Dosiernadel mit Waschpuffer und führen Sie sie in den geschnittenen Schlauch ein. Lassen Sie die Lösung tropfen und verbinden Sie dann die Nadel mit dem Gerät.
Schneiden Sie den Auslassschlauch vom seitlichen Kanal ab und schließen Sie ihn dann an die Spritzenpumpe an. Wiederholen Sie als Nächstes den gleichen Vorgang für den Hauptkanalauslassschlauch. Befestigen Sie dann den Chip am Magneten.
Zur Immundetektion lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang bei 50 Mikrolitern pro Stunde fließen. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel und fügen Sie 50 Mikroliter der Nanopartikelsuspension hinzu. Lassen Sie die Nanopartikelsuspension sieben Minuten lang mit einer Durchflussrate von 100 Mikrolitern pro Stunde fließen.
Ändern Sie dann die Durchflussrate auf 50 Mikroliter pro Stunde und setzen Sie den Durchfluss für weitere 15 Minuten fort. Wechseln Sie die Dosiernadel und lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang mit der gleichen Geschwindigkeit fließen. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel und fügen Sie 100 Mikroliter des fluorogenen Substrats hinzu.
Passen Sie die Durchfluss- und Zeitparameter für Substrateingang, Fluoreszenzmessung und Waschschritt an. Aktivieren Sie den Eingangsfluss des fluorogenen Substrats für sechs Minuten bei 50 Mikrolitern pro Stunde. 15 Sekunden bevor der Substratfluss stoppt, schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops ein.
Starten Sie die Bildaufnahme mit der Software der Mikroskopkamera 10 Sekunden vor dem Stopp des Substrats mit einer Belichtungszeit von 1.000 Millisekunden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des gewünschten Durchflussparameters unmittelbar nach Beendigung der Substratwäsche. Führen Sie sechs Minuten lang Bilder mit einem Bild pro Sekunde durch.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des Waschstroms, unmittelbar nachdem der ausgewählte Messfluss gestoppt wurde. Für den Immunoassay wurden Lysozym-konjugierte Nanopartikel und Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper verwendet. Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität für verschiedene Konzentrationen von primären Antikörpern wurde beobachtet, wenn Regionen vor und nach der Falle verglichen wurden, was zeigt, dass die Änderung der Substratfluoreszenz direkt proportional zur Konzentration des primären Antikörpers ist.
Für eine gegebene Konzentration von primären Antikörpern wurde die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit bei verschiedenen Flussraten des fluorogenen Substrats aufgetragen. Die Umwandlungskapazität des Substrats durch das HRP-Enzym war umgekehrt proportional zur Durchflussrate, eine maximale Intensität wurde für eine Durchflussrate von einem Mikroliter pro Stunde erreicht. Für die unterschiedlichen Flussraten für verschiedene primäre Antikörperkonzentrationen zeigten Kurven der Fluoreszenzdifferenzen nach und vor der Immunreaktion, dass bei einer Konzentration von 1.000 Nanogramm pro Milliliter die Fluoreszenz für alle ausgewerteten Flussraten gesättigt ist.
Es wurde eine Kalibrierkurve unter Verwendung des Maximalwerts der Unterschiede in der Fluoreszenzintensität erstellt, die in Bezug auf die Konzentration des primären Antikörpers für jede Flussrate erhalten wurden. Die hohe Variabilität und der hohe Fluoreszenzgehalt bei einem Mikroliter pro Stunde deuten darauf hin, dass die Rate den Fluss des reagierenden Substrats nicht begünstigt und dazu neigt, sich kurz nach der Falle anzusammeln. Besonderes Augenmerk sollte auf die Versiegelungsschritte der Mikrokanäle gelegt werden, da die Exposition gegenüber Chloroform sehr temperaturempfindlich ist.
Für reproduzierbare Ergebnisse muss die Temperatur immer gleich sein. Unser System hilft zu verstehen, wo Kompaktheit und Größe von Mikropartikeln, Nanopartikelgröße, Antigene, Detektionsantikörper und Substrat bestimmende Faktoren für die Nachweisgrenze im nanopartikelbasierten mikrofluidischen Immunoassay sind.
