Name: automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software
Uploaded: 2016-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software at JoVE.com

Celest desarrollo fue apoyado por el NIH subvenciones R21AG027513 y U01AG045864. Algunas representaciones de vídeo cortos de datos y se han adaptado de Restif et al. (2014) 8, que fueron publicados bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Agradecemos a Ricardo Laranjeiro ayuda manuscrito.

1. El crecimiento de los nematodos y manipulación <ol><li> C. elegans crecer en placas de Petri que contenían estándar NGM manchado con OP50-1 Escherichia coli como fuente de alimento 1-3. </li><li> Mantenga culturas en una incubadora que mantiene la temperatura deseada. C. elegans crece bien de 15 a 25 ° C, con 20 ° C siendo la temperatura de crecimiento estándar. NOTA: La natación es un fenotipo robusta, sin embargo nadar vigor puede verse afectada por factores ambientales como la contaminación en las placas y el sobrecalentamiento de las culturas y las diapositivas. debe hacerse un gran esfuerzo para mantener condiciones estables. </li><li> Usar un pico nematodo casera hecha de un alambre de platino llama sellada en una varilla de vidrio para manejar la transferencia de los animales individuales 4. </li></ol> 2. Puesta en funcionamiento para el Análisis de la nadada <ol><li> Utilizar un sistema integrado que consiste en un microscopio estereoscópico, cámara digital CCD y el software de grabación de vídeo digital. El software de CA Célestn ser utilizado en un equipo independiente. <ol><li> Cubra el microscopio con un paño oscuro (por ejemplo, fieltro) para evitar el deslumbramiento en el área de colocación de natación en el portaobjetos de un microscopio y mejorar la calidad de la imagen. </li><li> Ajustar la distancia de trabajo del microscopio y la ampliación de la vista de la zona de baño, y el espejo de base para obtener agudo contraste de los animales contra el fondo. Ajuste la iluminación de campo oscuro para visualizar los cuerpos de los adultos como blanco contra el fondo negro, que funciona muy bien para la visualización computacional y el seguimiento con el software de análisis de natación. </li><li> Tenga cuidado de mantener el área de trabajo, portaobjetos de microscopio, y nadar caer muy limpio. Los desechos pueden interferir con el análisis mediante la oclusión de la natación libre de los adultos, y de finos hilos de fibra puede ser detectada como actora animales durante el seguimiento. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de los animales para el análisis de la condición física en Líquido <ol><li> Pipeta de 60 l Otampón f 1x M9 en un anillo de 10 mm preimpreso sobre un portaobjetos de microscopio. Asegúrese de que la caída cubre por completo la zona interior del anillo. El software extrae más información natación uso de este tamaño de gota contenida en un portaobjetos de lo que sería si la utilización de placas de múltiples pocillos. </li><li> Recoger nematodos adultos individuales y transferirlos a la caída de tampón 1x M9, reduciendo al mínimo el transporte de bacterias que pueden enturbiar el líquido. Reducir al mínimo las bacterias colocando primero los animales para su transferencia a un lado de la placa que no contiene mucho césped bacteriano, dejando que se arrastran, y luego suavemente levantándolos. <ol><li> Cuando la transferencia de los nematodos en la gota, utilizar un microscopio de disección cerca de la estación de análisis para reducir la duración del tiempo de natación, que puede afectar el comportamiento de los animales 25. </li><li> Coloque sólo 4 adultos en la gota si se mueven vigorosamente y se cruzan a menudo. Como orientación para minimizar la superposición de los nadadores (que confunde el análisis computacional), considerar la colocación de4 animales por caída cuando son tan activos como los adultos jóvenes sanos, WT y 5 animales por caída cuando son más grandes y muestran menos vigor. NOTA: nematodos WT saludable instinto empiezan a nadar poco después de ser colocado en un líquido. Con la ayuda de un pick nematodo, separar suavemente los adultos en el descenso si se amontonan. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de la Condición Física en líquidos - Grabación de vídeo de Natación <ol><li> Coloque el portaobjetos cargado con los adultos sobre la base del microscopio para grabar su natación. 30 s detalles de captura de videos de la conducta de un animal individual en líquido (Video 1), y toma de muestras de un gran número de tales registros se logra fácilmente cuando con la ayuda de software de Celest 8,26; sin embargo, ya nadan períodos pueden ser ideal para otros estudios de comportamiento específicos 25. Es importante destacar que, asegúrese de mantener el mismo aumento a lo largo de todas las grabaciones ya que las diferencias de aumento afecel análisis y la comparación de natación t sesgo voluntad. NOTA: Estos pasos se proporcionan como orientación usando el software de grabación de vídeo digital que aparece en la Tabla de Materiales; software de acceso abierto VirtualDub podría sustituir, aunque no hemos probado esto. <ol><li> Utilice los siguientes parámetros como guía para el análisis de natación éxito: tamaño de la imagen de 696 x 520 píxeles, resolución de imagen de 0,02 mm / pixel, y una tasa de 18 frames / s. Versiones de mayor resolución de estos ajustes pueden facilitar el seguimiento pero no afectará a las medidas calculadas por el programa. NOTA: La zona de natación proporcionado por la caída de 60 l de tampón 1x M9 en el portaobjetos de microscopio no tiene mucha profundidad, lo que minimiza hacia arriba y hacia abajo movimiento de natación. </li></ol></li><li> En Configuración, vaya a &#39;Grabación&#39;, set &#39;Secuencia límite de tamaño &quot;a&quot; 545 marcos en el disco&#39;. En la misma partida, marque la casilla &#39;Usar Recording Manager&#39;. Haga clic en &quot;Editar recor actualguión ding ... &quot;botón, y bajo &#39;Comandos&#39;, seleccione &#39;Frame Grab&#39;, y bajo condiciones de parada &#39;&#39;, introduzca &#39;parada después de 0: 00: 30.00&quot;. </li><li> Para grabar, seleccione &quot;Nueva secuencia en la memoria RAM &#39;bajo el título principal y oprima el botón&#39; Record &#39;rojo. El software se agarra 545 marcos de más de 30 s con la cámara digital y los mantienen en la memoria RAM. </li></ol> 5. Análisis de la condición física en líquidos - Tratamiento de vídeo <ol><li> Fragmentar el video en una secuencia de cuadros de imagen haciendo clic en el encabezamiento principal y seleccionando &#39;secuencia completa Exportar a ... &quot;en el software de grabación de vídeo. NOTA: El software de grabación de vídeo digital puede guardar los fotogramas como .bmp, .jpg, .tif, o .png, todo lo cual puede ser leído por el programa de análisis de natación que aquí se presenta. Tenga en cuenta que los archivos .tif utilizan más espacio de almacenamiento, pero algunos formatos como .jpg pueden degradar la calidad de imagen. </li><li> Poner en marcha el programa de análisis de natación desde MATLAB by hacer clic en el botón de ejecución. </li><li> En la pantalla principal del programa de análisis de nadar, utilizar el &quot;Añadir un vídeo&quot; o &quot;Añadir varios vídeos &#39;botones para cargar secuencias de cuadros de imagen de uno en uno o en grupos, mientras que sujetan las etiquetas pertinentes, tales como el genotipo, la fecha, el juicio y la duración . El software crea una base de datos de las secuencias marcadas. </li><li> Habilitar el seguimiento simultáneo de múltiples animales en las secuencias subidas haciendo clic en &#39;1. Proceso de vídeos &#39;. En la nueva pantalla, seleccionar los vídeos que desee en el cuadro de la izquierda y haga clic en &quot;Añadir a la lista &#39;. Para cada vídeo, haga clic en su nombre en la lista de arriba a la derecha para mostrar la primera imagen del vídeo en la parte inferior derecha. Demarcar la zona de la piscina mediante la selección de 3 puntos en el interior del anillo, e iniciar el procesamiento haciendo clic en &quot;Proceso de todos los vídeos que aparecen más arriba &#39;. Ver el progreso del procesamiento en la parte inferior central. </li><li> Una vez completado, &quot;Cerrar&quot; la pantalla de procesamiento de vídeo. </li></ol> 6. Análisis de la Condición Física en líquidos - Medición <ol><li> Haga clic en &quot;2. medidas de cómputo &#39;para abrir una nueva pantalla en la que se pueden subir los vídeos procesados, uno a la vez, para validar o rechazar el seguimiento de animales individuales. Los vídeos que se han procesado aparecerán en la lista de la izquierda, donde el nombre del vídeo se puede hacer clic para cargar ese video. </li><li> Utilice este paso manual para centrarse en las áreas de seguimiento (bloques rojos) perdidas en contraste con el seguimiento de éxito (bloques verdes). NOTA: Como alternativa, se puede confiar en la salida automatizado de seguimiento válido ya que el software tiene un estricto sistema de seguimiento (94,1% validez como se observa en 2.020 animales de 404 vídeos 8). <ol><li> Encuentra la «validez del cuerpo segmentado &#39;en la primera barra de color a través de la pantalla en la mitad inferior. El porcentaje de &quot;marcos válidos &#39;está en verde, y el porcentaje de tramas rechazadas&#39; &#39;está en rojo. ≥80% de tramas válidas que implica el seguimiento informaciones utilizado para calcular las medidas proviene de al menos 432 marcos de cada 540 en unos 30 s nadar ensayo registrado a 18 frames / s. </li><li> Fácil de navegar y modificar los bloques de validez / rechazado marcos que utilizan el &#39;siguiente bloque&#39;, &#39;Cambiar validez &quot;,&quot; bloque de Split&#39;, y las opciones de &#39;frame&#39; Aislar. En el raro caso de que 2 animales se cruzaron en una zona de baño con poca gente, cambiar su número de identificación en un intervalo de trama específico con el botón &#39;Cambiar&#39;. </li><li> Ver los gráficos de barras en la mitad inferior de la pantalla para obtener información adicional sobre el seguimiento y las actuaciones que se solapan. La longitud del cuerpo segmentado (de animales longitud del cuerpo por trama) se correlaciona con la incidencia superpuestas. </li></ol></li><li> Si ningún puntos brillantes en el video interfieren con el análisis, ajuste áreas brillantes en la zona de la piscina mediante la selección de la función de las «zonas de deslumbramiento. </li><li> Haga clic en &quot;Guardar y medidas Calcular &#39;para guardar la entrada de validez antes de que acabecargar otro de vídeo procesada. En esta etapa el software calcula, en el fondo (que no se muestra al usuario), mapas de curvatura de la rendimiento de la natación de los animales individuales y los parámetros indicados a continuación (Video 2). NOTA: Los parámetros medidos que se centran en que aquí se describen en la Tabla 1. La tasa de iniciación de la onda, número de la onda del cuerpo, la asimetría, estiramiento, y curling se calculan sobre la base de los mapas de curvatura que el software calcula para los animales; la velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad parámetros no están basados ​​en mapas de curvatura. </li><li> Haga clic en &quot;Cerrar&quot; para salir de la pantalla &#39;&#39; Calcular medidas. </li></ol> 7. Análisis de la Condición Física en líquido - Salida de los resultados Nota: El software puede informar sobre múltiples medidas del movimiento de natación, que abarcan desde manifiestos a muy sutiles rasgos de comportamiento no anotados fácilmente por el ojo (Videos 3 y 4). Aquí elatención se centra en 8 parámetros que suelen mostrar un buen rango dinámico: Onda tasa de iniciación, número de la onda del cuerpo, la asimetría, Stretch, Curling, Velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad. <ol><li> En la pantalla principal del programa, haga clic en &quot;3. Mostrar resultados &#39;para obtener el resultado del análisis. </li><li> Crear grupos de la muestra para el tratamiento estadístico mediante la selección de las secuencias analizadas deseados de marcos en el cuadro de la izquierda y su traslado a un grupo de muestra nueva o existente haciendo clic en los botones &#39;Añadir a la muestra seleccionada&#39; o &#39;Añadir a la nueva muestra. </li><li> Haga clic en &quot;mostrar gráficas de estas muestras &#39;para ir a una segunda pantalla que muestra los gráficos y estadísticas clave de las muestras para cada uno de los 8 parámetros de selección en la parte superior de la pantalla. <ol><li> Si lo desea, ajuste la representación de los gráficos de barras en la parte superior izquierda de la pantalla utilizando los &#39;Colores&#39;, &#39;# de histogramas&#39; y &#39;#&#39; de gusanos selectores. </li></ol></li><li> Utilizar&#39;&#39; Histogramas 2D para trazar combinaciones de cualquiera de los dos parámetros a través de la &#39;medida en el eje X&#39; y &#39;Medida en el eje Y&#39; menús desplegables a la izquierda de la pantalla. Haga clic en &quot;Cerrar&quot; para salir y regresar a la pantalla &quot;Mostrar resultados&quot;. </li><li> Utilice el &quot;Exportar ...&quot; botón en la parte superior izquierda de la pantalla para guardar los datos numéricos detallados como archivo .csv para abrir y manipular aún más en un programa de hoja de cálculo. </li><li> pantalla &#39;Cerrar&#39; &#39;los resultados de visualización&#39; para volver a la pantalla principal y haga clic en &quot;Salir&quot; para garantizar el ahorro de la base de datos que contiene las secuencias de vídeo analizados. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El uso de C. elegans como sistema modelo sigue aumentando debido a su maleabilidad genética, la trazabilidad y la anatomía experimental anotadas, en detalle meticuloso. Por ejemplo, la estructura neuronal y la conectividad de la C. elegans hermafrodita está claramente trazaron 34-36, facilitando enormemente la investigación de los circuitos neuronales específicos que controlan conductas particulares. 302 neuronas constituyen el sistema nervioso del adulto hermafrodita, que procesar una amplia gama de entradas sensoriales en salidas de comportamiento básicas como la locomoción. La estructura del sistema nervioso más complejo masculina también se ha descrito 37, lo que permite circuitos sexo-específicas que deben abordarse. 37 C. elegans comportamiento ha sido ampliamente estudiado en placas de cultivo estándar que contienen medio sólido. Desde WT C. elegans se mueve en ondas sinusoidales previsibles en las placas de agar-llenado, las desviaciones de lapatrón general puede ser detectada por el ojo y obtuvo manualmente. Este enfoque, sin embargo, está sujeta a criterio del experimentador y mucha mano de obra. Herramientas de hardware y software diseñados para rastrear y medir C. elegans locomoción en medios sólidos eliminar el sesgo de subjetividad y permite estudios a gran escala, lo que permite cuestiones biológicas más sofisticados que deben abordarse. La base de datos del comportamiento reciente creado por el laboratorio Schafer 16 es un excelente ejemplo de la extensión y profundidad de análisis que se ha logrado con un sistema computacional para la locomoción en los platos. Cuando WT C. elegans se coloca en forma líquida, el animal se adapta rápidamente su movimiento al nuevo entorno, iniciando un baño. C. elegans natación utiliza un mayor rango de movimiento que se arrastra y puede ser más irregular 8. Software como Célest pretende llenar el hueco para el análisis detallado de C. elegans comportamiento en estado líquido, permitting cuantificación de parámetros de movimiento asociado a que no se miden fácilmente por el ojo de la ONU con ayuda de, o que se pueden lograr con mayor rapidez que la calificación manual. En 8 h dura un individuo puede procesar hasta 200 videos, ~ 1.000 registros por día. El software define parámetros que evalúan la natación que sirven como una huella digital completa de la condición física y el comportamiento. Además de enriquecer la comprensión de las complejas facetas de C. elegans comportamiento en el líquido y sus vías moleculares subyacentes, este software puede ser utilizado para explorar varios aspectos de la biología incluyendo respuestas farmacológicas, el envejecimiento, y el comportamiento distintos. Que aquí se presenta, el resumen de los cambios cuantificados que se producen en el rendimiento físico de C. elegans adultos, ya que la edad es un ejemplo de tal aplicación del software (para una descripción más detallada, ver Restif et al. 8). En el contexto del envejecimiento, algunos parámetros medidos disminuyeron mientrasotros aumentaron o no cambiar constantemente de tipo salvaje. Las tendencias se confirmaron en gran medida por el perfil de cálculo de los mutantes de la longevidad, y los perfiles relativos de cohortes ager agraciado y malos de las poblaciones de la misma edad mantenidos en condiciones ambientales uniformes. La alta resolución del software también puede revelar fenotipos sutiles previamente desconocido en los mutantes ampliamente caracterizados (por ejemplo, la edad-1 (hx546) en la Figura 1). Hay algunos pasos particularmente críticos del protocolo descrito. El mantenimiento de un ambiente de temperatura constante entre el entorno de la piscina y el cultivo en placa de presión es importante para la reproducibilidad de natación, por lo que los experimentadores se les anima a ir a grandes esfuerzos para evitar los cambios de temperatura al azar. medios de natación deben estar a la misma temperatura que las placas. Del mismo modo, una cuidadosa atención al tamaño de la gota para el nado ayudará a asegurar la reproducibilidad. Por último, es prudente pensar enavanzar sobre la descarga de los archivos de video grandes que se acumulan. Se recomienda el procesamiento de imágenes en un sitio aparte del equipo de captura de vídeo. El uso del software que aquí se presenta para el análisis de baño tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, si bien los programas pueden rastrear simultáneamente múltiples animales, si hay más de cinco animales se analizan en conjunto, hay una mayor probabilidad de que los animales van a nadar a través de uno al otro en las imágenes de vídeo. Cuando el programa no puede determinar de forma inequívoca qué animal era que, según censura esas tramas de datos. Aunque esta característica programa asegura que los datos de los animales individuales son de alta calidad, que limita el rendimiento. En segundo lugar, las imágenes deben ser bastante limpio, que está libre de polvo, manchas y resplandor de las luces, como señales asociadas también pueden confundir el análisis de imágenes. Como se ha señalado en la sección 2.1.1 de protocolo, una inversión muy baja tecnología que puede ayudar en gran medida la captura de imágenes mediante la eliminación de las complicaciones con las fluctuaciones in ambiental de la iluminación es para cubrir el área del escenario con una tela oscura que no permite que la luz ambiente para llegar a la etapa. En tercer lugar, el programa está optimizado para los animales en la etapa adulta. Joven larvas nadan muy rápido y tienen cuerpos pequeños, lo que aumenta error del programa. En cuarto lugar, algunos de los software utiliza MATLAB, y cuando hay actualizaciones de versiones y / o actualizaciones del sistema operativo, algunos enlaces de programa puede ser interrumpido. Actualmente, el software está optimizado para su uso en MATLAB 2015b y Mac OS versión 10.10, pero esperamos pronto para publicar una versión de software que es más robusto frente a tales cambios. Por último, los archivos de datos de vídeo pueden llegar a ser grandes rápido, y requieren espacio de almacenamiento que ha de adjudicarse. En resumen, se presenta aquí es una metodología sencilla que se puede implementar fácilmente por cualquier laboratorio sin mucha inversión para crear vídeos de C. elegans que nadan para el análisis Célest. Características del paquete de software incluyen una amplia automatización de seguimiento a través deanálisis, el seguimiento de múltiples animales simultánea, y el uso de bases matemáticas (es decir, medidas de curvatura) para la cuantificación de la mayoría de los parámetros de locomoción. El software es de código abierto, con código y demos a disposición del público como se detalla en Restif et al. 8. A pesar de que el programa cuenta con el análisis de la visión por ordenador avanzado de búsqueda, otros sistemas de seguimiento publicado (por ejemplo, Greenblum et al., 2014 38) son compatibles con el análisis de parámetros del software que aquí se presenta. Futuras mejoras serán dirigidos hacia convertir el software en un paquete más robusto que no restringe el uso de las versiones específicas de los sistemas operativos mencionados anteriormente (también indicados en la Tabla de Materiales).

Definiendo cómo el comportamiento de la genética, la epigenética, la experiencia y la influencia ambiente es un reto importante en la biología moderna. Los modelos simples, genéticamente susceptibles que pueden ser computacionalmente rastreados y medidos pueden hacer contribuciones importantes para alcanzar esta meta. Los nematodo Caenorhabditis elegans es uno de estos modelos. El propósito de este artículo es demostrar cómo C. elegans natación locomoción pueden ser rastreados y se cuantifica para extraer información sobre ocho nuevas características con relevancia biológica. C. elegans tiene una vida útil relativamente corta de aproximadamente 2 - 3 w y un período reproductivo de aproximadamente 4 d a 20 ° C 1,2. En cultivos de laboratorio estándar, este nematodo microscópico se cultiva en placas de Petri que contenían Nematodo Medios de Crecimiento (NGM) que se propagan con una fuente alimentaria bacteriana 3,4. animales WT N2 se mueven activamente en las ondas sinusoidales elegantes en placas de agar-llenado; cambian rata movimientoes en itinerancia (búsqueda de alimento), la vivienda (navegación), o recuperándose de una comida (saciedad quiescencia inactivo) 5. Deterioro 6 ó 7-12 años de edad pueden alterar dramáticamente el movimiento de las placas. Los genes que modulan el comportamiento, Healthspan o el envejecimiento, se pueden caracterizar funcionalmente por análisis de C. elegans los patrones de movimiento o locomoción. Un enfoque para medir healthspan es clasificar adultos mayores en tres categorías (por ejemplo, A, B, y C) de acuerdo con su locomoción en placas, con la actividad física vigorosa ser de clase A y parálisis ser de clase C 7,8,13. Aunque tal clasificación cualitativa es útil para revelar las diferencias en la forma física, las categorías son amplias y sin límites claros y por lo tanto su puntuación está sujeto a sesgo del experimentador. Un número cada vez mayor de seguidores han elevado la objetividad, la sofisticación y la precisión del análisis del movimiento de C. elegansen medios sólidos de 14-18. C. elegans locomoción en placas se restringe principalmente al plano en el que el animal entra en contacto con la superficie sólida de los medios de comunicación. (C. elegans también puede inducir la exploración mediante el levantamiento de la cabeza del resto del cuerpo que todavía está en contacto con una superficie sólida, el posicionamiento del cuerpo en múltiples planos. Sin embargo, este comportamiento es inusual.) Cuando se coloca en un líquido, este nematodo inicia un movimiento ondulatorio, o la natación, que cuenta con más extenso movimiento dimensional, una mayor gama de velocidad y la profundidad de movimiento, y un aumento de la incidencia con la edad de movimiento anterior diferente a posterior en comparación con animales en superficies sólidas. Como un rápido análisis de la condición física y la respuesta al nuevo entorno, un experimentador puede colocar un animal individual en una gota de líquido y anotar la frecuencia de su cuerpo se dobla bajo el microscopio de disección. La grabación de vídeo puede facilitar scoring presentes y futuras de la natación el vigor de laanimal. Sin embargo, el enfoque manual de limitar el número de características que se pueden puntuar, y está totalmente restringido a punto de marcar un animal a la vez. La locomoción en líquido ha sido menos explorada de la locomoción en medios sólidos. De hecho, hay pocas opciones de software que son robustos y fáciles de implementar en el laboratorio para medir la locomoción en líquido 19-24. El software de Celest (C. elegans prueba de natación) ofrece simplicidad de uso y las medidas matemáticos basados en los datos que entregan (puntuaciones de curvatura) directamente relacionadas con la naturaleza del movimiento 8; (descripción detallada de las características y ventajas en Restif et al. 8). Además, el análisis computacional permite la elucidación de las características fenotípicas que son imposibles para el ojo humano a marcar. En este caso, los datos que ejemplifican la resolución de este método de análisis se presentan y un fácil de poner en práctica el protocolo para grabar pruebas de nado se describe para el análisis posterior Célest.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; WT (ancestral).</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Biosafety Level: BSL-1.</td></tr><tr><td>OP50-1 &lt;em&gt;Escherichia Coli&lt;/em&gt;&amp;nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Streptomycin resistant strain of OP50.&amp;nbsp; Biosafety Level: BSL-1.</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Printed Microscope Slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002</td><td>have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink</td></tr><tr><td>Nematode Growth Medium (NGM)</td><td>For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer, 1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>For 1 L: 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CeleST</td><td>Driscoll Lab, Rutgers University</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Swim Test</td><td>Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>www.mathworks.com/downloads</td><td>MatLab version 2015b (best)</td><td>The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn&#039;t be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn&#039;t need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mac OS</td><td>www.apple.com</td><td>Version 10.10</td><td>Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don&#039;t even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it&#039;s the operating system in our lab).</td></tr><tr><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transmitted Light Base</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>TLB 3.1</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)</td><td></td></tr><tr><td>Digital Video Recording Software</td><td>Norpix</td><td>Streampix Version 3.17.2</td><td></td></tr></tbody></table>

automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software

La disección de los circuitos neuronales y neuromusculares que regulan el comportamiento sigue siendo un reto importante en la biología. El nematodo Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un organismo modelo muy valiosa para ayudar a hacer frente a este reto, de inspirar enfoques tecnológicos, la construcción de la conectoma cerebro humano, de arrojar luz sobre realidad los conductores moleculares específicas de los patrones funcionales básicos. La mayor parte de los estudios de comportamiento en C. elegans se han realizado sobre sustratos sólidos. En forma líquida, los animales exhiben patrones de comportamiento que incluyen el movimiento en un rango de velocidades en 3D, así como los movimientos de partes del cuerpo, como un rizo posterior sin cambio de forma anterior, que introducen nuevos retos para la cuantificación. Las etapas de un procedimiento sencillo, y el uso de un software que permite el análisis de alta resolución de C. elegans nadar comportamiento, se presentan aquí. El software, llamado Celest, utiliza un programa informático especializado que realiza el seguimientovarios animales a la vez y proporciona nuevas medidas de C. elegans la locomoción en líquido (natación). Las medidas se basan en su mayoría en la postura de los animales y se basan en las matemáticas utilizadas en la visión por computador y reconocimiento de patrones, sin requisitos computacionales para el umbral de puntos de corte. La herramienta de software puede ser utilizado tanto para evaluar la destreza general nadar en cientos de animales de los ensayos pequeños lotes combinados y revelar nuevos fenotipos mutantes genéticos, incluso en bien caracterizados. La preparación de muestras para análisis con Celest es simple y de baja tecnología, lo que permite la adaptación de ancho por la comunidad científica. Por lo tanto, el uso del método de cálculo descrito aquí debe contribuir a la mejor comprensión de la conducta y circuitos de comportamiento en el modelo C. elegans.

Mediante el análisis de la locomoción en líquido (natación), fenotipos que no son fácilmente evidentes en medios sólidos (rastreo) pueden ser dilucidados. Para cuantificar la locomoción natación hemos desarrollado un software específico que mide diez nuevos parámetros de comportamiento natatorio 8. Los ocho más útil de estos parámetros se describen en detalle en la Tabla 1. Estos parámetros se denominan Wave tasa de iniciación, número de la onda del cuerpo, Asimétrico, estiramiento, Curling, Velocidad de desplazamiento, movimiento del cepillo, y el índice de actividad. Los estudios que ejemplifican el poder del software han definido el deterioro funcional de cientos de envejecimiento adultos con WT, fondos de comportamiento o de longevidad mutante 8, y han analizado el bien estudiado mutantes longevidad edad-1 (hx546) y daƒ-16 (mgDƒ50), los cuales albergan mutaciones que alteran la vía normal de señalización de la insulina. La edad-1 gen codifica para una phosphatidylinositide 3-quinasa (PIK3) Subunidad catalítica, y, cuando se alberga el hx546 mutación, provoca prolongación de la vida y la resistencia al estrés 27-29. El gen daƒ-16 codifica para un factor de transcripción forkhead cuadro de O (FOXO) que acorta la vida útil y deteriora la respuesta al estrés cuando se suprime 30-33. Ciertos parámetros de la natación como Wave tasa de inicio, la velocidad del viaje, del movimiento del cepillo y el índice de actividad disminuyó gradualmente con la edad, incluso en contextos genéticos favorables (Figura 1). De acuerdo con los conocimientos actuales, de larga vida con la edad (1) hx546 mutantes mostraron un rendimiento físico más vigoroso que WT en edades avanzadas y muy viejos. También como se había anticipado, de corta vida daƒ-16 (mgDƒ50) mutantes visualizan en peligro el rendimiento, especialmente a edades muy antiguas. Sorprendentemente, fue sólo bajo el escrutinio de la visión por ordenador y el paquete de Celest algoritmo matemático que el superiorendimiento de la natación r-1 de edad mutantes (hx546) era detectable en el inicio de la edad adulta. El hecho de que los resultados en mejora del rendimiento físico en la vida adulta temprana edad-1 (hx546) sugiere que esta mutación afecta el desarrollo normal y / o fenotipo de adultos jóvenes de una manera no apreciado anteriormente (Figura 1). Número de la onda del cuerpo, la asimetría, estirar y Curling parámetros mostraron una tendencia aumenta con la edad en el WT y el envejecimiento de los adultos mutantes (Figura 2). Curiosamente, el nivel de resolución del software reveló rasgos de comportamiento más finos como la simetría sostenido de mutantes a lo largo de su vida útil y la incapacidad de los viejos-16 daƒ mutantes extremas (mgDƒ50) edad-1 (hx546) para estirar y enroscarse en la medida en la misma WT y la edad-1 (hx546) -Edad adultos hacen. Además de la pérdida inevitable total de perfo físicarmance debido a la edad, cada individuo adulto muestra un patrón único a través de la progresión del proceso de envejecimiento, incluso cuando la genética y el medio ambiente son prácticamente homogénea 7. (Mediante el control de la genética y el medio ambiente, los posibles efectos de confusión de estos factores se reducen al mínimo, al presentar la importante contribución de la estocasticidad a la degeneración relacionada con la edad.) A C. elegans población sincronizada de los antecedentes genéticos similares que son mantenidas en un ambiente controlado todavía contiene una mezcla de diferentes clases de individuos de acuerdo con sus peculiaridades envejecimiento. A pesar de todo el comienzo como adultos sanos, algunos pierden rápidamente su condición física (malos gerentes, clase C), mientras que otros mantienen el vigor para el período más largo de tiempo (gerentes agraciado, clase A). por lo tanto malos gerentes parecen tener un healthspan considerablemente más corto que quinceañeros agraciado. Como se detalla más adelante en nuestro estudio 8, gerentes agraciados mantienen fitn física juveniless como se observa por comparación con el perfil de natación de los adultos más jóvenes (Figuras 3, 4 y 5). Esta aptitud sostenida es comparable con el rendimiento físico de edad-1 mutantes (hx546) de larga vida en la era post-reproductiva (D 11) (Figuras 1 y 2). Por el contrario, los malos gerentes pierden drásticamente gran parte de su capacidad física poco después de la reproducción, que se realiza en niveles similares a los de los adultos de edad extremas y progeric daƒ-16 (mgDƒ50) (Figuras 1 - 4). Estas similitudes se pueden extraer por comparación bruta, sin embargo, las firmas particulares son fácilmente perceptibles a una mirada más cercana. Por ejemplo, aunque hay alguna correlación entre el grado de tanto estiramiento y rizado en los tipos silvestres de edad extremas y los mutantes de envejecimiento (Figura 2), esta relación no se observa en los malos gerentes (Figuras 4 y 5), que muestran mayor propensión a enroscarse pero hastade no estirar en las muestras ensayadas. El software se presenta por lo tanto añade dimensión al análisis de la condición física o la capacidad de locomoción, proporcionando las herramientas para estudios más sofisticados que no eran tratables antes. En resumen, Celest proporciona lecturas completas en forma de ocho nuevas medidas destacadas aquí, que definen la huella digital del comportamiento del concreto genética, epigenética, y fondos ambientales, lo que permite la identificación de patrones de parámetros únicos y comunes que pueden ser las firmas de condiciones específicas ( ambiental, farmacológico, nutricional), biológicos u organismo estados como healthspan. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig1.jpg" /> Figura 1: Informes de software Célest en onda Iniciación Rate (A), el Índice de Actividad (B), Pincelada (C) y Velocidad de desplazamiento (D) de WT, edad-1 (hx546), y daƒ-16 (mgDƒ50)<html> Adultos D 4 (edad adulta), 11 (post-reproducción) y 20 (extrema de edad). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT son de color gris, la edad-1 en verde y daƒ-16 en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). WT-edad Same y mutantes de envejecimiento se compararon de significación estadística utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 en cada punto de datos de cuatro ensayos independientes. Tenga en cuenta que aquí, y para la Figura 2, cada uno de 30 s de vídeo se realiza con 4 animales, y para cada ensayo que anotar un total de 16 animales a partir de 4 vídeos de natación, esto se hace para 4 repeticiones biológica para cada punto de datos se muestra. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig2.jpg" /> Figura 2: Informes de software en el cuerpo Número de onda (A), Asimétrico (B), Estiramiento (C), y se encrespa (D) para WT, edad-1 (hx546) y (mgDƒ50) Adultos D 4 16 daƒ-(jóvenes la edad adulta), 11 (post-reproducción) y 20 (extrema de edad). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT son de color gris, la edad-1 en verde, y daf-16 en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). WT-edad Same y mutantes de envejecimiento se compararon de significación estadística utilizando ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett. *, P = 0,01 - &lt;0,05; **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 en cada punto de datos a partir de cuatro independientes, 30 s nadan ensayos.e.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig3.jpg" /> Figura 3: Informes de software en la onda de Iniciación Rate (A), Índice de Actividad (B), Pincelada (C), y Velocidad de desplazamiento (D) para los adultos WT jóvenes (D4), y de la misma edad agraciado y Bad Age (D10 y 11). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes en verde, y de clase C malos gerentes en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A elegantes y gerentes de clase C malos gerentes se compararon con D 4 adultos jóvenes usando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. ****, P &lt;0,0001. n = 27 en cada punto de datos de dos independientes, 30 s nadan ensayos. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) 8, que fue publicado bajo el creativoCommons Reconocimiento (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ licencia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig4.jpg" /> Figura 4: Informes de software en el cuerpo Número de onda (A), Asimétrico (B), y Curling (C) para WT adultos jóvenes (D 4), y de la misma edad Age elegantes y Bad (D 10 y 11). &#39;#&#39; &#39;En la serie&#39; medios eje y. WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes de gerentes verde y de clase C malas en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A elegantes y gerentes de clase C malos gerentes se compararon con D 4 adultos jóvenes usando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ****, P &lt;0,0001; <strong&gt; n / a, no es aplicable ya que sólo un animal a partir del tamaño total de la muestra curvado. n = 27 en cada punto de datos de dos independientes, 30 s nadan ensayos. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) 8, que fue publicado bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) licencia http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig5.jpg" /> Figura 5: Informe sobre el estiramiento de software para adultos WT joven (D4), y de la misma edad agraciado y Bad Age (D 10 y 11). WT jóvenes son de color gris, clase A agraciados gerentes de gerentes verde y de clase C malas en rojo. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Clase A gerentes elegantes y de clase C malos gerentes se compararon con D 4 yos jóvenes adultos utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. n = 27 en cada punto de datos de dos ensayos independientes. Gráfico se modifica ligeramente de Restif et al. (2014) 8, que fue publicado bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) licencia http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359video1.jpg" /> Video 1: Natación de un grupo representativo de C. elegans adultos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a> <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359video2.jpg" /> Video 2: Celest Software Cálculo de mapas individuales curvatura de las Actuaciones de natación de los animales ensayados. Los mapas de curvatura se calculan en el fondo; que no aparecen en la interfaz de software con el usuario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a> <img alt="video 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359video3.jpg" /> Video 3: Software de cálculo de las medidas de baño individuales basados en mapas de curvatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a> <img alt="vídeo 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359video4.jpg" /> Video 4: Cálculo Software de Medidas de natación que no dependen de la curvaturaMapas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)</a>

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Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno.

El análisis automatizado de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamiento de la nadada El uso de software Célest

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

12.4K vistas.  Rutgers University.  Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno. 

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Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Longitud de onda única Shadow Imaging de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion incluida la fuerza Estimaciones

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Investigación

Ingeniería

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Estudio cuantitativo de Locomotion libremente Piscina microorganismos utilizando la difracción láser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Bioingeniería

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Neurociencias

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) controls several functions in C. elegans including learning and motor activity. Conditions that stimulate DA release (e.g., amphetamine (AMPH) treatments) or that prevent DA clearance (e.g., animals lacking the DA transporter (dat-1) which are incapable of reaccumulating DA into the neurons) generate an excess of extracellular DA ultimately resulting in inhibited locomotion. This behavior is particularly evident when animals swim in water. In fact, while wild-type animals continue to swim for an extended period, dat-1 null mutants and wild-type treated with AMPH or inhibitors of the DA transporter sink to the bottom of the well and do not move. This behavior is termed "Swimming Induced Paralysis" (SWIP). Although the SWIP assay is well established, a detailed description of the method is lacking. Here, we describe a step-by-step guide to perform SWIP. To perform the assay, late larval stage-4 animals are placed in a glass spot plate containing control sucrose solution with or without AMPH. Animals are scored for their swimming behavior either manually by visualization under a stereoscope or automatically by recording with a camera mounted on the stereoscope. Videos are then analyzed using a tracking software, which yields a visual representation of thrashing frequency and paralysis in the form of heat maps. Both the manual and automated systems guarantee an easily quantifiable readout of the animals' swimming ability and thus facilitate screening for animals bearing mutations within the dopaminergic system or for auxiliary genes. In addition, SWIP can be used to elucidate the mechanism of action of drugs of abuse such as AMPH.

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming induced paralysis (SWIP) is a well-established behavioral assay used to study the underlying mechanisms of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, a detailed method to perform the assay is lacking. Here, we describe a step-by-step protocol for SWIP.

Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Comportamiento

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Inmunología e Infección

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor impairment that worsens with time. While considerable advances have been made in determining genetic drivers of ALS for a subset of patients, the majority of cases have an unknown etiology. Further, the mechanisms underlying motor neuron dysfunction and degeneration are not well understood; therefore, there is an ongoing need to develop and characterize representative models to study these processes. Caenorhabditis elegans can adapt their movement to the physical constraints of their surroundings, with two primary movement paradigms studied in a laboratory environment- crawling on a solid surface and swimming in liquid. These represent a complex interplay between sensation, motor neurons, and muscles. C. elegans models of ALS can exhibit impairment in one or both of these movement paradigms. This protocol describes two sensitive assays for evaluating motility in C. elegans: an optimized radial locomotion assay measuring crawling on a solid surface and an automated method for tracking and analyzing swimming in liquid (thrashing). In addition to the characterization of baseline motor impairment of ALS models, these assays can detect suppression or enhancement of the phenotypes from genetic or small molecule interventions. Thus, these methods have utility for studying ALS&#160;models and any C. elegans strain that exhibits altered motility.

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol describes two sensitive assays for discriminating among mild, moderate, and severe motor impairment in C. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis, with general utility for C. elegans strains, with altered motility.

Evaluación del deterioro motor en modelos de C. elegans de esclerosis lateral amiotrófica

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Swimming-Induced Paralysis (SWIP) Assay: A Method to Quantify Dopamine-Mediated Locomotion in C. elegans

Source: Kudumala, S., et al. <a href="https://www.jove.com/video/59243/swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling">Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in&#160;Caenorhabditis elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019).
Here, we introduce an assay to measure SWIP, a behavioral phenotype of&#160;C. elegans&#160;that occurs during vigorous motion like swimming.&#160; The example protocol discusses both manual and automated analysis approaches.

Ensayo de parálisis inducida por la natación (SWIP): un método para cuantificar la locomoción mediada por dopamina en C. elegans

Source: Kudumala, S., et al. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019).
Here, ...

El análisis automatizado de

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Longitud de onda única Shadow Imaging de

Estudio cuantitativo de Locomotion libremente Piscina microorganismos utilizando la difracción láser

Electrotaxis microfluidos basados en On-Demand Análisis cuantitativo de

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Evaluación del deterioro motor en modelos de C. elegans de esclerosis lateral amiotrófica

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C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

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Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

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