Dieses Protokoll verwendet zwei verschiedene halbautomatische Assays, um die Bewegungsaktivität von C.elegans in flüssigem Medium schnell zu quantifizieren, und hat das Potenzial, für das Arzneimittelscreening in C.elegans-Krankheitsmodellen angewendet zu werden. Die Hauptvorteile dieser beiden Techniken sind ihre Benutzerfreundlichkeit und reproduzierbarkeit. Beide Techniken haben das Potenzial, die Auswirkungen von Medikamenten auf das Wurmverhalten mit variablem Durchsatz zu bewerten.
Diese Motilitätstests sind nützlich, um die Bewegungsaktivität von C.elegans mitochondrialen Krankheitsmodellen zu bewerten, bei denen das neuromuskuläre System der Tiere beeinträchtigt ist. Um die Aktivität von C.elegans lokomotorischem Medium in flüssigem Medium auf Glasobjektträgern nach der Synchronisierung der Kontrolle in mutierten Wurmstämmen auf NGM-Platten mit und ohne medikamentöse Behandlungen, die für das L4-Stadium von Interesse sind, zu analysieren, verwenden Sie einen Wurmpickel und ein Stereomikroskop, um fünf Würmer pro Stamm und Zustand in einzelne 20 Mikrolitertropfen S.basal-Lösung auf einem Glasobjektträger zu picken. Fügen Sie Würmer aus demselben experimentellen Zustand von verschiedenen NGM-Platten zu mehreren Tröpfchen auf demselben Objektträger hinzu, um mehrere technische Replikate zu erhalten.
Wenn alle Würmer gesammelt wurden, lassen Sie die Tiere eine Minute lang bei Raumtemperatur auf der Rutsche akklimatisieren, bevor Sie die Schwimmaktivität der Würmer in jedem Tropfen für eine Minute mit 15 Bildern pro Sekunde pro Tropfen aufzeichnen. Um die aufgezeichnete C.elegans-Bewegungsaktivität mit der ZebraLab-Software zu analysieren, verwenden Sie die ZEBRALAB AVI-Option, um Videos in die Software hochzuladen. Klicken Sie auf die Option Quantisierung mit AVI-Dateien.
Um ein neues Protokoll zu erstellen, wählen Sie Parameter, Protokollparameter und Zeit aus, und legen Sie die Testdauer auf eine Minute fest. Wählen Sie No Time Bin und deaktivieren Sie Integrationszeitraum entsprechend der gewünschten Datenausgabe und wählen Sie Datei und Film öffnen, um jede einzelne zuvor aufgenommene Videodatei hochzuladen. Um einen einzelnen Erkennungsbereich zu erstellen, verwenden Sie das Kreiswerkzeug, um einen Bereich um den gesamten Flüssigkeitstropfen zu erstellen, in dem sich die Würmer befinden.
Die Aktivität aller Würmer innerhalb des ausgewählten Bereichs wird erkannt. Um den zu kalibrierenden Abstand anzugeben, zeichnen Sie eine horizontale Linie von links nach rechts neben dem Videobereich und wählen Sie Kalibrierung, Zeichnen und Auf Gruppe anwenden aus. Damit die Erkennung aller verschiedenen C.elegans-Wurmstämme analysiert werden kann, deaktivieren Sie das Flächensymbol und passen Sie die Erkennungsempfindlichkeit im Aktivitätsschwellenwert an.
Um die Spuren der Tiere während der Aktivitätsanalyse zu visualisieren, legen Sie die Anzeigeskala auf 70 fest und wählen Sie Auf Gruppe anwenden aus. Um die Videos zu analysieren, klicken Sie auf Wiedergabe, wählen Sie Experimentieren und Ausführen aus, um einen Dateinamen für das Video einzugeben. Nach dem Speichern erscheint ein Fenster, in dem Sie gefragt werden, ob das Video mit der maximalen Computergeschwindigkeit analysiert werden soll.
Klicken Sie auf Ja. Das fenster für das laufende Experiment wird geöffnet. Klicken Sie auf Start.
Wenn die Aufzeichnungsanalyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Experimentieren und beenden, um die im Droplet analysierte Aktivität in einer Tabelle zu speichern. Um die Aktivität von C.elegans Lokomotor in flüssigem Medium in einem 96-Well-Plattenformat zu analysieren, wenn die Würmer das L4-Stadium erreicht haben, fügen Sie 50 Mikroliter mit 2% Gewicht pro Volumen von E.coli OP50 und S.basal Medium zu jeder Vertiefung einer klaren 96-Well-Flachboden-Mikroplatte hinzu. Verwenden Sie das Stereomikroskop, um manuell 15 synchronisierte Würmer pro Vertiefung der 96-Well-Platte auszuwählen und die Würmer 20 Minuten lang akklimatisieren zu lassen.
Verwenden Sie am Ende der Akklimatisierungsphase einen Standard-Flachbettscanner, um jede Mikroplatte zweimal mit weniger als 10 Sekunden zwischen den Scans zu scannen Um die Scans zu analysieren, verwenden Sie Open-Source-Software, um die beiden sequenziellen Scans auszurichten und die Pixeländerungsdaten zwischen den beiden Bildern und den relativen Wurm-Scan-Score zu erfassen, um die Änderungen der Lokomotorreaktion basierend auf der vom Scanner erzeugten Lichtintensität zu bestimmen, wenn sie auf ein Pixel eingestellt ist Schwellenwert von fünf. In dieser Analyse der Bewegungsaktivität von C.elegans in einem einzigen Tropfen flüssigen Mediums zeigten die Würmer der mitochondrialen Komplex-I-Krankheit eine signifikante Abnahme ihrer Bewegungsaktivität im L4-Stadium um 38% im Vergleich zu Wildtypwürmern. In ähnlicher Weise zeigte die Analyse der gleichen Populationen eine signifikante Verringerung der Bewegungsaktivität für die Krankheitsmodellwürmer im L4-Stadium im Vergleich zu N2-Bristol-Wildtypwürmern.
Dieser Verlust der Bewegungsaktivität wurde auch bei Würmern der mitochondrialen Komplex-I-Krankheit im ersten Stadium bei Erwachsenen beobachtet, die durch Wurmscan-Analyse beurteilt wurden. Es ist wichtig, bei der Einrichtung jedes Assays daran zu denken, die richtige Anzahl von Würmern zu verwenden. Nach diesem Verfahren führt unser Labor häufig ein Drogenscreening durch.
Diese beiden Techniken werden in unserem Labor verwendet, um die Auswirkungen von Medikamenten von Interesse auf die Wurmaktivität in präklinischen Tiermodellen von mitochondrialen Erkrankungen zu bewerten.
