Unser Protokoll enthält zwei Assays, die die Bewegung von C.elegans quantifizieren. Diese Methoden bewerten Motilitätsphänotypen, wie sie von Modellen der Amyotrophen Lateralsklerose oder ALS gezeigt werden. Der Radial Locomotion Assay ist eine kostengünstige und einfache Methode zur Erkennung von Kriechen auf einer festen Oberfläche.
Der Swimming Assay verwendet computergestütztes Tracking zur unvoreingenommenen Erkennung von Schlagbewegungen in Flüssigkeit. Diese Methoden sind nützlich, um Bewegungsunterschiede in C.elegans zu quantifizieren. Obwohl wir ALS untersuchen, können sie für jeden Stamm mit veränderter Motilität verwendet werden.
Drehen Sie die NGM-Assay-Platten auf den Kopf. Und beschriften Sie den Boden mit einem Identifikator für die zu untersuchenden C.elegans-Stämme. Machen Sie einen kleinen Punkt mit dem Marker in der Mitte der umgedrehten Platte.
Während Sie mit einem Seziermikroskop arbeiten, übertragen Sie Würmer in die Mitte der Assay-Platte. Und stellen Sie einen Timer für 30 Minuten ein. Legen Sie den Deckel wieder auf den Teller und legen Sie ihn beiseite.
Setzen Sie die Übertragung von Würmern fort, bis sich alle Stämme auf den dafür vorgesehenen Testplatten befinden. Beginnen Sie nach 30 Minuten mit der Ritzung der ersten Platte, indem Sie den Deckel entfernen und die Platte mit der Vorderseite nach unten unter das Seziermikroskop legen. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis alle Würmer durch die Schnecke sichtbar sind.
Verwenden Sie einen andersfarbigen Filzstift vom Mittelpunkt aus, setzen Sie einen kleinen Punkt an die Position jedes Wurms. Überprüfen Sie den Rand der Platte, da einige Würmer dort landen können. Zählen und notieren Sie auch, wie viele Würmer sich nicht vom Mittelpunkt bewegt haben.
Messen Sie den Abstand vom Mittelpunkt bis zu den endgültigen Positionsmarkierungen für jeden Wurm und zeichnen Sie den Abstand mit einem Lineal auf. Der erste Wurmpunkt ist mit einem Bindestrich markiert. Zeichnen Sie die Längendaten für jeden Punkt nacheinander auf, indem Sie die Platte im Uhrzeigersinn drehen.
Öffnen Sie die zugehörige Software, um die Videos einzurichten und aufzunehmen. Klicken Sie auf das Videoaufnahmesymbol. Drücken Sie auf den Dimmerknopf und drehen Sie ihn im Uhrzeigersinn, um das Licht einzustellen.
Klicken Sie im Videoaufnahmefenster auf die Registerkarte Einstellungen und passen Sie den Videomodus auf 2456x2052_Mono8, die Bildrate auf 14 und die Ausgabe als Monochrom an. Belichtung von 0,00300 Sekunden. Verstärkung bis 1 dB.
Gamma zu eins. Und drehen Sie auf 180. Wechseln Sie zurück zur Registerkarte Aufnahme, wählen Sie den Aufnahmeordner aus und weisen Sie einen Dateinamen zu, indem Sie ihn in das Textfeld Dateipräfix eingeben.
Legen Sie andere Aufnahmeeinstellungen wie Puffer auf 128 Frames und Dauer auf eine Minute fest. Legen Sie die Assay-Platte auf die Gerätebühne und zentrieren Sie sie auf dem Videoaufnahmebildschirm, und entfernen Sie dann den Deckel. Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 50 Würmer in 1 ml M9 auf die Assay-Platte zu waschen.
Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Tiere in die Mitte zu bringen, oder verwenden Sie eine Mikropipette, um ein paar Tropfen M9 hinzuzufügen, um die Tiere zu trennen. Stellen Sie einen Timer für 60 Sekunden ein, damit sich Würmer an das Schwimmen gewöhnen können. Stellen Sie den Lichtregler so ein, dass das Display ohne Überbelichtung so hell wie möglich ist.
Passen Sie den Kamerafokus manuell an, indem Sie den Fokussierring am Objektivgehäuse der Kamera drehen, während Sie das Display betrachten. Nach 60 Sekunden drücken Sie die Aufnahmetaste, wählen Sie die erste Taste im Workflow-Menü "Bildsequenz importieren" und suchen und doppelklicken Sie auf ein Video. Wählen Sie im Workflow-Menü Sequenzinformationen festlegen aus"Überprüfen Sie im neuen Menüfenster das Benennungsschema, fügen Sie Notizen hinzu und validieren Sie Metadaten.
Wählen Sie "Bild anpassen" und ein neues Popup-Menü mit dem Namen "Bildanpassungen" wird geöffnet. Passen Sie die Bildverarbeitungseinstellungen an, indem Sie die Hintergrundglättung auf 10, die Gaußsche Glättung auf fünf, das Füllen von Löchern auf zwei, den Filter für kleine Objekte auf Null und das Überspringen der Segmentierung der integralen Ableitung festlegen. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass die Tiere vollständig mit Grün gefüllt sind, sich aber dennoch vom Hintergrund unterscheiden.
Klicken Sie dann auf "Übernehmen" Wählen Sie im Workflow-Menü "Erkennen und Verfolgen" drei bis sieben Würmer aus und klicken Sie auf der Registerkarte "Erkennung" auf die Schaltfläche "Würmer erkennen". Wechseln Sie zur Registerkarte Nachverfolgung. Aktivieren Sie in den Tracking-Parametern "Backtracking verwenden" und deaktivieren Sie "Würmer am Bildrand verfolgen".
Legen Sie die maximal verfolgte Hypothese auf fünf fest. Stellen Sie den Tracking-Modus auf Schwimmen ein. Wechseln Sie zum Abschnitt "Erweiterte Einstellungen" und legen Sie die Frames fest, die Würmer die Grenze berühren können, auf 50.
Frames-Würmer können sich bis zu 500 überlappen. Positionstoleranz bis 0,50. Und Formtoleranz bis 0,50.
Speichern Sie diese Einstellungen und stellen Sie sie für alle Videos in einem Experiment bereit, indem Sie sie als Konfiguration speichern. Navigieren Sie zum Konfigurationsmanager im Menü des Symbols oben links und klicken Sie auf das Symbol "Speichern". Geben Sie dieser Konfiguration einen Namen und eine Beschreibung.
Und klicken Sie auf Okay"Klicken Sie im Workflow-Menü auf Projekt speichern"Verfolgen Sie die Videos, indem Sie zum Workflow-Menü gehen und auf das Stapelsymbol klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" im Abschnitt "Dateiauswahl" dieses Stapelverarbeitungsmenüs. Navigieren Sie zu allen zu verarbeitenden Projektdateien, und wählen Sie sie aus.
Klicken Sie dann auf Öffnen"Klicken Sie auf die Schaltfläche Start" und notieren Sie sich die grüne Fortschrittsanzeige in der ersten Datei. Lassen Sie zu, dass alle Dateien verarbeitet werden. Wenn alle gelesenen Dateien abgeschlossen sind, schließen Sie die Software.
Wählen Sie Daten analysieren"Navigieren Sie zur Track-Zusammenfassung. Und verwenden Sie die Schaltfläche "Exportieren" unten rechts, um Daten in einem lesbaren Tabellenkalkulationsformat zu exportieren. Verwenden Sie die "Turn Count" und "Track Duration", um Die Umdrehungen pro Minute für jede Spur mithilfe von Tabellenkalkulationsfunktionen zu berechnen.
Die unstimulierte Ausbreitung der entwicklungsbedingten L4-Larve von fünf verschiedenen Stämmen wurde mit dem Radial Locomotion Assay gemessen. Und grafisch als Mikrometer pro zurückgelegter Minute. Die als Balkendiagramme dargestellten Daten verdeutlichen die relativen Unterschiede zwischen den Dehnungen.
Während die endgültige Verschiebung jedes Wurms, die innerhalb der Grafik dargestellt wird, es ermöglicht, die Variation innerhalb der Population besser zu visualisieren. Die Schwimmraten in Form von Schlag- oder Wellenfrequenz in der Flüssigkeit wurden mit unvoreingenommener computergestützter Bewertung und Analyse gemessen. Und grafisch dargestellt als Thrashes pro Minute.
Die Balkendiagrammdaten machen relative Unterschiede zwischen Dehnungen leichter sichtbar. Während die Daten von jedem einzelnen bewerteten Wurm innerhalb der Grafik dargestellt werden, kann die Variation innerhalb der Population besser visualisiert werden. Im Radial Locomotion Assay unterschied sich der milde TDP-43-Stamm nicht signifikant vom Wildtyp-N2-Stamm.
Im Swimming Assay unterschieden sich jedoch sowohl die milden als auch die starken TDP-43-Stämme nicht nur signifikant vom Wildtyp N2, sondern auch voneinander. Der ALS-mutierte TDP-43-Stamm hat eine schwere Kriechstörung durch Radial Locomotion und sie werfen keine Flüssigkeit ein. Der Tau-exprimierende Stamm hat schwere Beeinträchtigungen in der radialen Fortbewegung, kann aber im Swimming Assay schlagen.
Der wichtigste Aspekt, der bei diesen Methoden zu berücksichtigen ist, ist die Aufrechterhaltung konsistenter Kontrollen zwischen Replikaten. Dies stellt sicher, dass Motilitätsschwankungen durch phänotypische Unterschiede und nicht durch Umweltbedingungen verursacht werden. Diese Methoden bieten eine umfassende Bewertung von zwei wichtigen C.elegans-Motilitätsparadigmen.
Follow-up-Methoden könnten zusätzliche Verhaltenscharakterisierung, biochemische Analyse oder Untersuchung der Muskel- oder Neuronenfunktion umfassen.
