This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.

1. MFP Capo e Piattaforma pulizia e la preparazione NOTA: Questo protocollo utilizza verticalmente orientata ibrido al silicio-vetro MFP dirige 15,16. La componente di silicio della testa contiene i microcanali, che sono inciso ad una profondità di 100 micron. Il silicio attaccato viene incollata al vetro utilizzando bonding anodico. Il design canale comprende un modello composto da sei canali, due ciascuno per iniezione e aspirazione, e due per l&#39;iniezione del liquido di immersione (Figura 1). I canali utilizzati per l&#39;iniezione di liquido di immersione ricostituire i mezzi di comunicazione che circonda il campione biologico, evitando così perdite a causa di aspirazione ed evaporazione. I canali interni e canali esterni utilizzati nei lavori in corso sono 100 × 100 micron e 200 × 100 micron rispettivamente. fabbricazione Post e di trasformazione, le teste MFP con canali chiari e apici lucido si ottengono. <ol><li> Preparazione della stazione di pompaggio e dei fluidiapparato <ol><li> Utilizzare capillari con 1/16 &#39;&#39; (1,59 mm) di diametro esterno e 0,02 &#39;&#39; (0,51 mm) di diametro interno per tutti i tubi collegati alle siringhe. Variare dimensioni capillare basato sull&#39;applicazione e ottenere i connettori e raccordi appropriati per interfacciare la testa MFP con le siringhe. Utilizzare acqua ultrapura ovunque siano necessarie diluizioni. </li><li> siringhe pulite (250 - 500 volumi mL) e siringhe stantuffi di ultrasuoni in soluzione di candeggina 0,5% in acqua ultrapura prima to e post esperimenti sulle cellule vive. Sciacquare abbondantemente con acqua. Riempire con acqua immergendo le loro punte completamente in un bagno d&#39;acqua ed aspirando con lo stantuffo. Eliminare il liquido, mentre nel bagno d&#39;acqua con l&#39;albero siringa contattare la guarnizione all&#39;uscita della siringa. Ripetere aspirare e di spurgo fino a quando non bolle d&#39;aria si vedono nelle colonne siringa. </li><li> Collegare riempite le pompe a siringa con connettori Luer-Lock. Utilizzare una valvola interruttore montato sullapompe per dirigere il liquido dalla siringa ad uno dei due capillari che portano sia alla testa MFP o ai serbatoi di liquido (Figura 6). (Se non valvola di commutazione è disponibile vedere la sezione 1.4.4). Eliminare entrambi i capillari con acqua dalle siringhe ad una portata di circa 10 - 50 microlitri / min, a seconda delle dimensioni della siringa fino a circa 10 ml di acqua viene lasciata nelle siringhe. </li><li> Pre-inserire i capillari eliminati in un apposito microfluidica connettore / adattatore che si interfaccia con le vias canale nella testa (ad esempio, il connettore M1 - vedi Materiali). </li></ol></li><li> Preparazione testa MFP <ol><li> Pulire la testa MFP mediante ultrasuoni utilizzando un detergente per la pulizia vetreria standard o 0,5% di candeggina per la pulizia rigorosa, per 5 min. Eliminare canali con acqua immergendo l&#39;apice in acqua e applicando vuoto per le vias. </li><li> Controllare i canali allo stereomicroscopio per i potenziali ostacoli (intasamento) e retorba il passaggio precedente, se necessario. </li><li> Montare la testa pulita sul supporto testa e avvitare il connettore con il tubo pre-inserito e purgato sulla testa. Avvitare il supporto della testina al Z-fase, che viene utilizzato per il controllo della distanza gap tra la testa e il monostrato cellulare. </li></ol></li><li> Calibrazione le fasi di scansione della piattaforma MFP <ol><li> Eseguire la calibrazione punto finale della X, Y e Z fasi prima di collegare il capo alla piattaforma, secondo il protocollo del produttore con un&#39;interfaccia software appropriato. stadi calibrati garantire la precisione nel posizionamento della testa MFP. </li><li> Ottenere un grezzo distanza gap zero (azzeramento) portando la testa MFP su un vetrino da camera, senza cellule e scendere lentamente a 5 micron passi. A contatto con il substrato della sonda, devono essere osservate anelli di Newton. Questa è una stima approssimativa. Una posizione esatta deve essere ottenuto dopo la regolazione complanarità dell&#39;apice sonda al substrate. </li><li> Per garantire complanarità dell&#39;apice della sonda, regolare l&#39;inclinazione della testa utilizzando un goniometro (all&#39;interfaccia della testa e la fase Z). Quando formata affinché anelli di Newton sono simmetriche (Figura 1). Spostare il micron MFP testa 20 di distanza dal substrato e regolare l&#39;inclinazione con il goniometro. Repeat scendere, l&#39;azzeramento e la regolazione dell&#39;inclinazione fino anelli di Newton sono simmetriche a contatto. Con inclinazione regolabile, impostare la posizione z che produce anelli di Newton simmetrici come zero. NOTA: Il Z-fase controlla la distanza testa-a-substrato, mentre lo stadio XY controlla la scansione del substrato (Figura 2). Una spiegazione dettagliata si trova nel nostro precedente lavoro 14. </li></ol></li><li> Preparati chimici per la rimozione di strati di cellule locali Attenzione: Dove (ad esempio, guanti di nitrile, occhiali di sicurezza) per le sostanze chimiche in fase di preparazione del caso, dotazioni di sicurezza uso. Utilizzare un hoo fumid se necessario per la preparazione di soluzioni. Preparare tutte le sostanze chimiche e buffer con acqua ultrapura come diluente. <ol><li> Preparare 50 mM soluzione di NaOH come liquido di trasformazione per il canale di iniezione interna (i2 con portata Q I2 in Figura 1). </li><li> Preparare la soluzione tampone di estrazione richiesto per l&#39;iniezione esterna (i1 con portata Q I1 in figura 1), composto di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% Tween 20 e 10 pM rodamina B in 50 mM Tris (idrossimetil) amminometano a pH 8. Per lo spurgo, utilizzare acqua nelle siringhe di aspirazione. </li><li> Filtrare tutte le soluzioni che utilizzano un filtro siringa da 0,2 micron. Degas tutte le soluzioni filtrati utilizzando un essiccatore fino alla fermata aria disciolta gorgogliare in superficie. </li><li> Utilizzando la linea di drenaggio collegata alle pompe a siringa, spurgare l&#39;acqua rimanente e aspirare le soluzioni degassati nelle siringhe a 40 microlitri / min fino a che le siringhe sono pieni (250 o 500 microlitri).Questo assicura riempimento senza bolle delle siringhe, connettori e capillari. Il sistema di valvole a due capillare siringa-switch permette riempimento del siringhe metà esperimento. In assenza di una tale valvola interruttore, scollegare i capillari dalla testa e riempire i capillari e la siringa aspirando soluzioni degassato prima ricollegarli alla testa. </li><li> Aspirare il trattamento e schermatura liquidi attraverso i capillari consente l&#39;utilizzo di piccoli volumi durante il funzionamento. Se le sostanze chimiche possono essere preparati in grandi volumi, riempire siringhe con le soluzioni richieste direttamente. Ad esempio, le siringhe aspirazione contenenti acqua possono essere riempiti con questo approccio. </li><li> Eliminare i capillari alla testa MFP con i liquidi assegnati per ciascun canale, come definito in 1.4.1 e 1.4.2. NOTA: La soluzione tampone di estrazione protegge il NaOH in confinamento interna e la componente rodamina nel buffer facilita la visualizzazione dei thuna e hHFC durante il funzionamento. </li><li> Se le cellule sono over-confluenti, con aggregati di cellule che appaiono sulla superficie colta, integrare il tampone di estrazione con il 10% proteinasi K. Ciò integra l&#39;azione di NaOH su tali aggregati sciogliendo proteine ​​denaturate il lisato entra nei canali di aspirazione. Questo impedisce l&#39;intasamento dei canali durante il funzionamento. </li></ol></li><li> Preparazione di monostrati di cellule su vetrini da camera Attenzione: utilizzare una cappa di coltura cellulare per la coltura delle cellule e gestire apparati come da regolamenti stabiliti dal responsabile della biosicurezza del laboratorio. Nota particolari esigenze di linee cellulari specifici e adattare il protocollo e le attrezzature di conseguenza. <ol><li> Incubatori di coltura cellulare Usa (al 5% di CO 2 e a 37 ° C) per la cultura e l&#39;espansione delle cellule da modellati. Eseguire l&#39;espansione utilizzando protocolli standard di coltura cellulare 17,18 in fiasche T. Utilizzare mezzi di coltura secondo i requisiti del cel specifical la linea (ad esempio, siero e antibiotici integrati per la coltura DMEM MCF7 e MDAMB 231). </li><li> Giunti confluenza cellulare nelle fiasche di coltura, trypsinize e raccogliere le cellule e sementi 2 × 10 5 cellule / cm 2 in ciascuna delle slitte 2-camera per patterning e cultura oltre 48 ore. Utilizzare le cellule in una delle camere come controllo per la crescita cellulare e la vitalità. </li><li> Raggiunto confluenza delle cellule su vetrini da camera, incubare le cellule per 45 minuti con 500 soluzione colorante cellule inseguitore microlitri (ad esempio, verde - CMFDA o arancione - CMRA) ad una concentrazione 10 mM preparata in terreno privo di siero. Questo viene fatto per la visualizzazione delle cellule durante patterning. Lavare le cellule etichettate con PBS delicatamente vampate ciascuna camera con una pipetta, e, successivamente, della cultura le cellule in mezzi di siero-integrato per gli esperimenti patterning. </li><li> Ottenere un immagine di riferimento della superficie cellulare delle cellule-inseguitore macchiate ai fini del conteggio delle cellule. Questo viene fatto per garantireconfluenza dello strato di cellule. Inoltre, serve come aiuto per gli esperimenti di quantificazione se il recupero del campione e l&#39;analisi del DNA sono obiettivi. NOTA: Nel caso in cui la vitalità delle cellule deve essere valutato durante patterning, le cellule possono essere colorati con un / kit di citotossicità morti vivono in conformità alle istruzioni del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Creazione del Hierarchical idrodinamico flusso confinamento (hHFC) <ol><li> Spostare il MFP sul monostrato cellulare ad una distanza gap di 50 um dal vetrino. Questa distanza lacuna, garantendo nel contempo il contatto del hHFC conti anche per la superficie monostrato e variazione di spessore. </li><li> Iniettare NaOH a 6 o 8 ml / min attraverso i2. Valutare altre portate (cioè, Q I1, Q A1 e A2 Q) utilizzando le regole di flusso di figura 3. </li><li> Modulare la dimensione del HFC interna cambiando il rapporto Q I2 / Q I1 base alle siringhe per iniezione.Ad esempio, utilizzare un Q I1 tra 1,3 microlitri / min e 4 microlitri / min, con la Q I2 fissato a 8 microlitri / min, che si traduce in un ingombro NaOH di 150 - 300 cellule (100 - 200 micron 2 / cell) ( Figura 3D). </li><li> Iniettare mezzo completo dalle più esterni aperture sulla testa MFP a una portata di 20 microlitri / min per spiegare evaporazione dei media e aspirazione durante il funzionamento del hHFC. </li></ol> 3. monostrati cellulari patterning Uso hHFC Nota: Il modello di scansione determina le aree del monostrato cellulare dove si estraggono le cellule (patterning sottrattiva), lasciando le cellule rimanenti per studiare questioni biologiche specifiche. Questo modello può essere linee rette o una matrice di punti, per esempio. modelli complessi richiedono la progettazione di un adatto traiettoria di scansione. Ad esempio, una scansione traiettoria scacchi fornisce una griglia di aree di celle (mostrato ad esempio in figura 4A </strong&gt;), che consentirebbe studiare l&#39;effetto di differenti stimoli su cellule in diversi quadrati pur essendo in prossimità. Questi modelli possono essere creati utilizzando il controllo sulle fasi XY della piattaforma, dove il software di controllo permette di scripting delle traiettorie di scansione per MFP testa sopra il monostrato cellulare. <ol><li> Impostare il software fase per la scansione della sonda sul monostrato cellulare in modelli definiti dall&#39;utente testa (modificando X, Y e Z) ad una velocità di scansione di 10 micron / s ad una distanza gap di 50 micron. </li><li> Con l&#39;nidificata hHFC in funzione e in contatto con il monostrato, la scansione della MFP con traiettoria del modello desiderato per effettuare la rimozione delle cellule modellata. </li><li> Per una co-coltura dopo il primo ritiro tipo di cellula, seminare una linea cellulare diverso per colmare le lacune, utilizzando i metodi descritti nella sezione 1.5. Spostare tra le modalità annidati e pizzicato (aumentando la distanza divario, per esempio) per controllare la rimozione delle cellule. NOTA: La velocità di scansione può avere essere dell&#39;inchiestagated per altre linee cellulari. La velocità di scansione utilizzato in questa rimozione completa delle cellule effetti dimostrativi sulle regioni digitalizzati per linee cellulari. </li></ol> 4. lavorazione a valle per il campionamento e il DNA Amplificazione <ol><li> Preparare la stazione di campionamento per l&#39;analisi a valle del lisato. Per la stazione di campionamento, utilizzare un 3D stampato a 8-striscia portaprovette PCR. In alternativa, scegliere una portatubi appropriata per servire come questo adattatore, che può essere montato entro l&#39;intervallo di scansione della testa fuori dal substrato. Pulire il portaprovette con il 70% di etanolo o altri decontaminanti superficiali basate sulla stringenza desiderato per l&#39;applicazione. Utilizzare una clip magnetica sul supporto tubo per fissarlo sul supporto substrato. </li><li> Dopo aver preparato la stazione di campionamento, posizionare la stampante multifunzione testa 100 micron dal monostrato. Iniziare funzionamento del hHFC con 50 mM soluzione di NaOH come liquido di trasformazione per il canale di iniezione interna con portate di 1, 6, -7 E -17,5 microlitri / min per Q I1, I2 Q, Q e Q A1 A2 rispettivamente. <ol><li> Una volta che il confinamento flusso è stabilizzata (in circa 10 sec), scendere la testa della sonda ad una distanza gap di 50 micron per eseguire basato NaOH lisi locale della sotto-popolazione scelto di celle con la hHFC. Una volta che la lisi del sub-popolazione è completa (circa 30 secondi per ogni impronta), orientare la testa verso i tubi nella stazione di campionamento. Espellere il lisato raccolti nelle provette per PCR direttamente (Figura 6). </li></ol></li><li> Per l&#39;elaborazione a valle del lisato, prima neutralizzare il pH della soluzione miscelando il lisato con tampone Tris (1: 1). Dopo la neutralizzazione, riscaldare il lisato a 95 ° C per 30 min. Quindi caricare direttamente il lisato in un flusso di lavoro standard di qPCR come previsto dal fornitore dello strumento. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Vi presentiamo un protocollo versatile per il patterning sottrattiva di monostrati cellulari che consente una rapida generazione di modelli di cellulari spazialmente definiti. lisi selettiva di monostrati di cellule viene eseguita utilizzando NaOH come liquido elaborazione nel hHFC. Il NaOH denatura istantaneamente le proteine ​​contenute nella membrana cellulare. Si consiglia l&#39;uso di 50 mm la concentrazione di NaOH per garantire un trattamento a valle del lisato. Questa concentrazione può essere aumentata per più rapida rimozione delle cellule, disponibile lisato lavorazione a valle non è un obiettivo. Il hHFC assicura che le aree circostanti non trasformate del monostrato cellulare rimangono inalterate e sono disponibili sia per espandere il modello o sondare altre proprietà delle cellule. La velocità di rimozione delle cellule è funzione sia della chimica e shear presentato dal flusso. Abbiamo scelto un raggio di azione di portate ad avere la chimica rimozione delle cellule dominante. velocità di scansione di 10 - 20 &amp; #181; m / sec con una iniezione portata NaOH di 6 - 8 microlitri / min sono utilizzati per facilitare &#39;rapida&#39; patterning sottrattiva. Il rapido tasso di rimozione delle cellule affronta alcune sfide affrontate da stampa di superficie patterning approcci basati 20,21. Questi metodi richiedono un meccanismo per limitare la crescita delle cellule in aree spazialmente definiti, per esempio, mediante deposizione selettiva di proteine ​​di adesione cellulare mediante stampa a microcontatto e successiva semina delle cellule per ottenere il pattern. Essi sono limitati da bassa produttività e richiedono diversi passaggi sequenziali per la generazione del tracciato, nonché un nuovo stencil / timbro per ciascun modello. Il metodo descritto non richiede la crescita selettiva delle cellule in aree definite, e supera diversi limiti eseguendo patterning sottrattiva in contrasto con la stampa, pur non richiedere alcun trattamento aggiuntivo del substrato di coltura cellulare. Con il protocollo descritto in questo documento, il throughput di monostrati di cellule patterningè aumentata, ottenendo immediato riscontro visivo del modello generato. Questo facilita la modifica in tempo reale dei modelli. Tale controllo può essere cruciale in scenari in cui vitalità cellulare su una data superficie non è omogenea. Un altro vantaggio del metodo è che la stessa testa e la chimica possono essere utilizzati per generare pattern multipli, riducendo così il numero di passaggi necessari per generare un monostrato di cellule fantasia. Le dimensioni dei canali nella testa e la geometria della testa può essere scalata a seconda delle esigenze dell&#39;applicazione, consentendo di controllare la risoluzione del patterning. Tutti gli esperimenti nei lavori in corso sono stati eseguiti utilizzando una testa MFP di dimensioni apertura fissa, in particolare con aperture interne a 100 × 100 micron e aperture esterne a 200 × 100 micron. Questo disegno di aperture esterne più grandi è stato scelto per garantire il funzionamento continuo del hHFC senza intasare delle aperture bydetriti cellulari randagio. Abbiamo testato testine con dimensioni apertura interna 50 × 50 micron e 50 micron spaziatura tra di loro, con risultati positivi nella rimozione di cellule. L&#39;utilizzo di aperture più piccole, fino a 10 × 10 micron con 10 micron spaziatura, permetterebbe di scala a una dimensione più piccola orma (~ 30 × 30 micron), consentendo in tal modo una maggiore risoluzione in patterning. Abbiamo osservato questioni operative con apertura di dimensioni inferiori a 10 micron a causa di intasamento da particolato. A causa di tali difficoltà operative, 100 micron è il limite di corrente di risoluzione e quindi una limitazione della tecnica descritta. Tuttavia, siamo in grado di affrontare questo con la capacità sagomatura liquida del hHFC. Abbiamo dimostrato che la risoluzione di rimozione delle cellule può essere sintonizzata per un dato insieme di dimensioni apertura controllando Q I2 / Q I1 (Figura 4b) e il divario apice-to-substrato 10,14. Le fasi utilizzate nel lavoro corrente ha una dimensione minima del gradino di 100 nm.Una combinazione di questi parametri controllabili può migliorare la risoluzione spaziale di rimozione delle cellule in termini di dimensioni ingombro e distanza di ricezione. Se fantasia co-colture sono desiderati per studiare le interazioni cellula-cellula specifici tra diversi tipi di cellule, semina sequenziale e patterning possono essere eseguite utilizzando il protocollo descritto. Infine, DNA amplificabile di alta qualità può essere ottenuto dal lisato, come evidente dal singolare picco nel DNA sciogliere curva (vedere la Figura 7). Abbiamo valutato una quantità di DNA di circa 1,6 ng da una singola impronta (circa 300 cellule) utilizzando qPCR, che è vicino al aspettativa teorica (6-8 pg / cell). Questo indica una quantità di DNA estratto adatto per diversi processi a valle ovviando uso di metodi di isolamento del DNA. Questo apre nuove strade per la DNA-analisi-basata locale sondaggio di cellule in coltura. La capacità di hHFC per modellare liquidi può anche essere usato per depositare cellule vive e proteine ​​su acsuperfici vata, che in combinazione con il patterning sottrattiva e sequenziale co-coltura presentata in questo protocollo consente la creazione di modelli complessi cellula e cellula-matrice su substrati di coltura. La versatilità e il controllo è fornito da hHFC basata patterning sottrattiva di monostrati cellulari e la possibilità di effettuare analisi del DNA sulle cellule estratte, fornisce un nuovo potente strumento impostato biologi effettuare studi spazialmente risolti coinvolgono interazioni cellulari.

Nel loro ambiente nativo, le cellule nei tessuti biologici percepiscono una serie di segnali biochimici e fisici che dirigono la loro crescita, l&#39;organizzazione e lo sviluppo. La comprensione di questi segnali richiede un esame selettivo delle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Questo richiede lo sviluppo di metodi per monostrati cellulari patterning. Metodi per tipi di cellule diverse geometricamente separati nella cultura (patterning) consentono ampi studi di segnali chimici e fisici in biologia cellulare. La maggior parte degli attuali approcci per strati di cellule patterning 1-4 dipendono da depositare proteine ​​di adesione cellulare su superfici o utilizzando stampini microfabbricate per la crescita selettiva su substrati. Al contrario, qui vi presentiamo un metodo per rapidamente monostrati cellulari modello in situ, cioè cellule in coltura, eliminando le cellule in regioni selezionate del monostrato. I metodi che eseguono tale sottrattivo patterning 5-9 usually richiedono substrati specializzati, il trattamento delle superfici, operazione complessa, di contatto fisico o ablazione utilizzando un laser, involontariamente colpisce le cellule vive. Noi qui utilizziamo una sonda microfluidica (MFP) 10,11, un non-contatto di scansione tecnologia microfluidica che limita idrodinamico un liquido su un substrato. Una componente importante della MFP è la testa microfabbricazione contenente microcanali (Figura 1). La piattaforma associata consiste di pompe a siringa per il controllo del liquido, le fasi per la scansione di controllo e un microscopio invertito per la visualizzazione e feedback (Figura 2). Nella sua configurazione di base, la testa MFP comprende due microcanali con aperture all&#39;apice, uno per iniettare un liquido trattamento e l&#39;altro per l&#39;aspirazione del liquido di lavorazione iniettato insieme ad un liquido di immersione (Figura 3A). Durante il funzionamento MFP, l&#39;apice è ad una distanza fissa dal substrato. Quando la portata di aspirazione (Qa) è sufficiente superiore al tasso di flusso di iniezione (Q i), cioè, Q a: Q i ≥ 2.5, il liquido di elaborazione è confinata sul substrato. Questo si traduce in un confinamento flusso idrodinamico (HFC). La regione in cui il liquido di lavorazione è a diretto contatto con il substrato viene definito l&#39;impronta. Per le condizioni tipiche di funzionamento, il flusso del liquido trasformazione nella HFC è caratterizzata da un basso numero di Reynolds (Re ≈ 10 -2) e un numero elevato Péclet (Pe ≈ 10 2). Ciò implica flussi liquidi in regime laminare con convezione essendo la principale modalità di trasferimento di massa di specie chimiche. I modelli numerici e analitici per il confinamento del flusso sono descritte altrove 12 - 14. In questo lavoro, si usa il metodo di confinare contemporaneamente più liquidi di lavorazione, che si chiama HFC gerarchico (hHFC) 14. Per implementare hHFC con la MFP, due additional aperture sono necessari per fornire una sorgente secondaria di iniezione e aspirazione. Questo ci permette di confinare un liquido all&#39;interno di un secondo liquido. Gli interni benefici (trasformazione) liquidi vengano protetti da detriti vaganti sul substrato dal (schermatura) liquido esterno. Inoltre, hHFC permette il funzionamento in due modi: (i) la modalità nested, in cui il liquido di elaborazione nei contatti HFC interne della superficie (Figura 3B), e (ii) il modo pizzicato, in cui il liquido interno perde contatto e solo il liquido esterno è in contatto con il substrato (Figura 3C). La commutazione tra le due modalità permette agli utenti di effettuare o interrompere l&#39;elaborazione del substrato e si ottiene controllando la testina-superficie o cambiando il rapporto tra i flussi di iniezione (Q i2 / Q i1). Per una data geometria del canale, l&#39;impronta del liquido di elaborazione sul substrato può essere controllata modulando condizioni di flusso (Figura 3D). hydr sodioossido (NaOH) è usato come liquido di elaborazione interna per lisare le cellule, e il lisato viene continuamente aspirato dalla superficie. Poiché gli effetti chimiche del liquido di elaborazione sono localizzati al footprint HFC interna, le celle adiacenti restano imperturbato, che consente studi spazio-temporali delle interazioni cellula-cellula. La funzionalità di scansione della MFP permette la creazione di geometrie definite dall&#39;utente di modelli cellulari (Figura 4). Inoltre, la scelta di NaOH come liquido di elaborazione accoglie analisi del DNA a valle (Figura 7).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="870">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Materials</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:291px;">Microfluidic Probe (MFP)</td>
			<td style="width:235px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Z&#252;rich</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:291px;">Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">154461</td>
			<td style="width:227px;">2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Chemicals and cell lines used</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:291px;">Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B</td>
			<td style="width:235px;">SigmaAldrich chemicals, USA</td>
			<td style="width:119px;">S5881, 252859,&#160; E9884, R6626</td>
			<td style="width:227px;">Chemicals used for processing and shielding liquids</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:291px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:235px;">Qiagen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19131</td>
			<td style="width:227px;">protease to digest denatuired proteins</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:291px;">Deconex 16 Plus</td>
			<td style="width:235px;">Bohrer Chemie, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">DNA away&#160;</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">7010</td>
			<td style="width:227px;">Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">10566-016</td>
			<td style="width:227px;">Culturing medium for epithelial cells.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">CellTracker Green CMFDA dye</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">C7025</td>
			<td rowspan="2" style="width:227px;">Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:291px;">CellTracker Orange CMRA dye</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">&#946;-actin genomic primers for qPCR</td>
			<td style="width:235px;">Integrated DNA technologies, USA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:291px;">MCF7 breast carcinoma cells</td>
			<td style="width:235px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:119px;">ATCC HTB-22</td>
			<td rowspan="2" style="width:227px;">Cell lines used to produce co-cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:291px;">MDA-MB-231 breast carcinoma cells</td>
			<td style="width:235px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:119px;">ATCC HTB-26</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Equipment and fluidic connections</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:291px;">Motorized high precision stages</td>
			<td style="width:235px;">Custom machined components.&#160; Linear axis motors from LANG GmBH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Customized linear axis stages from LT series</td>
			<td style="width:227px;">3 &#215; LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:291px;">Syringes</td>
			<td style="width:235px;">Hamilton, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">1700 TLLX series</td>
			<td style="width:227px;">Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 &#181;l range.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Nemesys low pressure syringe pumps</td>
			<td style="width:235px;">cetoni GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Component of pumping station.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Circular M1-connector</td>
			<td style="width:235px;">Dolomite microfluidics, United Kingdom&#160;</td>
			<td>3000051</td>
			<td style="width:227px;">Interface between vias in MFP head and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Tilt/rotation stage Goniometer</td>
			<td style="width:235px;">OptoSigma, USA</td>
			<td style="width:119px;">KKD-25C</td>
			<td style="width:227px;">Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">DS Fi2 HD color camera (CCD)&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Nikon, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Controlled using DS-U3 controller unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Win - Commander</td>
			<td style="width:235px;">LANG GmBH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Stage control software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Qmix Elements</td>
			<td style="width:235px;">cetoni GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Pump control software.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:235px;">Nikon, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:227px;">Basic research module for image acquisition and analysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid subtractive patterning of live cell layers with a microfluidic probe

La sonda microfluidica (MFP) facilita l&#39;esecuzione di chimica locale su substrati biologici confinando volumi nanolitri di liquidi. Utilizzando uno particolare implementazione della MFP, gerarchico idrodinamico confinamento flusso (hHFC), più liquidi vengono contemporaneamente portati in contatto con un substrato. azione chimica locale e la sagomatura del liquido utilizzando il hHFC, viene sfruttata per creare modelli cellulari da lisi a livello locale e rimuovere le cellule. Utilizzando la capacità di scansione del MFP, vengono creati i modelli definiti dall&#39;utente su monostrati di cellule. Questo protocollo consente un rapido, in tempo reale e patterning cellulare spazialmente controllata, che può permettere selettivo cellula-cellula e cellula-matrice studi di interazione.

Il protocollo descritto per la rapida patterning sottrattiva di monostrati cellulari è dimostrata utilizzando una piattaforma multi componente MFP (figure 1 e 2). Il protocollo impiega gerarchico confinamento flusso idrodinamico (hHFC; la figura 3) da trattare e rimuovere le cellule da monostrati di cellule, usando NaOH come liquido di elaborazione locale. La configurazione hHFC comprende un HFC interna ed una esterna HFC. Il NaOH confinato nel hHFC interna introduce azione chimica e taglio sulle cellule a contatto. All&#39;interno di questo ingombro, le cellule sono omogeneamente esposte all&#39;azione chimica di NaOH, a causa di trasferimento di massa di convezione guidato all&#39;interno e con diffusione trascurabile alla regione di fuori del contenimento. Il taglio sulle cellule d&#39;altra parte, può essere modificata variando la portata di NaOH. Per semplificare parametri operativi, abbiamo scelto di rendere l&#39;azione chimica il meccanismo dominante di rimozione delle cellule rispetto alla cesoia. Astimare la forza di taglio applicata dal hHFC sulla superficie, un modello ad elementi finiti è stato costruito utilizzando Comsol Multiphysics 5.0. Le simulazioni sono state condotte utilizzando il modulo CFD per flussi laminari. Due condizioni limite di ingresso alle aperture di iniezione della geometria e due condizioni al contorno di uscita verso le aperture di aspirazione (Figura 5) sono stati applicati per la gamma di portate e dimensioni dell&#39;apertura utilizzati nella dimostrazione corrente. Nel modello ottenuto, le regole di flusso dettate il profilo di taglio, mentre le portate definiti grandezza del taglio sulla superficie. In pratica, una combinazione di entrambi determina se il hHFC contatto con la superficie. Tenendo a mente questi fattori, abbiamo deciso di trovare una gamma di portate per il funzionamento al fine di ottenere la rimozione delle cellule chimicamente dominante. Per creare un hHFC, usiamo la regola del flusso di aspirazione totale al rapporto di portata iniezione di 3.5. Le altre regole di flusso utilizzate sono state definite per ridurre al minimo intasamento all&#39;interno dei canali di aspirazione,che può essere causato da proteine ​​denaturate che attaccano alle superfici di canale. Utilizzando il modello sviluppato, abbiamo trovato portate da 5 a 10 microlitri / min traslante ad uno sforzo di taglio tra 1 e 3 N / m 2. Senza l&#39;effetto chimico di NaOH, per esempio nel caso del tampone di estrazione, la sollecitazione di taglio non sarebbe tale da eliminare le cellule 19. All&#39;interno della gamma osservato, notiamo che il funzionamento a portate superiori è più pratico a causa perturbazioni nel percorso di flusso a portate basse aspirazione (cioè, Q I2 &lt;4 microlitri / min) a causa di detriti cellulari nei canali. Considerando il profilo di taglio studiato e considerazioni pratiche, portate NaOH (Q I2) di 6 e 8 microlitri / min sono utilizzate per gli esperimenti patterning e Q I1, Q A1 e Q A2 secondo le regole di flusso mostrato in figura 3. Il rapporto dei flussi iniezione (Q I2 / Q I1) permette us per modulare ulteriormente la dimensione dell&#39;impronta hHFC (Figura 3D e Figura 4B), il principio sottostante elaborato da Autebert et al. 14. Usare l&#39;abilità liquido-sagomatura della hHFC accoppiata con alta risoluzione capacità di scansione della piattaforma MFP, dimostriamo generazione griglia live-cell alle scale multiple e mostrare inoltre, l&#39;applicazione del protocollo proposta per sviluppare co-colture (Figura 4C). La piattaforma permette anche di effettuare il recupero del campione lisato per l&#39;analisi a valle. Per mostrare la qualità del lisato ottenuto, abbiamo provato localmente lisate cellule da uno e cinque impronte in due esperimenti indipendenti, che mostra la variazione della quantità di DNA ottenuti dal lisato (Figura 7). Qui, abbiamo amplificato il DNA contenuto nel lisato utilizzando primer beta-actina (in avanti: GGATGCAGAAGGAGATCACT e retromarcia: CGATCCACACGGAGTACTTG<html> ) Con 4 ml di lisato neutralizzata in ciascuna reazione PCR. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" /> Figura 1. I moduli della piattaforma MFP e la testa. (A) I moduli operativi della piattaforma comprendono siringhe, stadi motorizzati e un controller motorizzato. L&#39;MFP è collegata ad un motore Z fasi per controllare la distanza spazio tra la testina e il substrato, ed il porta substrato è attaccato al X e Y stadi motorizzati che costituiscono il sistema di scansione. (B) La testa MFP ha vias fluidici per collegare la stazione di pompaggio, i fori di montaggio per montare la testa sul Z-stage, e canali che esce dal vertice lucido. L&#39;apice è impostato complanare al substrato di coltura cellulare. anelli di Symmetric Newton possono essere osservati quando l&#39;apice e il substrato sono complanari ed a contatto.<html> p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" /> Figura 2. piattaforma MFP. La piattaforma di scansione ad alta risoluzione è dotato di un supporto testata lavorata interfacciamento con il Z-stadio ad alta precisione motorizzato. La porta substrato è collegato allo stadio XY per scopi di scansione. Per il recupero del lisato per l&#39;analisi a valle, una stazione di campionamento 3D stampato viene troncato magneticamente al lato della porta substrato (mostrato in riquadro). Pompe a siringa, un microscopio invertito, regolatori e display sono situati attorno alla piattaforma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. gerarchica confinamento flusso idrodinamico (hHFC) per controllo spaziale e temporale della rimozione delle cellule. (A) Schema di un singolo HFC. (B) nidificati e (C) Modalità di funzionamento pizzicato hHFC. (D) L&#39;immagine dell&#39;impronta per due diversi rapporti di flusso di iniezione / aspirazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" /> Figura 4. Modelli di monostrati cellulari utilizzando l&#39;MFP. (A) generazione delle cellule-griglia per la scansione programmata della MFP su un monostrato di cellule MDA-MB-231. Le cellule sono state colorate con tinture cella-tracker verde. (B) L&#39;impronta per i diversi rapporti di iniezione (n) Su un monostrato cellulare MCF7. Lo schema mostra la variazione prevista in forma di HFC interna con un cambio di n. (C) modellato co-coltura con patterning sottrattiva di MCF7 monostrato seguita da semina MDA-MB-231 cellule nelle regioni sottratte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" /> Figura 5. sollecitazione di taglio sulla superficie quando si applica hHFC. Lo sforzo di taglio sulla superficie aumenta linearmente con la portata di iniezione interna. Il punto di taglio più alto si trova tra le due aperture interne (in basso a destra ad incasso), in cui è confinato il liquido di elaborazione (linee di flusso rosso, in alto a sinistra nel riquadro). Le dimensioni dell&#39;apertura utilizzati nel modello ad elementi finiti sono 200, 100, 100 e 200 micron per i1, i2, a1e A2, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" /> Figura 6. Modalità di funzionamento della piattaforma MFP per eseguire la rimozione delle cellule e patterning. (A) Schema del percorso del flusso di patterning sottrattiva da lisi cellulare. Per semplicità, solo uno di ciascuno percorsi di iniezione e del flusso di aspirazione sono mostrati. Le siringhe sono riempite con la valvola di scarico nelle pompe. i1 e i2 sono utilizzati per l&#39;iniezione di tampone di estrazione e NaOH rispettivamente. (B) Schema del percorso di flusso per il recupero lisato. Questo percorso di flusso viene attivata dopo la raccolta del lisato cellulare per l&#39;analisi utilizzando il percorso di flusso in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">Si prega Clic</a>k qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" /> Figura 7. Analisi A valle del DNA da lisato cellulare utilizzando qPCR. Trame (A) amplificazione del DNA in lisato estratto da 5 tracce (5 FP) e 1 impronta (1 fp). I controlli sono stati estratti dopo la raccolta lisato per entrambi i casi. (B) Melt curve di DNA amplificati dal lisato mostra la qualità del DNA estratto. qPCR è stata eseguita (N = 2, n = 3) per amplificare il gene β-actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura S" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" /> Figura S1. Un&#39;immagine in scala di progettazione del canale per la testa MFP a 6 canaliutilizzati per esperimenti patterning. Canali svolgono la hHFC sono 200, 100, 100, 200 micron di larghezza e 100 micron di profondità. I due canali più esterni, che ricostituire il liquido di immersione sono 500 micron di larghezza e 100 micron di profondità. Un file GDS per lo stesso disegno è stato fornito come complementare a questo articolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe at JoVE.com

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

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Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

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Bioingegneria

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced antibiotic resistance, which poses potential health dangers, but can also be beneficial for environmental applications such as purification of drinking water. The further development of anti-bacterial therapeutics and biofilm-inspired applications will require the development of reproducible, engineerable methods for biofilm creation. Recently, a novel method of biofilm preparation using a modified three-dimensional (3D) printer with a bacterial ink has been developed. This article describes the steps necessary to build this efficient, low-cost 3D bioprinter that offers multiple applications in bacterially-induced materials processing. The protocol begins with an adapted commercial 3D printer in which the extruder has been replaced with a bio-ink dispenser connected to a syringe pump system enabling a controllable, continuous flow of bio-ink. To develop a bio-ink suitable for biofilm printing, engineered Escherichia coli bacteria were suspended in a solution of alginate, so that they solidify in contact with a surface containing calcium. The inclusion of an inducer chemical within the printing substrate drives expression of biofilm proteins within the printed bio-ink. This method enables 3D printing of various spatial patterns composed of discrete layers of printed biofilms. Such spatially-controlled biofilms can serve as model systems and can find applications in multiple fields that have a wide-ranging impact on society, including antibiotic resistance prevention or drinking water purification, among others.

This article describes a method of transforming a low-cost commercial 3D printer into a bacterial 3D printer that can facilitate printing of patterned biofilms. All necessary aspects of preparing the bioprinter and bio-ink are described, as well as verification methods to assess the formation of biofilms.

Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule

Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

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Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule