Live-Cell Imaging von Single-Cell Arrays namens LISCA ist auch ein automatisiertes Auslesen der fluoreszierenden Zeitverläufe von Hunderten von einzelnen Zellen. Der Vorteil des Ansatzes besteht darin, dass einzelne Zellantworten von räumlich isolierten Zellen in identischen Mikroumgebungen aufgezeichnet werden, was eine effiziente Emissionsanalyse mit großartigen Statistiken ermöglicht. Um ein Einzelzellarray herzustellen, schneiden Sie mit einem Skalpell ein einzelnes PDMs-Meisterwerk mit sechs Mikropulverstreifen aus der PDMs-Schicht und legen Sie das Meisterwerk mit dem Mikromuster nach oben auf die Laborbank.
Verwenden Sie eine Rasierklinge, um jeden der sechs Mikromusterstreifen in einen PDMs-Stempel zu schneiden, und schneiden Sie einige der gemusterten Bereiche ab, um sicherzustellen, dass die Kanten des Stempels offen sind. Als nächstes kratzen Sie vorsichtig die Schutzfolie des Abdeckzettels eines Sechskammerschlittens, um die Kanalpositionen des Schiebers zu markieren, und legen Sie den Abdeckschlupf mit der Schutzfolie nach unten auf die Bank. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Stempel an den markierten Kanalpositionen mit den Mikromustern nach unten auf den Deckelzettel zu legen, und überprüfen Sie die Befestigung der Stempel unter einem Mikroskop.
Die Quadrate, die mit der Folie in Kontakt kommen, erscheinen dunkler als der Zwischenraum. Die Musterqualität wird durch Quadrate verringert, die nicht richtig am Dia befestigt sind. Wenn die Stempel sicher befestigt sind, behandeln Sie den Abdeckzettel und die Stempel mit Sauerstoffplasma bei 0,2 Millibar Druck und ca. 40 Watt für drei Minuten, um die Oberflächen zwischen den PDMs-Stempeln und dem Deckelzettel hydrophil zu machen.
Legen Sie am Ende der Plasmareinigung den Deckzettel in eine Biosicherheitswerkbank und fügen Sie jedem Stempel 15 Mikroliter pegylierte Poly-L-Lysinlösung hinzu, damit die Lösung in das hydrophile Muster des Stempels aufgenommen wird. Nach 20 Minuten die Stempel mit einem Milliliter Reinstwasser abspülen. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Stempel vom Schlitten und spülen Sie den Deckelschlupf ein zweites Mal mit einem zweiten Milliliter Reinstwasser ab.
Wenn der Abdeckschlupf vollständig getrocknet ist, befestigen Sie einen sechskanaligen klebrigen Schlitten am Deckelschalung und achten Sie darauf, dass die mikrogemusterten Bereiche mit der Unterseite der Kanäle ausgerichtet sind. Und fügen Sie jedem Kanal 40 Mikroliter PBS und 40 Mikroliter Fibronektinlösung hinzu. Um die beiden Lösungen zu mischen, entfernen Sie 40 Mikroliter aus einem Reservoir und fügen Sie es dreimal dem gegenüberliegenden Reservoir desselben Kanals hinzu, um eine homogene Lösung zu erzeugen.
Wenn alle Kanäle gemischt sind, inkubieren Sie den Objektträger 45 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie jeden Kanal dreimal mit 120 Mikrolitern PBS pro Waschgang waschen. Tauschen Sie das PBS auf 37 Grad Celsius, vollständig ergänztes Zellwachstumsmedium in den Kanälen, indem Sie 120 Mikroliter Medium zu einem Reservoir hinzufügen und es aus dem gegenüberliegenden Reservoir entfernen. Fügen Sie 40 Mikroliter einer 400.000 Zellen pro Milliliter Zellsuspension von Interesse und 40 Mikroliter Zellwachstumsmedium zu jedem Kanal hinzu und mischen Sie die Zelllösung mit dem Medium, wie gezeigt.
Nach dem Mischen 40 Mikroliter Suspension aus jedem Kanal entfernen, so dass nur die Kanäle mit Zellsuspension gefüllt sind, und legen Sie den Objektträger in einen Zellkulturinkubator. Überprüfen Sie nach einer Stunde die Zelladhäsion durch Phasenkontrastmikroskopie, fügen Sie jedem Kanal 120 Mikroliter mit 37 Grad Celsius Zellwachstumsmedium hinzu und bringen Sie den Objektträger für drei weitere Stunden in den Zellkulturinkubator zurück. Um ein Perfusionssystem einzurichten, schließen Sie eine ein Milliliter große Spritze an, die mit 37 Grad Celsius Zellwachstumsmedium gefüllt ist, an das Einlassrohr des Systems und verwenden Sie das Ventil, um das Rohr mit Medium zu füllen.
Schließen Sie das Einlassrohr an das Reservoir eines Kanals an, achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, und schließen Sie einen seriellen Anschluss an den Behälter gegenüber dem Einlassrohr des Stromkanals an. Verbinden Sie die restlichen Kanäle wie gezeigt, bis die erforderliche Anzahl von Kanälen in Reihe geschaltet ist. Und verbinden Sie das Auslassrohr direkt mit dem freien Reservoir des Endkanals.
Füllen Sie dann das angeschlossene Röhrchen mit Medium, um zu bestätigen, dass das Perfusionssystem nicht ausläuft. Für die Zeitraffer-Bildgebung der Zellen, um ein Zeitrafferprotokoll für die Aufzeichnung eines Phasenkontrastbildes und eines Fluoreszenzbildes einzurichten, legen Sie die optische Konfiguration für die Phasenkontrastbildgebung und die Fluoreszenzbildgebung fest. Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv, die entsprechenden Fluoreszenzfilter und ein automatisiertes Fokuskorrektursystem, um eine bessere Bildqualität für die Langzeitmessungen zu gewährleisten.
Wählen Sie eine Belichtungszeit von 10 Millisekunden für die Phasenkontrastaufnahme und eine Belichtungszeit von 750 Millisekunden für die Aufzeichnung der EGFP-Fluoreszenzintensität. Legen Sie einen Zeitplan mit einem 10-minütigen Zeitintervall zwischen den aufeinanderfolgenden Schleifen durch die Positionsliste und einer Beobachtungszeit von 30 Stunden fest. Als nächstes legen Sie den sechs Kanalschieber auf die einzelne Kellererhöhung im Probenhalter der 37 Grad Celsius Heizkammer des Mikroskops und kleben den Perfusionssystemschlauch auf die Bühne.
Führen Sie die freien Enden der Auslassrohre in ein 15 Milliliter konisches Rohr ein, um den flüssigen Abfall aufzufangen. Und stellen Sie die Positionsliste für die Scanzeitraffermessung ein und achten Sie darauf, dass die Anzahl der Positionen innerhalb des definierten Zeitintervalls zwischen aufeinanderfolgenden Schleifen durch die Positionsliste gescannt werden kann. Starten Sie dann die Zeitraffermessung.
Für die Transfektion der Zellen mit einem fluoreszierenden Marker verwenden Sie eine Spritze, um das Schlauchsystem mit einem Milliliter von 37 Grad Celsius PBS zu spülen, wobei darauf zu achten ist, dass sich der Mikroskoptisch nicht bewegt. Füllen Sie das System nach dem Spülen mit 300 Mikrolitern serumreduziertem Medium, ergänzt mit der interessierenden mRNA, auf eine Endkonzentration von 0,5 Nanogramm mRNA pro Mikroliter und lassen Sie die Lipoplexe eine Stunde lang inkubieren. Am Ende der Inkubation spülen Sie das System mit einem Milliliter 37 Grad Celsius vollständiges Zellwachstumsmedium, um ungebundene mRNA zu entfernen.
Zeigen Sie am Ende der Analyse die im Kanalmenü aufgeführten Kanäle an und scrollen Sie durch die Zeitrahmen, um die vorausgewählten Zellen und ihre integrierten Fluoreszenzsignale zu überprüfen. Klicken Sie auf eine Zelle von Interesse, um ihren Fluoreszenzzeitverlauf hervorzuheben, oder klicken Sie auf einen Zeitverlauf, um die entsprechende Zelle zu finden. Drücken Sie die Umschalttaste, während Sie auf eine Zelle klicken, um sie zu markieren oder die Auswahl zu deaktivieren.
Deaktivieren Sie alle Zellen, die nicht lebensfähig oder nicht auf einen Adhäsionsfleck beschränkt sind oder die an eine andere Zelle gebunden sind, um sie von der weiteren Analyse auszuschließen. Wenn alle Zellen entsprechend an- oder abgewählt sind, speichern Sie die Einzelzellzeitkurse für den Zellbereich und die integrierte Fluoreszenz in einem entsprechenden Verzeichnis. Um die Translationseintrittszeit nach der Transfektion und die Stärke der zellulären EGFP-Expression zu quantifizieren, kann ein dreistufiges Translationsmodell verwendet werden.
Die Modelllösung für EGFP kann wie dargestellt auf Einzelzell-Zeitkurse angepasst werden. Hier können Histogramme der Translationseintrittszeit und der Expressionsrate von Lipoplex-transfizierten Zellen beobachtet werden. Da beide Parameter für jede Zelle geschätzt werden, kann die Korrelation dieser Parameter, wie im Streudiagramm gezeigt, analysiert und mit Zellen verglichen werden, die mit Lipidnanopartikeln transfiziert sind.
Wie dargestellt, weisen Zellen, die mit Lipidnanopartikeln transfiziert wurden, eine geringere Zell-zu-Zell-Variabilität auf als Zellen, die mit Lipoplexen transfiziert sind. Und der Bevölkerungsdurchschnitt zeigt einen schnelleren Beginn der Übersetzung sowie eine höhere Ausdrucksrate. Unser Ansatz kann auch an alternative Micro-Patterning-Methoden angepasst werden.
Am wichtigsten für LISCA ist ein guter Zelleinschluss und eine Kombination aus automatisierter Bildanalyse mit einer komfortablen Benutzerüberwachung. Wie Sie gesehen haben, ist das Zellverhalten heterogen. Und Einzelzell-Zeitrafferfilme bieten Zugang zu unvoreingenommenen Dynamiken der inhärenten biochemischen Netzwerke.
Zum Beispiel in grüner Expression, Apoptose oder zelltötenden Assays.
