This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

1. HDL Reinigung (~ 5,5 Tage) <ol><li> Density-Ultrazentrifugation (DGUC, ~ 5 Tage) <ol><li> In 90 ul 100x Anti-Oxidantien zu 9 ml Plasma isoliert aus frischem venösen Blut. </li><li> Einstellen Plasmadichte mit KBr von 1,006 g / ml bis 1,025 g / ml durch Zugabe von 0,251 g KBr bis 9 ml Plasma aus Schritt 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr Plasma). Schaukeln Sie das Plasma, bis alle das Salz bei Raumtemperatur aufgelöst ist, und Rohre zu Ultracentrifuge und sicherzustellen, dass alle Blasen nach oben steigen. </li><li> Biegen Sie die Spitze eines 18-G-Nadel auf 90 ° 1 cm von der Spitze, mit Blick auf Kegel Seite nach oben. Unter Verwendung einer Spritze und die 18-Gauge - Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 1 über die Plasma (Tabelle 1). HINWEIS: Die gebogene Nadel sorgt für all die VLDL / IDL, LDL und HDL mit dem Overlay entfernt werden ohne Mischen. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der Blasen an der Spitze, so dass 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres und carefully Die Röhrchen in SW-40Ti Eimer. </li><li> Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer (Eimer + cap) Balance: # 1 bis # 4, # 2 bis # 5 und # 3 bis # 6. Hinweis: Diese Eimer müssen jederzeit ausgeglichen und abgestimmt sein. </li><li> Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage einer Spritze und gebogenen Nadel. Dies wird die VLDL / IDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C. </li><li> die VLDL / IDL-Fraktion, sammeln die restlichen 7 mL Probe (Plasma) und legen Sie es in eine 15 ml konischen Röhrchen Nach dem Entfernen. Bringen Sie das Volumen der Probe bis zu 9 ml mit Overlay - Lösung # 2 (Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie die Probendichte von 1,025 g / ml bis 1,080 g / ml mit KBr mitca. 0.746 g KBr in 9 ml Probe oder 0,0828 g / ml KBr Probe. Schütteln Sie die Probe, bis das gesamte KBr gelöst (ca. 20 min) und das Übertragungsrohr zu Ultracentrifuge während sichergestellt Blasen nach oben steigen. </li><li> Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 3 über die Probe (Tabelle 1). Lassen Sie 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen am oberen Ende des Rohres und legen Sie sorgfältig die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer. </li><li> Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe balancieren, wie in 1.1.5. </li><li> Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage unter Verwendung einer Spritze und seinnt Nadel. Dies wird die LDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C. </li><li> Nach der LDL-Fraktion zu entfernen, sammeln die verbleibenden annähernd 7 ml Probe (Plasma) und legen Sie sie in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie das Volumen der Probe (Plasma) bis zu 9 ml mit 1,080 g / ml - Lösung # 4 (Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie die Probendichte von 1,080 g / ml bis 1,30 g / ml KBr unter Verwendung 3,33 g KBr in 9 ml Probe (Plasma) oder 0,37 g KBr pro ml Probe. Rock oder leicht die Probe rühren, bis das gesamte KBr (Salz) aufgelöst ist, und Rohr Ultracentrifuge. </li><li> Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 5 über die Probe (Tabelle 1). </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen an der Spitze des Rohres, 2- 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres zu verlassen und sorgfältig legen die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer. </li><li> Wiegen Sie jede Schaufel (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe, wie in 1.1.5 balancieren. </li><li> Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 48 h bei 4 ° C mit einem # 4 Bremse. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig mit einer Spritze und verbogene Nadel ca. 2 ml aus der oberen Schicht des Overlays verwenden. Dies ist der HDL-Fraktion, die bei 4 ° C oder -80 ° C gelagert werden kann. HINWEIS: Nach DGUC HDL kann die Hochsalzlösungen zu entfernen dialysiert werden. </li><li> Um dialysiere, legen Sie die gesammelten HDL-Fraktion in einem verschlossenen Dialysehülse (10.000 MW cut-off) und über Nacht in 1 L 1x PBS dialysiert. Ändern Dialysepuffer (1x PBS) 3-mal mehr als 24 Stunden. Sanfte Störung des PBS mit einem magnetischen Rührstab wird die Dialyse zu verbessern. </li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration des DGUC-HDL 8 ein BCA - Methode. </li></ol></li><li> Schnell-Protein Liquid Chrographie (FPLC) oder Grßenausschlußchromatographie (~ 6 h) <ol><li> Filter 1,2 mg DGUC-HDL (Gesamtprotein) in 500 &amp; mgr; l durch einen 0,22 &amp; mgr; m Mikrozentrifugenfilter (siehe Liste der Materialien), unmittelbar vor der Injektion. HINWEIS: Eine zusätzliche Filterung des DGUC-HDL Probe durch ein 0,45 um-Mikrozentrifugenfilter vor dem 0,22 um-Filter kann für einige Proben erforderlich sein. </li><li> Sammeln Sie die gefilterten DGUC-HDL-Probe, laden Sie die FPLC (Füllung) Injektionsspritze, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Spritze sind, bevor sie in die FPLC injiziert wird. </li><li> Stellen Sie die FPLC Flussrate auf 0,3 ml / min bei einer Druckgrenze bei 2,6 MPa. Äquilibrieren Säulen mit 0,2 Säulenvolumen (ca. 15 ml) der Puffer vor Injektion abzutasten. Injizieren Sie die Probe mit 3 ml Puffer in die FPLC (Injektionsschleife) Instrument und den Lauf starten. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen für insgesamt 72 Fraktionen. </li></ol></li></ol> 2. Hochdurchsatz-Small RNASequenzierung (sRNAseq, ~ 9 Tage) <ol><li> RNA - Isolierung (~ 1 Tag) <ol><li> Identifizieren der FPLC-Fraktionen DGUC-HDL entspricht, die von Gesamt-Cholesterinspiegel Bestimmen eines kolorimetrischen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Mit dieser FPLC Set-up, erwarten zu finden 6 - 7 FPLC Fraktionen, die DGUC-HDL. </li><li> Sammle alle Volumen (ca. 8 -1 0 ml Pool von 1,45 ml Fraktionsvolumina) von DGUC-HDL FPLC-Fraktionen und konzentriere unter Verwendung von 10 kDa MG Rückhalte Zentrifugalfilter Einheiten bei 4.000 × g für 1 h bei 4 ° C oder bis HDL Konzentrat beträgt etwa 100 &amp; mgr; l. </li><li> Sammeln Sie die HDL - Konzentrat und quantifizieren HDL Gesamtproteinkonzentration 8 der BCA - Methode. </li><li> Bestimmen die höchste Konzentration an HDL Gesamtprotein, bis zu 1 mg, die aus jeder Probe in dem Satz aliquotiert werden kann. B. Isolierung für jede Probe RNA aus der gleichen Menge an HDL Gesamtprotein. </li><li> Führen RNA-Isolierung verwendetein modifiziertes Protokoll (siehe Liste der Materialien). <ol><li> In 10x Volumen Phenol Lysereagenz (siehe Liste der Materialien) Probe und Vortex für 1 min. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In Chloroform (20% Reagenz Volumen in Schritt 2.1.5.1 verwendet Phenol Lyse) und kräftig schütteln, 15 s. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 12.000 × g bei 4 ° C in einer Kühlzentrifuge. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen, die Vermeidung der Interphase. </li><li> Hinzufügen 1,5x Volumen von 100% Ethanol zu der wässrigen Phase und vortex für 1 min. </li><li> Store Proben für mindestens 1 h oder über Nacht bei -80 ° C. </li><li> Fahren Sie mit dem RNA-Isolierung Protokoll der mitgelieferten Mini-Spalten verwenden. </li><li> Eluieren mit 30 &amp; mgr; l RNase-freiem H 2 O. Erste hinzuzufügen 15 ul H 2 O direkt auf die Fritte, Schleudern bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g) für 2 min, undSpin dann bei hoher Geschwindigkeit (max) für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt mit zusätzlichen 15 &amp; mgr; l H 2 O </li></ol></li><li> Fahren Sie direkt mit sRNA Bibliothek Generation oder bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Bibliothek Generation (~ 6 h) <ol><li> Bereiten Sie sRNA cDNA-Bibliotheken, die sRNA Bibliothek Generation Kit-Protokoll, als den Anweisungen des Herstellers mit einer Modifikation der PCR-Amplifikation wie nachfolgend beschrieben. <ol><li> Bereiten Sie die PCR - Mastermix auf Eis mit 0,5 ul DNase / RNase-freiem H 2 O, 15 &amp; mgr; l PCR - Mix (PML) und 1 &amp; mgr; l RNA - PCR - Primer (RP1) pro Probe (einen zusätzlichen 10% zum Pipettieren Fehler). </li><li> In 16,5 ul der PCR-Mix zu jedem (cDNA) Probe. </li><li> einen Index / Barcode-Nummer zu jeder Probe zum Multiplexen zuweisen und 1 &amp; mgr; l PCR Primer Index (auf die entsprechende Nummer) zu der Probe hinzuzufügen. </li><li> Führen Sie eine schnelle Drehung der Mikrofuge verwenden. HINWEIS: Das Gesamtvolumen solltejetzt 30 ul pro Probe sein. </li><li> Führen Sie die Zyklusbedingungen für die PCR - Amplifikation wie in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt. </li></ol></li></ol></li><li> Größe auswählen sRNA - Bibliothek zu entfernen Adapter: Adapter (~ 1,5 h) <ol><li> Führen Sie Größe der Bibliothek-Auswahl unter Verwendung einer automatischen DNA-Größenwähler gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Größenparameter: Ziel: 156 bp, Beginn: 135 bp, Ende: 177 bp, Bereich Flag: Breit. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 h) <ol><li> Clean up größenselektierten sRNA cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Eluieren sauber und konzentriert sRNA cDNA mit 2 x 7 ul DNase / RNase-freiem H 2 O. </li></ol></li><li> Quantifizieren und Beurteilen sRNA cDNA - Bibliothek Ertrag und Qualität (~ 1 h) <ol><li> Beurteilen Sie sRNA cDNA-Bibliothek Qualität und Größe unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Chip auf einem Bioanalyzer (Materialliste) gemäß manufacturer Anweisungen. </li><li> Quantifizieren der einzelnen sRNA cDNA-Bank-Konzentrationen unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Test (Materialliste), gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Proben mit unterschiedlichen Indizes haben auf der gleichen Spur der Flusszelle, wenn möglich ausgeführt werden. Wenn mehr als eine Spur erforderlich ist, mischen Fall und Kontrollproben geeignet. </li></ol></li><li> Hochdurchsatz - Sequenzierung sRNA (~ 7 Tage) <ol><li> Pool einzelne indiziert sRNA Bibliotheken basierend auf äquimolare Konzentrationen. </li><li> Bildschirm gepoolt sRNA Bibliotheken für Qualität mit hoher Empfindlichkeit DNA-Chip auf der Bioanalyzer und bestimmen Bibliothek DNA-Konzentration wie in 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Führen quantitative PCR (qPCR) des Adapters geeignete Inhalte Sequenzierungstiefe mit Hilfe der Sequenzierung Bibliothek qPCR Quantifizierung Kit, um sicherzustellen, laut Herstellerangaben (Materialliste). </li><li> Führen Sie die Sequenzierung eines einzelnen Lese verwenden, 50 b25 M liest / Probe, gemäß den Anweisungen des Herstellers - p-Protokoll eine Tiefe von etwa 20 zu erreichen. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse (~ 1 Tag) <ol><li> Verwenden Sie bcl2fastq2, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen vorverarbeiten rohen fastq Dateien von demultiplexten Proben (Materialliste). </li><li> Verwenden Sie Cutadapt zu trimmen Adapter 9 und entfernen Sie liest &lt;16 Nukleotiden (nts) in der Länge, wie pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste). </li><li> Entfernen Kontamination Sequenzen, die in den sRNA Bibliotheken, einschließlich Stop-Lösung Sequenz (STP: CCACGTTCCCGTGG) und Adapter Übertrag (CTACAGTCCGACGATC) mit removeSequenceInFastq Funktion in NGSPERL Rahmen, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). </li><li> Führen Sie die Qualitätskontrolle Metriken von FastQC mit Center for Quantitative Sciences (CQS) Werkzeuge, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). </li><li> Generieren Sie nicht redundante Liste der &quot;identisch&quot; liest (Zusammenbruch redundant liest) und Zahlen Rekordkopie CQSTools, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). </li><li> Richten Sie liest menschlichen Genoms Bowtie1.1.2 ermöglicht ein Mismatch (Optionen: -a -m 100 --bester --strata -v 1), pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste). </li><li> Führen Sie lesen Ausrichtung, Zählen, und führen Verdichtungsaufgaben mit NGSPERL, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen. </li><li> Konvertieren Sie exportierte Zählung Tabelle in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li><li> Normalisieren liest einer bestimmten Klasse (zB miRNAs) zur Gesamtzahl der für diese Klasse lautet (zB Gesamtzahl der miRNAs liest) und Bericht - Signale als Lesevorgänge pro Mapped miRNA (RPMM). (ZB RPMM = (miR-X / Gesamtanzahl von miRNA liest) * 1.000.000). </li><li> Eingang normalisiert Zählung Tabelle als generische einzelne Farbtechnologie in Software für Low-Level-und High-Level-Differenzanalysen gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). HINWEIS: Zur Zeit gibt es keine gut charakterisierten Housekeeping-Gene / SRNWie für HDL-sRNA. Ein Spike-Kontrolle kann verwendet werden, kann aber problematisch sein. Normalisieren zum Gesamtprotein Eingang oder Volumen wird empfohlen, HDL. Am wichtigsten ist, ist es empfehlenswert, Sequenzierungsergebnisse von einem der verschiedenen Strategien zur Validierung miRNAs und sRNAs mittels real-time PCR oder quantitative PCR quantifiziert werden. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge.">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll wurde entwickelt miRNAs und andere sRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Real-Time PCR auf hochreines HDL zu quantifizieren. Wie bei jedem Ansatz sollte besondere Überlegungen zu jedem Schritt in dem Verfahren zur Reinigung von HDL und RNA und dann sRNAs Quantifizieren gegeben werden. Dieses Protokoll wird für Projekte mit ≥ 2 ml Plasma gestartet wird. Dennoch können qualitativ hochwertige RNA Analysen erfolgreich mit HDL von so wenig wie 80 &amp; mgr; l des menschlichen oder Maus-Plasma unt...

Die extrazelluläre nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) stellen eine neue Klasse von Krankheit Biomarker und potentielle therapeutische Targets und wahrscheinlich erleichtern Zell-zu-Zell - Kommunikation 1. Die am häufigsten untersuchten Typ von sRNA sind Mikro - RNAs (miRNAs) , die etwa 22 nts lang sind und aus längeren Vorläuferformen und primären Transkripte 2 verarbeitet. miRNAs wurden posttranskriptionell demonstriert die Genexpression durch Unterdrückung der Proteintranslation und die Induktion von mRNA - Abbau 2 regulieren. Dennoch sind miRNAs nur eine von vielen Arten von sRNAs; wie sRNAs kann von den Eltern tRNAs (tRNA-derived sRNAs, TDR), small nuclear RNAs (sRNA-derived sRNAs, sndRNA), kleine nucleolar RNAs (snoRNA abgeleitete sRNAs, snRNA), ribosomale RNAs (rRNA-abgeleitete sRNAs gespalten werden, RDR ), Y RNAs (yDR) und verschiedene andere RNAs 1. Einige Beispiele dieser neuartigen sRNAs wurden berichtet miRNAs ähnlich zu funktionieren; jedoch die biologische funktionen vieler dieser bleibt sRNAs bestimmt werden, obwohl Rollen in Genregulation 3-6 wahrscheinlich sind. Interessanterweise sind miRNAs und andere sRNAs stabil in extrazellulären Flüssigkeiten, einschließlich Speichel, Plasma, Urin und Galle. Extrazellulärem sRNAs wahrscheinlich von RNasen durch ihre Assoziation mit extrazellulären Vesikeln (EV), Lipoproteine ​​und / oder extrazellulären Ribonukleoprotein-Komplexe geschützt. Zuvor haben wir berichtet , dass Lipoproteine, nämlich High-Density - Lipoproteine (HDL), Transport miRNAs in Plasma 7. In dieser Studie wurden HDL unter Verwendung einer sequenziellen Methode der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) isoliert, schnell-Protein-Flüssigchromatographie (Grßenausschlußchromatographie Gelfiltration, FPLC) und Affinitätschromatographie (anti-Apolipoprotein AI (ApoA-I) Immunpräzipitation 7). Mit beiden real-time PCR-basierten Low-Density-Arrays und einzelne miRNA-Assays wurden miRNA Ebenen auf HDL quantifiziert isoliert von heilendeine und hypercholesterolemic Themen 7. Mit diesem Ansatz konnten wir miRNAs zu profilieren und spezifischen miRNAs in hochreiner HDL Vorbereitungen zu quantifizieren. Seit 2011 haben wir festgestellt, dass, obwohl die Affinitätschromatographie HDL Reinheit verbessert, Antikörpersättigung Ausbeute stark begrenzt und kann kostspielig sein. Derzeit empfiehlt unser Protokoll einen zweistufigen sequentiellen Tandemverfahren DGUC durch FPLC gefolgt, die auch hochwertige HDL Proben für Downstream-RNA-Isolierung und Quantifizierung sRNA erzeugt. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz - Sequenzierung von sRNAs (sRNAseq), zB miRNAs, und das erhöhte Bewusstsein für andere nicht-miRNA sRNA Klassen ist sRNAseq die aktuellen State-of-the-art in miRNA und sRNA Profilierung. Als solches unser Protokoll empfiehlt miRNAs und andere sRNAs auf HDL-Proben unter Verwendung von sRNAseq zu quantifizieren. Dennoch kann Gesamt-RNA aus HDL isoliert auch einzelne miRNAs und andere sRNAs oder validieren sRNAseq Ergebnisse mit real-time PCR eine Quantifizierung verwendet werdenpproaches. Hier beschreiben wir ausführlich ein Protokoll für die Erfassung, Reinigung, Quantifizierung, Datenanalyse und Validierung von hochreinem HDL-sRNAs. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die Machbarkeit und den Prozess der sRNA Quantifizierung in hochreiner HDL aus menschlichem Plasma isoliert zu demonstrieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:205px;">A99839</td>
			<td style="width:307px;">Optima XPN-80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:207px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:205px;">331362</td>
			<td>SW-41Ti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">AKTA Pure FPLC System</td>
			<td style="width:207px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:205px;">29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line</td>
			<td style="width:207px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:205px;">28990944</td>
			<td>10/300 gl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">SynergyMx</td>
			<td style="width:207px;">BioTek Instruments</td>
			<td style="width:205px;">7191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:207px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">75004525</td>
			<td>Sorvall ST40R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:205px;">22629867</td>
			<td>5417R (purchased through USA Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Microfuge&#160;</td>
			<td style="width:207px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:205px;">2631-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">PippenPrep</td>
			<td style="width:207px;">Sage Science</td>
			<td style="width:205px;">PIP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">2100 Bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Agilent</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">High Sensitivity DNA Assay</td>
			<td style="width:207px;">Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Sequencing Library qPCR Quantification Kit</td>
			<td style="width:207px;">Illumina</td>
			<td>SY-930-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">ProFlex Thermal Cycler</td>
			<td style="width:207px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:205px;">4484073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">QuantStudio 12k Flex</td>
			<td style="width:207px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:205px;">4471134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">EpMotion Robot</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:205px;">960000111</td>
			<td>5070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:205px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Potassium Bromide</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:205px;">P205-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:207px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Micro-centrifugal filters 0.45&#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">UFC30HV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Micro-centrifugal filters 0.22&#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td>
			<td style="width:207px;">Qiagen</td>
			<td style="width:205px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Total Cholesterol colormetric kit</td>
			<td style="width:207px;">Cliniqa (Raichem)</td>
			<td style="width:205px;">R80035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">10,000 m.w. cut-off centrifugation filter</td>
			<td style="width:207px;">Amicon</td>
			<td style="width:205px;">UFC801024</td>
			<td>purchased through Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:207px;">Axygen</td>
			<td style="width:205px;">PCR-0208-C</td>
			<td>purchased through Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">microRNA RT kit</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:205px;">4366597</td>
			<td>For 1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">PCR master mix</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:205px;">4440041</td>
			<td>50 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Pierce BCA kit</td>
			<td style="width:207px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:207px;">Zymo</td>
			<td style="width:205px;">D4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:207px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:205px;">132118</td>
			<td>purchased through Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">bcl2fastq2</td>
			<td style="width:207px;">Illumina</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Cutadapt</td>
			<td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">NGSPERL</td>
			<td>github.com/shengqh/ngsperl</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">CQSTools</td>
			<td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Bowtie 1.1.2&#160;</td>
			<td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">GeneSpringGX13.1.1</td>
			<td style="width:207px;">Agilent</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
</table>

isolation of high-density lipoproteins for non-coding small rna quantification

Die Vielfalt der kleinen nicht-kodierenden RNAs (sRNA) ist schnell wachsenden und ihre Rollen in biologischen Prozessen, einschließlich der Genregulation, entstehen. Interessanterweise sRNAs werden auch außerhalb der Zellen und sind stabil in allen biologischen Flüssigkeiten gefunden. Als solche stellen extrazelluläre sRNAs eine neue Klasse von Krankheits Biomarkern und werden in Zellsignalisierung und interzellulare Kommunikationsnetze wahrscheinlich beteiligt. Ihr Potenzial als Biomarker beurteilen kann sRNAs im Plasma, Urin und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden. Dennoch vollständig die Wirkung von extrazellulärem sRNAs als endokrine Signale zu verstehen, ist es wichtig , zu bestimmen , welche Ladungsträger zu transportieren und sie in biologischen Flüssigkeiten (zB Plasma) zu schützen, das Zellen und Gewebe zu extrazellulärem sRNA Pools tragen und Zellen und Gewebe fähig des Annehmens und der extrazellulären sRNA verwendet. Um das zu erreichen, diese Ziele ist es entscheidend, hochreine Populationen von extrazellulären Träger zu isolierenfür sRNA Profilierung und Quantifizierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass Lipoproteine, insbesondere Lipoproteine ​​hoher Dichte (HDL), transportiert funktionelle mikroRNAs (miRNAs) zwischen Zellen und HDL-miRNAs sind Krankheit signifikant verändert. Hier Detail, das wir ein neues Protokoll, das Tandem-HDL-Isolierung mit Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC) und Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) verwendet zu erhalten hochreine HDL für Downstream-Profilierung und Quantifizierung aller sRNAs, einschließlich miRNAs, die beide hoch mit -throughput Sequenzierung und Real-Time-PCR-Ansätze. Dieses Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von sRNAs auf HDL sein.

Dieses Protokoll ist eine Reihe von etablierten Methoden miteinander verbunden sind für die Quantifizierung von sRNAs auf hochreine HDL durch Hochdurchsatz - Sequenzierung oder Echtzeit - PCR (1) zu ermöglichen. Um die Machbarkeit und die Auswirkungen dieses Protokoll zeigen, HDL wurde aus Humanplasma durch das Tandem DGUC und FPLC-Methode gereinigt. Collected FPLC-Fraktionen zu HDL (von Cholesterinverteilung) wurden konzentriert, und Gesamt-RNA wurde aus 1 mg von HDL ...

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.2K Aufrufe.  Vanderbilt University School of Medicine. This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Serie: Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.