Die Analyse von Plasmalipoproteinen ist sehr wichtig für die Diagnose von Hyperlipidämie und die Untersuchung von Arteriosklerose. In diesem Protokoll führen wir die grundlegende Methode mit Ultrazentrifugation ein, um Plasma-Lipoproteine zu isolieren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, einen Milliliter Plasma zu verwenden, um sieben Lipoproteinfraktionen zu isolieren.
Diese Fraktionen können für die Lipide, Apolipoproteine, sowie gut-funktionelle Studien diese Methode kann sowohl für menschliche und tierische Proben für die Diagnose von Dyslipidämie und die damit verbundene Krankheit angewendet werden. Beginnen Sie mit der Übertragung eines Milliliters Plasma in jedes Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr. Dann laden Sie die Rohre in einem festen Winkel Rotor und zentrifugieren Sie das Plasma bei 356, 000 mal G für 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius.
Passen Sie die Position der Klinge im Rohrschneider auf eine Ebene zwischen der oberen und der unteren Fraktion an. Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie die obere Fraktion, etwa 200 Mikroliter, in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung.
Passen Sie das Gesamtvolumen auf 800 Mikroliter an, indem Sie die gleiche Dichtelösung hinzufügen. Passen Sie den unteren Anteil auf eine Dichte von 1,02 Gramm pro Milliliter an, indem Sie 58,9 Mikroliter 1,21 Gramm pro Milliliter Lösung und 141,1 Mikroliter 1,02 Gramm pro Milliliter Lösung für ein Gesamtvolumen von einem Milliliter hinzufügen. Beladen Sie diese Rohre im Festwinkelrotor und zentrifugieren bei 356.000-fachem G für 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius.
Fahren Sie mit dem Sammeln der oberen Fraktionen fort, passen Sie die Dichte der unteren Fraktionen an und zentrifugieren Sie für Diebdichten von 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 und 1,21 Gramm pro Milliliter. Für die letzte Ultrazentrifugation zentrifugieren Sie bei 513. 000 mal G für vier Stunden bei vier Grad Celsius. Lipoproteinprofile von Kaninchen, die entweder mit einer normalen Standarddiät oder einer cholesterinreichen Ernährung gefüttert werden, werden hier gezeigt.
Kaninchen sind Pflanzenfresser, daher sind ihre Plasma-TC-, TG- und PL-Spiegel im Allgemeinen niedriger als die von Menschen und Mäusen. Bei normalen Standard-Diätkaninchen wird TC hauptsächlich in HDL3 und LDL vertrieben. Bei Wildkaninchen mit normaler Standarddiät werden 39 % des Plasma-TG in VLDLs verteilt, während 57 % der Plasma-PL in HDL3 enthalten sind.
Wenn Kaninchen mit einer cholesterinreichen Ernährung herausgefordert wurden, entwickelten sie schnell Hypercholesterinämie. Ihre Lipoproteinprofile zeichneten sich durch eine deutliche Erhöhung von VLDLs aus. Sieben Lipoproteinfraktionen von Wildkaninchen, die entweder einen normalen Standard oder eine cholesterinreiche Ernährung fütterten, wurden auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel betrieben und mit CBB-Färbung visualisiert.
Bei einer diäteten High-Cholesterin-Diät wurden sowohl ApoB-100- als auch ApoE-Gehalt ein VLDLs, IDLs und LDLs deutlich erhöht. Western Blotting wurde verwendet, um Apolipoproteine und Lipoproteinprofile von drei verschiedenen hyperlipidemischen Kaninchen zu vergleichen: hochcholesterin gefütterte Wildkaninchen, ApoE Knockout Kaninchen und Watanabe Heritable Hyperlipidemic Kaninchen mit LDL-Rezeptormangel. Die ApoB-haltigen Partikel von kaninchen mit hoher Cholesterin-Diät, die wild gefüttert werden, zeichnen sich durch einen erhöhten ApoB-100- und ApoE-Gehalt aus, während ApoE-Knockout-Kaninchen zusammen mit dem Auftreten von ApoA-1 einen Anstieg von ApoB-48 zeigten.
Watanabe Heritable Hyperlipidemic Kaninchen sind genetisch mangelhaft in LDL-Rezeptor-Funktionen, so dass eine deutliche Zunahme von ApoB-100 in LDLs begleitet von reduzierten ApoA-1 in HDLs beobachtet wurde, ähnlich wie menschliche familiäre Hypercholesterinämie-Patienten. Die Beispielwiederherstellung ist in diesem Verfahren am wichtigsten. Um den Probenverlust zu minimieren, sollte man vorsichtig sein, Fraktion zu sammeln und die viskose Ausfällung im unteren Bruch vollständig aufzulösen.
Nach der Entnahme von sieben Lipoproteinfraktionen ist für die Sortierung eine Dialyse erforderlich. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, die Lipoproteinproben für die Analyse mit SDS-Seite, Western Blotting, und zellbasierte Studie. Im klinischen Umfeld trennt die Ultrazentrifugation Lipoproteine in der Regel in vier Fraktionen.
Die aktuelle Methode kann sieben Lipoproteinfraktionen isolieren, was mehr Details von Lipoproteinen für die Untersuchung der Hyperlipidämie liefert.
