Dieses Protokoll bietet eine Methode zur genomweiten Identifizierung von RNA-Interaktoren eines RNA-bindenden Proteins PKR. Es hilft uns, die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression durch RNA-bindendes Protein besser zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine effiziente Vernetzung von Formaldehyd nutzt, um RNase gebunden an RNA-bindende Proteine zu fixieren und durch Immunpräzipitation anzureichern.
Aktivierte PKR wird bei Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson und Alzheimer beobachtet. Die Identifizierung der PKR-interagierenden doppelsträngigen RNase wird uns helfen, die Pathogenese dieser degenerativen Krankheiten besser zu verstehen. Diese Methode kann verwendet werden, um RNA-Interaktoren von allen RNA-bindenden Proteinen zu untersuchen.
Insbesondere glauben wir, dass diese Methode nützlich ist, um Proteine zu untersuchen, die die strukturierte RNase erkennen, wie z. B. doppelsträngige RNase. Überprüfen Sie die Homogenität der zyklusfestgefahrenen Probe, bevor Sie Zellen ernten. Darüber hinaus ist es wichtig, die Immunpräzipitationseffizienz mit dem besten verfügbaren Antikörper zu optimieren.
Zunächst werden 750 000 oder eine Million HeLa-Zellen für S- bzw. M-Phasen-verhaftete Proben ausgesät. Wachsen Sie Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Behandeln Sie die Zellen mit zweimillimolarem Thymidin, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann fügen Sie frische Medien hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für neun Stunden. Bei S-Phasen-verhafteten Zellen, behandeln Sie Zellen mit zweimillimolarem Thymidin.
Bei M-Phasen-verhafteten Zellen, behandeln Sie Zellen mit 100 Nanogramm pro Milliliter Nocodazol. 15 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Für eine S-Phasen-Probe Zellen mit einem Zellschaber sammeln und in eine 15-Milliliter-Konustube übertragen.
Tippen Sie für eine M-Phasen-Probe auf die Seite der Zellkulturschale, um M-Phasen-verhaftete Zellen zu lösen, und übertragen Sie sie in eine 15-Milliliter-Konikonröhre. Anschließend zentrieren Sie die Zellen bei 380 g bei Raumtemperatur für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen mit einem Milliliter kalter PBS wieder aus.
Übertragen Sie Zellen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 10.000 g bei vier Grad Celsius für 30 Sekunden und entfernen Sie die Überräube vollständig. Um formaldehyd-Vernetzung durchzuführen, fügen Sie zunächst 750 Mikroliter 0,1% Paraformaldehyd in die Zellen ein und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 10 Minuten lang, um die Zellen zu fixieren.
Dann 250 Mikroliter ein-Molarenglycin hinzufügen und bei Raumtemperatur für weitere 10 Minuten brüten, um die Reaktion zu löschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 10.000 g bei vier Grad Celsius für 30 Sekunden. Entfernen Sie die Überräube vollständig.
Als nächstes mit einem Milliliter PBS erneut anhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 10.000 g bei vier Grad Celsius für 30 Sekunden, und entfernen Sie den Überstand. Resuspend mit 400 Mikroliter fCLIP Lyse Puffer ergänzt mit 0,2 Volumen Prozent Protease-Inhibitor und zwei Volumen Prozent RNase-Hemmer.
10 Minuten auf Eis bebrüten und mit einem Ultraschallgerät beschallen. Als nächstes fügen Sie 11 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid hinzu, um die Natriumchloridkonzentration auf 150 Millimolar einzustellen, und wirbeln Sie kurz. Dann Zentrifuge bei 21, 130 g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.
Übertragen Sie die Überräube in ein vorgekühltes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Um eine Immunpräzipitation durchzuführen, fügen Sie zunächst 20 Mikroliter Protein A Perlen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Dann waschen Sie die Perlen mit 400 Mikroliter fCLIP Lyse Puffer.
Zentrifugieren Sie die Perlen bei 1.000 g bei vier Grad Celsius für eine Minute. Als nächstes entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 400 Mikroliter fCLIP LysePuffer sorgfältig hinzu und setzen Sie die Perlen vorsichtig wieder auf, indem Sie drei- bis viermal umkehren. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
Nach der letzten Wäsche die Überräube vollständig entfernen. Die Perlen in 300 Mikroliter fCLIP Lysepuffer aussetzen. Fügen Sie 8,3 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid hinzu, um die Natriumchloridkonzentration auf 150 Millimolar einzustellen.
Fügen Sie 10 Mikroliter Proteinkinase RNA-aktivierten Antikörper hinzu und inkubieren Sie drei Stunden lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Als nächstes zentrifugieren Sie die Perlen bei 1.000 g bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 400 Mikroliter fCLIP Waschpuffer hinzu, und setzen Sie die Perlen vorsichtig wieder auf, indem Sie drei- bis viermal invertieren.
Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Nach der letzten Wäsche die Überräube vollständig entfernen. Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Lysat hinzu und brüten bei vier Grad Celsius auf einem Rotator für drei Stunden.
Dann zentrifugieren Sie die Perlen bei 1.000 g bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 400 Mikroliter fCLIP Waschpuffer hinzu, und setzen Sie die Perlen vorsichtig wieder auf, indem Sie drei- bis viermal invertieren. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
Nach der letzten Wäsche den Überstand vollständig entfernen. Als Nächstes fügen Sie 300 Mikroliter fCLIP-Elutionspuffer hinzu. Inkubieren Sie in einem ThermoMixer bei 25 Grad Celsius für drei Stunden, um Proteinkinase RNA-aktiviert aus den Perlen zu elute.
Zentrifugieren Sie bei 1.000 g bei Raumtemperatur und übertragen Sie die Überräube in ein sauberes silikonisiertes Rohr. Schließlich 300 Mikroliter Proteinase K hinzufügen und über Nacht bei 65 Grad Celsius brüten. Die Wirksamkeit des Zellzyklusarrests der HeLa-Zellen in der S- oder M-Phase wurde mit FACS untersucht.
D7F7-Antikörper zeigte eine überlegene Fähigkeit, ausgefällte Proteinkinase RNA aktiviert zu immunisieren. Die Western-Blot-Analyse von PKR-Immuno-Gefälltitten oder Gesamt-HeLa-Lysat zeigte nur ein starkes Band, das der Größe von PKR entspricht, was darauf hindeutet, dass der D7F7-Antikörper sehr spezifisch bei der Erkennung von PKR ist. Die Verwendung verschiedener PKR-Antikörper mit unterschiedlicher Immunniederschlagseffizienz führte zu einer unterschiedlichen Klassenverteilung von Kartensequenzierungslesevorgängen.
Eine Abnahme des Radioisotopensignals für PKR-koimmunpräzipierte RNase wurde bei erfolgreicher rRNA-Entfernung beobachtet. PKR co-immunprecipitated RNA-Probe, zeigte eine starke Anreicherung der mitochondrialen RNase im Vergleich zu den negativen Kontrollen. Die strangspezifische Reverse-Transkription wurde verwendet, um die schwere und leichte Strang-Mitochondrial-RNase zu unterscheiden, die mit PKR für S- oder M-Phasen-verhaftete Zellen ko-immunpräzipiert wurden.
Der kritischste Schritt bei der Vorbereitung der Zellzyklus-Arrest-Probe sind, wo Sie die Zellen zweimal mit PBS waschen müssen und wo Sie nur Zellen Pastell für Homogenität sammeln oder würde Probe beeinträchtigt werden. Für einen ethisch prozessischen Prozess sind die wichtigsten Schritte die Formaldehydvernetzung und -menge. Nach diesem Verfahren können die eluierten RNAs mit Northern Blotting, qRT PCR oder High Throughput-Sequenzierung analysiert werden.
Diese Experimente können den Typ und die relative Menge der RNase identifizieren, die an PKR gebunden sind. Diese Technik kann angewendet werden, um RNA-Interaktoren von RNA-bindenden Proteinen zu untersuchen und zu identifizieren, was unser Verständnis der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression verbessern wird, vermittelt durch RNA-bindende Proteine. Formaldehyd ist gefährlich, so dass die Fixierung, Lösung und der anfängliche Waschpuffer mit Vorsicht behandelt werden müssen.
