Die Autoren danken Ruth Rubli an der Abteilung für Physiologie der Universität Bern, Schweiz, für wertvolle technische Hilfe bei den Experimenten. Diese Arbeit wurde teilweise durch die EU-FP7-NMP-Programms (Finanzhilfevereinbarung Nr 281056; Projekt NANOCI - www.nanoci.org.) Unterstützt.

Tierpflege und Experimente wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Schweizer Gemeinden (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Schweiz) durchgeführt. 1. Bereiten Sie Lösungen für Experimente <ol><li> Bereiten Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) Beschichtungslösung (siehe Materialtabelle, Punkt 6): Thaw ECM - Mix auf Eis. Verdünnen Sie die ECM-Mix 1:10 in Grundkulturmedium (ohne neurotrophe Faktoren oder fötalem Rinderserum (FBS)) und auf Eis halten. </li><li> Bereiten Sie das Kulturmedium (siehe Materialtabelle, Punkt 1): Bereiten Sie einen Vorrat von Neurobasalmedium nicht enthält FBS oder Gehirn - derived neurotrophic factor (BDNF). Ergänzung Neurobasal Medium mit frischem FBS (10%) und BDNF (5 ng / ml) unmittelbar vor der Zellkultur hinzugefügt wird. </li><li> Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung (siehe Materialtabelle, Punkt 2). </li></ol> 2. Waschen und Sterilisation von MEAs (1E) angeordnet ist . Jede Elektrode hat eine Größe von 40 x 40 &amp; mgr; m 2 mit einem Abstand von 200 um von Mittelpunkt zu Mittelpunkt. Die Elektroden sind aus Platin. Die Elektroden werden durch eine Schaltung mit den entsprechenden Kontakten verbunden Oxid aus Indium-Zinn. Diese Schaltung wird durch eine 5 &amp; mgr; m Schicht aus SU-8 isoliert. Siehe Materialtabelle für Details zu dem Anbieter. Weitere MEA-Layouts können für diese Experimente geeignet sein. <ol><li> Für neue MEAs: Spülen Sie nach 30 Sekunden in 70% Ethanol eingetaucht und wäscht mit destilliertem Wasser für 30 Sekunden. Arbeiten Sie in einem Laminar-Flow-Haube. </li><li> Lassen Sie die MEA trocken für 30 Minuten in einer laminaren Strömung Haube. </li><li> Setzen Sie jede MEA in eine individuelle sterile Petrischale (35 mm x 10 mm) und Dichtung mit Folie. Die MEAs können bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Bei gebrauchten MEAs: Inkubieren Sie die MEAs in einer Petrischale (35 mm x 10 mm) mit 1 ml der enzymatischen solutIon (siehe Materialien Tabelle, Punkt 6) O / N auf Schüttler bei RT biologischen Material zu entfernen. Dann weiter wie in Schritt 2.1. HINWEIS: Behandeln Sie die MEAs mit Sorgfalt Zange mit gummierte Tipps. </li></ol> 3. Herstellung von MEAs für Kultur Experimente <ol><li> Entfernen Sie die Dichtungsfolie und lassen Sie die MEA in der Petrischale (35 mm x 10 mm) für das gesamte Experiment. </li><li> Bestreichen Sie die MEAs mit der Lösung in 1.1 hergestellt: Verwenden Sie eine kalte 200 ul Pipettenspitze (bei -20 ° C) 50 ul Beschichtungslösung zu pipettieren zu jeder MEA, die das gesamte Elektrodenfläche. </li><li> Erlauben MEAs zu beschichten für 30 min bis 1 h bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Beschichtungslösung mit einer Pipette. Bewerben 100 ul Kulturmedium, das mit 10% FBS und 5 ng / ml BDNF und lassen Sie es bei RT, bis das Gewebe Plattierung. </li><li> Platzieren 2 Petrischalen, die beschichteten MEAs in eine große Petrischale mit (94 mm x 16 mm) und eine dritte kleine Petrischale hinzuzufügen, die 1,5ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zur Befeuchtung. HINWEIS: eine kleine Petrischale (Schritt 3.5) mit PBS Hinzufügen von entscheidender Bedeutung ist wesentlich Verdampfung von Kulturmedium zu minimieren. </li></ol> 4. Spiralganglion Dissection HINWEIS: Gross Dissektion kann außerhalb des Laminarströmungsabzug erfolgen (Schritt 4.1 bis 4.4). Für feine Dissektion sterilen Bedingungen (Laminar-Flow-Haube) sind Pflichtfelder (aus Schritt 4.5). <ol><li> Euthanize Tiere (5-7 Tage alte Mäuse) durch Enthauptung ohne vorherige Betäubung. </li><li> Sterilisieren Sie den Kopf, indem sie mit 70% Ethanol gesprüht wird. </li><li> Durch den Kopf hält, schneiden Sie die Verbindung zwischen der Haut und dem Schädel mit einem scharfen / spitzen Schere entlang der Sagittallinie. </li><li> Schneiden Sie den Schädel sagittal und entfernen Sie das Gehirn mit scharfen / stumpfe Schere. </li><li> Schneiden Sie die zeitliche Knochen aus dem Schädel und legen Sie die in einer Petrischale mit steriler eiskalter Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS). </li><li> Mit Hilfe eines dissection Mikroskop, sezieren die Bulla tympanica feinen Pinzette und das Innenohr zu isolieren. </li><li> Entfernen Sie die Knochen der Cochlea, mit einer feinen Pinzette. </li><li> Entfernen Sie das Spiralband und Stria vascularis (SV) zusammen, indem sie mit einer Pinzette den basalen Teil des Spiralganglion (SG) und der SV Holding und langsam Abwickeln des SV von der Basis-to-Spitze </li><li> Isolieren Sie das Corti - Organ (OC), die SG und die modiolus (1A - C) </li><li> Trennen Sie die OC von der SG und modiolus, indem sie mit einer Pinzette den basalen Teil der SG Holding und der OC und Abwickeln langsam die OC von Basis-Spitze. </li><li> Geschnittene Seiten Explantate (200 bis 500 um Durchmesser) aus dem Ganglion spirale befestigt noch mit dem Modiolus (1D) eine Zange und eine Mikroskalpell verwendet. </li></ol> 5. Spiralganglion Explantation Kultur auf MEAs <ol><li> Platzieren zwei Spiral Ganglion-Explantate neben den Elektroden auf der MEA zuvor hergestellten mit 100 &amp; mgr; l Kulturmedium. </li><li> Legen Sie das Corti-Organ etwa 5 mm von der Elektrodenfläche. </li><li> Verwenden einer Pinzette die Explantate an Pin und das Corti-Organ auf die MEA unter Vermeidung der Gewebe zu schädigen. </li><li> Legen Sie die MEAs vorsichtig in den Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag, visuell überprüfen, dass die Explantate auf der MEA angebracht haben. HINWEIS: Wenn Explantate nicht O / N gebunden haben, werden sie nur selten so in den nächsten Tagen tun. Das OK ist für trophische / neurotrophic Unterstützung neben der Kultur gelegt. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Kulturmedium, enthaltend 10% FBS und BDNF täglich für 5 aufeinanderfolgende Tage. </li><li> Am Tag 6 2 ml Kulturmedium werden 10% FBS und 5 ng / ml BDNF und Kultur das Gewebe für weitere 13 Tage enthält. </li></ol> 6. elektrophysiologischen Ableitungen Spontan und Elektrodenstimulation abhängige Aktivität zur Untersuchung <ol><li> Waschen Sie die MEA Kultur mit extrazellulären solution vorbereitet 1.3, bei RT in Schritt. </li><li> Trocknen Sie die Kontakte mit einem Gewebe und montieren Sie die MEA auf der MEA-Setup. HINWEIS: Damit die Kultur feucht während der Montage, einen kleinen Tropfen der extrazellulären Lösung der Kultur hinzuzufügen. </li><li> In 300 ul extrazellulären Lösung und warten Sie 10 Minuten vor der Aufnahme, damit das System zu stabilisieren. </li><li> Nehmen Sie spontane Aktivität für 2 min von allen Elektroden auf der Platte drücken / erwerben Taste der Software und der Aufzeichnungselektroden zu identifizieren. </li><li> MEA Elektrodenstimulation: Wählen Sie die Amplitude / Dauer / Form des Reizes auf die entsprechende Software und gelten für mehrere Elektroden nacheinander als 13 beschrieben. Wählen Sie die Elektroden auf der Basis auf die, die zeigt spontane Aktivität (wie in Schritt 6.4). Die Bilanz von all den übrigen Elektroden. </li><li> Auf Stimulation Artefakt auszuschließen, stimulieren aus derselben Elektrode 10 mal. Wenn die Kultur mindestens 8 von 10 mal reagiert, kann es als ein ausgegangen werden,positive Reaktion auf Elektrode induzierte Stimulation. </li><li> Zur Identifizierung von Hintergrundrauschen, gelten Tetrodotoxin (TTX) an den cultureat einer Konzentration von 1 &amp; mgr; M zu blockieren spannungsgesteuerten Natriumkanäle und Rekord für 2 min. Verwenden Sie diese Spike-Erkennung durchführen (7.1 und 7.2). </li></ol> 7. Datenanalyse HINWEIS: Die Datenanalyse wurde im Detail in 6 und 5 zuvor beschrieben. Für Einzelheiten zur Software in dieser Studie verwendeten siehe Materialien Tabelle, Punkt 7. <ol><li> Mit der entsprechenden Software erkennen spontane Aktivität für jede Elektrode einen Detektor auf Basis von Standardabweichungen und einem anschließenden Unterscheider verwendet wird. Dieses Verfahren ist in 6 beschrieben. Aktivität wird als schnelle Spannungsspitzen (&lt;5 ms). </li><li> Wählen Sie eine Schwelle, die in keiner Aktivität resultiert, wenn die TTX Analyse behandelt samples.Adapt den Schwellenwert für jedes Experiment zwischen falsch positiv zu diskriminierene und falsch negativen Erkennungen. </li><li> Verwendung geeigneter Software beobachten die detektierte neuronale Aktivität jeder Elektrode als Rasterstück nach Standardverfahren (siehe 2A - C). </li><li> durch Addition aller erfassten Ereignisse innerhalb eines Schiebefensters von 10 ms, verschoben um 1 ms Schritten ermitteln und die gesamte Netzwerkaktivität anzuzeigen. </li><li> Detect Stimulation induzierte Aktivität durch die Rohdaten mit Hilfe geeigneter Analysesoftware angezeigt wird. Identifizieren Sie die offline manuell einzelne Spikes. Einzelne Spitzen erscheinen als schnelle Spannungsspitzen, auftreten nach der Stimulation Artefakt (Pfeilspitze in Abbildung 2E). Ein Beispiel ist in Figur 2E dargestellt ist . </li><li> Je nach Experiment, analysieren , um die Anzahl der Elektroden reagiert, den Schwellenwert erforderlich , um eine Reaktion, die Anzahl der Aktionspotential 5 pro Elektroden und andere Parameter von Interesse zu erreichen. </li></ol> 8. Gewebefixierung und Immunohistochemistry HINWEIS: Der Färbeprozess der MEA zerstören wird. Siehe Materialtabelle (Punkt 4) für Reagenzien. <ol><li> Direkt nach der Aufnahme waschen die Kulturen mit 37 ° C warmem PBS dreimal. Verwerfen Sie den PBS und anzuwenden 4% Paraformaldehyd (PFA) (in PBS), vorgewärmt auf 37 ° C für 10 min. ACHTUNG: PFA ist giftig. Die Arbeit in einer chemischen Haube mit angemessenen Schutz und Ablagelösung gemäß den Richtlinien. </li><li> Waschen Sie die Kulturen dreimal mit PBS und Blockieren mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (0,01% Triton-X100) für 2 Std. </li><li> Fügen Sie den ersten Antikörper (Anti-βIII Tubulin, TUJ Antikörper), verdünnt in PBS (2% BSA und 0,01% Triton-X100) und O / N bei 4 ° C belassen. Waschen Sie die Kultur dreimal mit PBS. HINWEIS: Von nun an die Probe halten im Dunkeln so oft wie möglich Bleichen des sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper zu minimieren. </li><li> Fügen Sie den sekundären Antikörper, verdünnt in PBS (2% BSA eind 0,01% Triton-X100) und für 1 bis 2 h bei RT inkubiert. Beflecken Kerne hinzufügen 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml Brühe) für 10 min. </li><li> Waschen dreimal mit PBS und montieren Sie die Proben nach hinten zu dünnen Deckgläser (24 x 50 mm 2) mit Befestigungsmedium (siehe Materialien Tabelle, Punkt 4). Bild eines Fluoreszenzmikroskops mit 5X und 20-facher Vergrößerung verwendet wird. </li></ol>

<ol>
	<li>O'Donoghue, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+implants--science,+serendipity,+and+success.">Cochlear implants--science, serendipity, and success.</a> N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).</li><li>Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+the+auditory+nerve:+the+effect+of+electrode+position+on+neural+excitation.">Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation.</a> Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).</li><li>Wilson, B. S., Dorman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+implants:+current+designs+and+future+possibilities.">Cochlear implants: current designs and future possibilities.</a> J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).</li><li>Hahnewald, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+profiles+of+murine+spiral+ganglion+neurons+on+multi-electrode+arrays.">Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays.</a> J. Neural Eng. 13, (2015).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructuration+strategies+to+enhance+microelectrode+array+(MEA)+performance+for+neuronal+recording+and+stimulation.">Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).</li><li>Kim, R., Nam, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+platinum+black+electroplating+technique+improving+mechanical+stability.">Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).</li><li>Cellot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotubes+might+improve+neuronal+performance+by+favouring+electrical+shortcuts.">Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts.</a> Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).</li><li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology.">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie Explantate auf MEA Kultur SGN und SGN Aktivität beurteilen durch extrazelluläre nicht-invasive Aufnahmen. Diese Plattform und das Protokoll , das wir vor kurzem 5 erlauben Materialien zur Identifizierung neuer Stimulationsprotokolle und Elektrode in reduzierter Energiebedarf entwickelt haben resultierende SGN zu aktivieren, mit potentiellem Interesse für die weitere Umsetzung von Cochlea - Implantaten und anderen neuro-Prothetik. Mehrere Vorsichtsmaßnahmen im vorliegenden Verfahren sind von grundlegender Bedeutung für die Durchführung von genauen und reproduzierbaren Experimenten. Eine sorgfältige Präparation des Spiralganglion und zur weiteren Behandlung des primären Gewebe erfordert besondere Vorsicht. Diese Experimente wurden zwischen 5 und 7 Tagen alt Verwendung C57 / BL6-Mäusen durchgeführt. Ähnliche Ergebnisse wurden in der gleichen Altersgruppe unter Verwendung von Wistar-Ratten erhalten (Daten nicht gezeigt). Wir glauben, dass dies das beste Alter für eine Fein Präparation ist als das Cochlea-Knochen noch weich en istough für die einfache Entfernung mit einer Zange, und die Spiralganglion und Corti-Organ kann leicht ohne aufzureißen Dendriten Prozesse oder SGN somas getrennt werden. Bei früheren Zeiten ist das Gewebe zu weich und die Chancen, die SGN somas zusammen mit dem Corti-Organ zu zerreißen ist höher, während in späteren Phasen, die Verhärtung der knöchernen Kapsel der Cochlea die Gefahr einer Beschädigung des Gewebes erhöht, während sezieren. Die richtige Isolierung des SG sowie sorgfältige Schneiden der Explantate ist kritisch. Diese sollten im Bereich von 200-500 um Grße Befestigung an der MEA Oberfläche zu maximieren und eine ausreichende Anzahl von SG somas in den Explantaten zu haben, aus denen Neuriten nachwachsen wird. Um neurotrophic Unterstützung in den ersten Tagen der Kultur zu erhöhen, wird frisch BDNF täglich hinzugefügt und das Corti-Organ wird in Co-Kultur gelegt. Die Geschwindigkeit der Dissektion ist ebenfalls wichtig. Alle Schritte sollten rasch und mit eiskalter Lösungen ausgeführt werden, um Gewebe Verschlechterung zu minimieren. DasZeit zwischen Euthanasie und Platzierung der Explantation auf der MEA sollte zwischen 10-15 Minuten und ist von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Kulturen. Lassen Sie alle Werkzeuge bereit, um Verzögerungen zu vermeiden in der Kultur-Beschichtung. Alle Schritte, einschließlich feinen Sezierung, Wartung der Kultur und der Herstellung von mittleren und Geräte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Bei der Beschichtung der MEA mit der ECM-Lösung ist es wichtig, sie auf Eis auftauen und bei höheren Temperaturen eiskalten Pipettenspitzen und eiskaltes Medium wie die ECM-Mix Gele zu verwenden. Wenn die Explantate auf MEAs platzieren, fügen Sie zuerst das Medium zu den Elektrodenflächen, anschließend die Explantate platzieren. Wenn das Medium in einem zweiten Schritt zugegeben wird, neigen Explantaten von der MEA zu lösen durch Stress Scherung. Da kleine Mengen von Medium zu der Kultur angewendet werden, in ersten 5 Tagen, Verdampfen des Kulturmediums minimiert werden muss. Daher ist es dringend einer befeuchteten Kammer mit kleinen Petrischalen mit PBS in der Nähe von Proxim zu erstellen empfohlenkeit zu den MEAs. Die hier beschriebenen Experimente wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen MEA-Elektroden mit spezifischen Elektrodenabmessungen, Beschichtungsmaterialien und intraElektrodenAbstand durchgeführt (wie in Punkt 2 beschrieben, Anmerkung). Die Kulturbedingungen wurden zu maximieren, um die neuronale Deckung des spezifischen Elektrodengitter Design hier optimiert. Es ist möglich, dass andere Konfigurationen von Elektrodenabstand, Geometrien und Oberflächen können unterschiedliche Beschichtungen oder Zelldichten erfordern. Diese Schritte können erfordern anfängliche Fehlersuche, um eine hohe Dichte Kulturen zu erreichen. In Bezug auf die elektrophysiologische Aufnahmen, bevor die Aufnahmen ausgehend die Kultur aus dem Kulturmedium bei 37 ° C zu der extrazellulären Lösung bei RT übertragen wird. Um instabilen Aufnahmen zu vermeiden, für etwa 10 Minuten warten, damit der Kultur zu ermöglichen, zu stabilisieren. Wenn die Kultur stimulieren, sollte besondere Vorsicht angewendet werden, um den Reiz bei der Auswahlals große Amplituden (&gt; 3 V) und Dauern können Schäden an der Kultur führen. Für eine Referenz in Bezug auf die Stimulation Pulsformen und Dauer siehe Referenz 5. Für die Datenerfassung und Verarbeitung selbst gemachte Hardware (Aufnahmekammer, Verbindungen zu den Verstärkern und Verstärker) wurden verwendet , und spezifische Analyseprogramme wurden (siehe Materialtabelle, Punkt 7) ausgewählt. Jedoch können auch andere kommerzielle MEA-Setups und andere Software-Pakete sind auch für diese Operationen geeignet. Wir haben bereits die Antworten unserer Kulturen in drei verschiedenen Zeitpunkten bewertet und zeigten eine erhöhte Aktivität bei längerer Kulturzeit 5. Hier empfehlen wir 18 Tage in vitro für Aufnahmen. MEA Systemen, was eine kontinuierliche Aufnahmen in sterile, befeuchteten Kammern könnte die Identifizierung der optimalen Zeitpunkte für jede Kultur Typ erleichtern. Ein Hauptnachteil dieser Bioassay ist die hohe Variation in ter Anzahl der Elektroden pro Kultur, die Antworten auf die Stimulation zeigen. Dieser Satz von Reaktionen auf Stimulation hängt im wesentlichen von vier Faktoren ab: die Dichte der Neuriten in der Kultur, die Kontakte zwischen den Neuriten und den Elektroden, der Durchmesser der Neuriten oder Neuriten Bündeln, und der Impedanz der Elektroden. In Bezug auf die Neuriten-Dichte, nur Neuriten, die für sein können mindestens zwei Elektroden wachsen über Stimulationsexperimente verwendet. Der Kontakt zwischen Neuriten und Elektroden ist abhängig von dem umgebenden Gewebe, das die Neuriten von der Elektrode zu isolieren, auf der einen Seite kann, und somit den Kontakt verschlechtern, oder, andererseits, isolieren die Neuriten und die Elektrode aus dem umgebenden Bad und damit verbessern der Kontakt. Gewebedichte sowie Neuriten Größe, werden von dem Explantat definiert verwendet und den Kulturbedingungen. Dissoziiert haben neuronalen Kulturen ebenfalls erfolgreich getestet worden, aber die neuronale Dichte in diesen Kulturen ist viel geringer, in einer reduzierten Anzahl von reco ergebrding Elektroden. Deshalb sollte die Zellkultur auf die spezifische wissenschaftliche Fragestellung angepasst werden angegangen werden. Schließlich wird die Impedanz der Elektroden, die hauptsächlich durch die Größe und die Oberfläche der Elektroden gegeben. Materialien, eine große Oberfläche , wie beispielsweise schwarz Platin zu schaffen, wie in 3 gezeigt , um die Impedanz der Elektroden abnimmt kann die Kopplung zwischen Elektroden und Neuriten auch 7-9 verbessern. Strategien , um die Erfolgsrate der Stimulations daher zur Verbesserung umfassen die Optimierung der Kulturbedingungen, die Erhöhung der Gesamtzahl der Elektroden oder Elektroden Dichte und die Modulation der Elektrodenoberfläche 10. Bisher hatte elektro Charakterisierung von SG-Neuronen wurden unter Verwendung von Patch-Clamp-Techniken durchgeführt. Dies ermöglicht für die intrazelluläre Aufnahme von Aktionspotentialen und detaillierte Analyse der intrazellulären Ionenströme auseinzelne Neuronen. Hier stellen wir ein in vitro - Bioassay , die verwendet werden können , um Aktivitätsprofile von Spiralganglienneuronen durch Analysieren spontane Aktivität oder Reaktionen auf extrazelluläre Stimulation vieler Neuronen gleichzeitig untersuchen. Außerdem kann die Wechselwirkung zwischen der Elektrode und Corti&#39;-Ganglionneuronen durch Anwendung modifiziert oder neue Materialien untersucht und optimiert werden. Schließlich, auch wenn hier nicht gezeigt, kann diese Plattform in Kombination mit einer externen Elektrode verwendet werden, auf einem Mikromanipulator montiert , wie kürzlich von unserer Gruppe 5, gezeigt , um die Beziehung zwischen dem Abstand von der Stimulationselektrode und der Kultur Aktivität zu studieren. All diese neuen Aspekte ermöglichen das Nachahmen der wichtigsten Merkmale der Cochlea-Implant-Elektroden kann mit dem Design von neuartigen Prothesen führen. Unser Modell ist ein sehr nützliches Werkzeug in vitro Strategien zur Untersuchung der Wirksamkeit der Stimulation der akustischen Neuronen und weiter zu verbessern opmieren CI-Technologie. Sobald die Technik beherrscht wird, könnte ein Screening für die Modifikation von einer Reihe von Variablen vorstellen: a) unterschiedliche neuronale Populationen, b) verschiedene Elektrodenmaterialien / Größe / Impedanzen c) durchführen chronische Experimente Material Toxizität oder Elektrodenstimulation induzierte Toxizität zu testen, die Schuppen Licht könnte auf sicherere und effektivere Stimulationsprotokolle durch in - vivo - Elektroden - Arrays.

In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1. 
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">culture medium</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>24 ml (for 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>250 &#956;l (for 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>250 &#956;l (for 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>500 &#956;l (for 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>10% (for 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD-025/CF</td>
			<td>final 5 ng/ml (for 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td align="right">2%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td align="right">0.01%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Immunostaining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TuJ</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>dil 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">158127</td>
			<td align="right">4%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluoreshild</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic/tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petri dish 35 mm</td>
			<td>Huberlab</td>
			<td>7.627 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petri dish 94 mm</td>
			<td>Huberlab</td>
			<td>7.633 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 tweezer</td>
			<td>WPI</td>
			<td align="right">14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #55 tweezer</td>
			<td>WPI</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Enzymatic solution: Terg-a-Zyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273287-11KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEA electrodes</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Lausanne, Switzerland)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Switzerland</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgorPro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td></td>
			<td>Lake Oswega, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spiral ganglion neuron explant culture and electrophysiology on multi electrode arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

Abbildung 1 fasst das Verfahren zur Gewebe Isolierung, Herstellung und Kultur auf MEA. Wir zeigen die aufeinanderfolgenden Schritte der Gewebedissektion die Spiralganglion (SG) aus dem Sinnesepithel des Corti - Organ (OC) und Stria vascularis (SV) und im Anhang Spiralband (Abbildung 1 A - C) zu isolieren. Spiralganglion Explantate (3-4 an der Zahl) werden geschnitten mit Mikroscheren aus dem Ganglion , wie schematisch in Figur 1D dargestellt und auf MEA (Abbildung 1E), über die Elektrode belegte Fläche (2,2 mm 2). Der OC ist in der Nähe, außerhalb der Elektrodenoberfläche gebracht. Das Wachstum der Kultur kann im Laufe der Zeit (Figur 1G) überwacht werden. Ein schematisches Diagramm des Protokolls ist in Figur 1F gezeigt ist . Elektrophysiologischen Aktivität kann nach 6 Tagen der Kultur nachgewiesen werden, was bei längerer Kultivierungszeit erhöhen. Wir sindecommend Beurteilung 18 Tage Kulturen , die deutlich höhere Anzahl von Aufzeichnungselektroden produzieren im Vergleich zu früheren Zeitpunkten 5. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54538/54538fig1.jpg" /> Abbildung 1. Zellkultur Vorbereitung. (A) Frisch Maus Innenohr seziert. Weiß gestrichelte Linie zeigt die Lage der Cochlea, schwarz gestrichelte Linie die vestibulären Region anzeigt. (B) Maus Innenohr nach dem Entfernen der Cochlea Knochenwand. Cochlea-Windungen sind durch weiße gestrichelte Linien angedeutet. (C) Das Spiralganglion (SG) und modiolus, das Corti - Organ (OC) und die Stria vascularis (SV) und Ligamentum spirale sind nach der Sektion gezeigt. (D) Schematische Darstellung der SG und OC Dissektion und SG Explantatherstellung {figure 5 mit Genehmigung des Herausgebers angepasst}. (E) Illustration des Multi - Elektrodenanordnung in dieser Studie verwendet. UmschlüsselungElektroden sind in einem rechteckigen Raster in der Mitte und nehmen eine Fläche von 2,2 mm 2 durchgeführt. 4 Erdungselektroden und Seitenkontakte dargestellt. (F) Schematische Darstellung des Kulturprotokoll. Die Aufnahmen werden am Tag 18 (G) Repräsentative Bilder (Hellfeld - Bilder) und Systeme der SG - Explantate auf MEA in Kultur am Tag 1, 6 und 18 Maßstabsbalken = 400 &amp; mgr; m. Überwacht durchgeführt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54538/54538fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54538/54538fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> Spontane Aktivität kann auf MEA detektiert werden und als Raster Plot gezeigt, wo jede Zeile der Plot eines erfassten Spitze darstellt. Ein repräsentatives Beispiel spontane Aktivität von mehreren Elektroden (verschiedene Farben in den Diagrammen) detektiert zeigt gezeigt (2A, 2B und 2C). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Zusätzlich MEA Elektroden kann die Kultur zu stimulieren, verwendet werden. Ein repräsentatives Beispiel eines zweiphasigen Impulses zur Stimulation verwendet (Figur 2D), 5 reagiert Elektroden (rot Spuren) und nicht-antwort Elektroden (blau Spuren) zeigt , ist in Figur 2E dargestellt ist . Für diese Experimente wurde zur Stimulation und all die anderen Elektroden für die Aufnahme einer Elektrode verwendet. Einzelaktionspotentiale erschienen 1 ms nach der Stimulation Artefakt (schwarzer Pfeil Kopf). Die MEA kann am Ende des Verfahrens werden, um immunhistochemisch die Abdeckung der neuronalen Prozesse über die Elektrodenfläche zu bewerten. Die Elektrode in grün in 2F angegeben wurde zur Stimulation verwendet, und die in rot angezeigt Elektroden wurden verwendet , um Antworten (Abbildung 2E) aufzeichnen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54538/54538fig2.jpg" /> Abbildung 2. Datenaufzeichnungen auf MEA. (A &lt;/ Strong&gt;) Spuren von Original-Aufnahmen von sechs von 63 Elektroden spontane Aktivität zeigt. (B) Raster - Plot der sechs Elektroden von 2A nach Spike - Erkennung. Jeder Balken stellt ein Aktionspotential. (C) Raster Grundstück einschließlich aller Elektroden (wie in A und B) Die Aktivität wird von 63 Elektroden (Kanäle Zahl 0-63) für 2 min aufgezeichnet. (D) Eine zweiphasige Anregung mit Gesamtdauer von 80 us und einer Amplitude von 80 &amp; mgr; A wurde zur Stimulation der Kultur von einer Elektrode (E58 in Figur 2F) verwendet. (E) Ein repräsentatives Beispiel von Rohdaten Spuren nach der Stimulation von der Elektrode erhalten 58 zeigt Aktionspotentiale (rote Spuren) oder ohne Antworten (blaue Spuren) nach Stimulation (schwarzer Pfeil-Kopf). (F) Ganglion spirale Kultur auf MEA immunhistochemisch für den neuronalen Marker TUJ (grün) am Ende des Experiments neuro zu visualisieren<html> nal Abdeckung des Elektrodenfläche {Figur angepasst 5 mit Genehmigung des Herausgebers}. Die Elektrode 58 für die Stimulation verwendet wird in grün angezeigt, reagiert Elektroden werden in rot angezeigt. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54538/54538fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54538/54538fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Schließlich ermöglicht die MEA-Setup möglich Elektrodenoberflächenmodifikation für das Studium, die Aufzeichnungsempfindlichkeit erhöhen. Zwei im Handel erhältliche MEA-Elektroden wurden in dieser Studie mit zwei unterschiedlichen Platinoberflächen verwendet: Grau Platin (Grau Pt), bestehend aus einer 150 nm dicken Pt-Schicht (Impedanz: 400 kOhm / 1 kHz) und Schwarz Platin (Schwarz, Pt), durch elektrochemische Abscheidung von Pt an dem Ende des Mikroherstellungsprozesses erhalten (Impedanz: 20 K &amp; Omega; / 1 kHz). Siehe Werkstoff - Tabelle (Punkt 6) für weitere Einzelheiten. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Sechs unabhängige MEA Experimente pro Elektrodentyp durchgeführt wurden MEA Schwarz Pt ermöglicht für den Nachweis von neuronalen Aktivität auf einer höheren Anzahl von Elektroden pro MEA (3A) und eine Verringerung der. die Reizamplitude eine Antwort (3B) benötigt hervorzurufen. Wir analysierten 30-35 unabhängigen Elektrodenpaare in 6 verschiedenen Experimenten, die Stromschwelle eine Antwort zu erreichen , benötigt wird . Schwarz Pt Elektroden signifikant besser einen Schwellenwert von 31,09 μ A zeigt , +/- 2,4 im Vergleich zu Grau Pt - Elektroden 47,57 μ A +/- 1.97. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54538/54538fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vergleich von Grau vs Schwarz Pt - Elektroden. Zwei Arten von Elektroden (grau und schwarz Pt) wurden an Seite verglichen Seite 12 unabhängige MEA Kulturen, 6 auf jeder MEA - Typ. (A) Die Gesamtzahl der Wiederchenden Elektroden pro Experiment gezeigt. (B) Amplitudenschwelle eine Antwort zu entlocken, gemessen 30-35 unabhängige Elektrodenpaare in 6 unabhängigen MEA Experimenten unter Verwendung gezeigt. Daten sind als Mittelwert +/- SD gezeigt. (Student t - Test p &lt;0,001) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54538/54538fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54538/54538fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

spiral-ganglion-neuron-explant-culture-electrophysiology-on-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K Aufrufe.  Inselspital and University of Bern. We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Serie: Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress has been made in our understanding of differences in response properties of neurons in different cortical layers5-8, yet there is still a great deal left to learn about whether and how neuronal populations encode information in a laminar-specific manner.
Existing multi-electrode array techniques, although informative for measuring responses across many millimeters of cortical space along the cortical surface, are unsuitable to approach the issue of laminar cortical circuits. Here, we present our method for setting up and recording individual neurons and local field potentials (LFPs) across cortical layers of primary visual cortex (V1) utilizing multi-contact laminar electrodes (Figure 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).
The methods included are recording device construction, identification of cortical layers, and identification of receptive fields of individual neurons. To identify cortical layers, we measure the evoked response potentials (ERPs) of the LFP time-series using full-field flashed stimuli. We then perform current-source density (CSD) analysis to identify the polarity inversion accompanied by the sink-source configuration at the base of layer 4 (the sink is inside layer 4, subsequently referred to as granular layer9-12). Current-source density is useful because it provides an index of the location, direction, and density of transmembrane current flow, allowing us to accurately position electrodes to record from all layers in a single penetration6, 11, 12.

A fundamental issue in our understanding of cortical circuitry is how networks in different cortical layers encode sensory information. Here we describe electrophysiological techniques utilizing multi-contact laminar electrodes to record single-units and local field potentials and present analyses to identify cortical layers.

Untersuchen Local Network Processing mit Multi-Contact-Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic targeting for microcircuit dissection and disease modeling. The introduction of optogenetics, for example, has allowed for bidirectional manipulation of genetically-identified neurons, at an unprecedented temporal resolution. To capitalize on these tools and gain insight into dynamic interactions among brain microcircuits, it is essential that one has the ability to record from ensembles of neurons deep within the brain of this small rodent, in both head-fixed and freely behaving preparations. To record from deep structures and distinct cell layers requires a preparation that allows precise advancement of electrodes towards desired brain regions. To record neural ensembles, it is necessary that each electrode be independently movable, allowing the experimenter to resolve individual cells while leaving neighboring electrodes undisturbed. To do both in a freely behaving mouse requires an electrode drive that is lightweight, resilient, and highly customizable for targeting specific brain structures.
A technique for designing and fabricating miniature, ultralight weight, microdrive electrode arrays that are individually customizable and easily assembled from commercially available parts is presented. These devices are easily scalable and can be customized to the structure being targeted; it has been used successfully to record from thalamic and cortical regions in a freely behaving animal during natural behavior.

Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.

Design und Fertigung von Ultraleichtgewicht, verstellbare Multi-Elektroden-Sonden für elektrophysiologischen Ableitungen in Mäuse

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...