Wir möchten Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi und Sonia Garcia für wertvolle Erfahrungsberichte zu Verbesserungen für die Patch-Clamp-Verfahren Automatisierung danken. Wir danken Rajnish Ranjan für wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Software-Implementierung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der EU-Synapse-Projekt und teilweise von der Human Frontiers Science Program gefördert.

1. Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Steuer Manipulatoren von einem Computer <ol><li> Schließen Sie jedes Mikromanipulator Controller-Box an einen Computer über serielle Schnittstellen (RS-232). </li><li> Implementieren Sie die Befehle für die Positionierung, Abfrage und die Einstellungen vornehmen, um über die serielle Schnittstelle gesendet werden. Angesichts Geschwindigkeit und Hardware-Kompatibilitätsprobleme C / C + + als Programmiersprache empfohlen. </li><li> Standardisieren Sie das Bezugssystem der Manipulatoren, so dass Null ist der nächstmögliche Position in Bezug auf die Motoren und positive Bewegung weg von den Motoren gerichtet. </li><li> Positionieren des Mikroskops an seiner zentralen Position 2 mm oberhalb der Probe Brennebene (Koordinaten [0, 0, 2000]). </li><li> Speicher für jeden Manipulator, der lokalen Koordinaten, die die Spitze einer Pipette, in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops beobachtet werden können. Dies ist der erste Bezugspunkt für jede Elektrode. </li></ol></li><li> VisuaLize Elektrodenpositionen. Es ist sehr nützlich, um die Position einer jeden Elektrode während eines Experiments zu verfolgen. Eine grafische Darstellung ist die intuitive Weise, dies zu erreichen. Zu diesem Zweck werden die Referenzsysteme jeder Elektrode und der des Mikroskops abgeglichen werden müssen. Ein einfacher Weg, dies zu erreichen ist: <ol><li> Bringt die Spitze einer Elektrode zu der Mitte des Sichtfeldes. </li><li> Speichern die Position auf jeder Achse des Manipulators und jede Achse des Mikroskops. </li><li> Ausführen mit der x-Achse des Manipulators eine relativ große Bewegung (1 mm). </li><li> Suchen Sie die Spitze noch einmal bewegen nur das Mikroskop. </li><li> Berechnen Sie die Differenz im Mikroskop Position, seit es zuletzt gemessen. Dies sind die Vorsprünge des Elektrodenachsenbewegung auf das Mikroskop Achsen. </li><li> Die Schritte von 2,3 bis 2,5 für die Y-und Z-Achsen der Elektrodenmanipulator. Dies ermöglicht eine Matrix von Vorsprüngen auf dem Mikroskop-Achsen bestimmt werden (&lt;strong&gt; Abbildung 2) auch als Kosinus-Matrix: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Invertieren dieser Matrix, die es ermöglichen, die Bewegungen in drei Dimensionen, die durch die Elektrode Manipulator erforderlich, um eine bestimmte Position im Mikroskop Koordinatensystem zu erreichen berechnen: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> Mit dem ersten Referenzpunkt und der Kosinus-Matrix bestimmen die Position jeder Elektrode in Mikroskop koordiniert. </li><li> Grafisch dargestellt, basierend auf dem Objektkoordinaten, die Position jeder Elektrode in regelmäßigen Abständen. Wir entschieden uns für C / C + +-Bibliotheken Zeichnung (GDI +) zu verwenden, um Elektrodenpositionen alle 40 ms zu ziehen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 - 1.2.7 jedem Manipulator Winkel verändert oder Positionsänderungen von mehreren Millimetern erforderlich sind, zum Beispiel wenn die Art der Elektrode verändert wird. </li></ol></li><li> Aktivieren Sie das Speichern der Positionierungns der relevanten Merkmale in das Gewebe, wie z. B. Zellen oder anatomischen Referenzpunkten, die im Mikroskop koordiniert. </li><li> Erwerben Sie Video-und relevanten Informationen zu überlagern. <ol><li> Mechanisch die x-Achse der Bewegung des Mikroskops ausgerichtet mit der horizontalen Achse des Mikroskop-Kamera. </li><li> Installieren Sie auf dem Computer einen Framegrabber mit Live-Video-und Overlay-Fähigkeit und ein Software Development Kit (SDK). </li><li> Implementieren Sie Live-Video-Display-Betrieb mit dem SDK. </li><li> Konvertieren das Mikroskop Koordinatensystem der Kamera-Referenzsystem durch die geeignete Übersetzung und Skalierung. </li><li> Daraus die relevanten Merkmale in Kamerakoordinaten und die Überlagerung auf dem Live-Video das resultierende Bild in regelmäßigen Abständen von etwa 40 ms (Fig. 3). </li></ol></li><li> Regelverstärker. <ol><li> Verwenden Sie die Software, um die Verstärker Verstärkereinstellungen von der Schnittstelle zu steuern. </li></ol></li><li> CoNTROL Oszilloskope. <ol><li> Schließen Sie die Oszilloskope mit seriellen Schnittstellen mit dem PC. </li><li> Bestimmen Sie die Oszilloskop-Skala, Kupplung und zeitliche Auflösung für die verschiedenen Schritte der Patch-Clamp-Verfahren in Voltage-Clamp (zB Elektrode im Bad, Dichtung Bildung, Ganzzell-Konfiguration) und Strom-Klemme. </li><li> Senden der geeigneten Oszilloskop Einstellbefehle wenn Verstärker Befehle von der Schnittstelle ausgegeben. </li></ol></li><li> Steuer Pipette Druck. <ol><li> Zusammenstellung eines Drucksteuersystems gemäß 4. <ol><li> Verwenden Sie eine 12 V / 5 V-Stromversorgung, jede elektronische Komponente entsprechend zu versorgen. </li><li> Den Ausgang der Membranpumpe nach einem der Überdruckpuffer (100 ml Behälter). </li><li> Den Eingang einer Membranpumpe mit der Unterdruckpuffer (100 ml Behälter). </li><li> Verbinden den Pipettenhalter Schlauch mit einem Drucksensor in der pressuWiedersteuersystem und ein pneumatisches Ventil, das an dem Hauptdruckraum verbindet. </li><li> Verbinden jeder der Druckpuffer auf ein Ventil mit der Hauptdruckkammer verbunden ist. </li><li> Verbinden eines Ventils zwischen der Hauptdruckkammer und der Atmosphäre. </li><li> Schließen Sie einen Drucksensor an der Hauptdruckraum. </li><li> Schließen Sie einen Drucksensor, der jeden Puffer. </li><li> Schließen Sie den Druckkontrollsystem mit einer Datenerfassungskarte. </li><li> Verbinden Sie jeden Drucksensor mit einem Analogeingang. </li><li> Verbinden jedes Ventil mit einem digitalen Ausgang. </li></ol></li><li> Entfernen Atmosphärendruck durch Öffnen aller Ventile mit Ausnahme der Verbindung zu den Membranpumpen und Subtraktion der gemessene Druck von allen Sensoren kompensiert. </li><li> Implementieren Druckkontrolle <ol><li> Definieren Sie in der Schnittstelle ein Steuerelement zu aktivieren oder zu de-aktivieren positive Druckregelung für jede Pipette. </li><li> Definieren Sie eine minimale Überdruck für die Pipettes von etwa 70 mbar. </li><li> In regelmäßigen Abständen (alle 0,5 sec) erkennen, wenn Druck in Pipetten unter aktiver Druckregelung unter den eingestellten Schwellenwert. </li><li> Nach der Schwellenwertüberschreitung öffnen Sie die Überdruckpuffer in den Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage während der kurzen Perioden (20 ms), bis der Druck in den Pipetten oberhalb der Schwelle ist. Schließen Sie alle anderen Ventile. </li><li> De-aktivieren weitere Druckkontrolle als der letzte Ansatz für eine Zelle von Interesse ausgelöst. </li></ol></li><li> Bewerben Unterdruck zur Bildung Dichtung <ol><li> Schließen Sie alle Ventile und öffnen Sie die Unterdruckpuffer Ventil in Richtung der Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage für die Dauer der Experimentator erfordert, indem sie eine Taste gedrückt wird. </li></ol></li></ol></li><li> Zentralisieren Sie Befehle auf eine Human Interface Device. <ol><li> Schließen Sie einen handelsüblichen wireless-Gamepad an den PC. </li><li> Implementieren Auslesen der Joystick-Status. So verwenden Sie die DirectX-Bibliotheken für C / C + +, um alle 5 ms Anzeigen durchzuführen. </li><li> Vergleichen Sie den aktuellen Status mit früheren Status zu erkennen, welche Tasten betätigt wurden, freigegeben oder gedrückt gehalten seit dem letzten Zeitschritt. </li><li> Zuweisen von Funktionen zu jeder Taste in dem Gamepad. Ein Beispiel dieser Abbildung ist in Fig. 5 gezeigt. </li></ol></li></ol> 2. Patch-Clamp-Verfahren <ol><li> Vorbereitung der Hirnschnitten der Region von Interesse. </li><li> Legen Sie einen Hirnschnitt von Interesse, mit dem interessierenden Bereich in der Mitte des Verschiebebereich des Mikroskops. </li><li> Zellselektion <ol><li> Identifizieren Zellen von Interesse, indem Sie mit dem Mikroskop. Bewahren Sie die Position der Zellen auf der Basis des Mikroskops ein Koordinatensystem mit der rechten Maustaste auf das Live-Video-Anzeige auf der Oberseite der Zelle von Interesse. </li&gt; <li> Die grafische Oberfläche werden die ausgewählten Zellen sowie die Mikropipetten für einen globalen Überblick und Software anzuzeigen, eine Markierung auf der Zellposition, die auf den Bildern überlagert werden hinzuzufügen. Darüber ein Bild von der Zelle wird für die Zukunft in der Datei &#39;Zelle #. Jpg&#39; eingefangen. </li></ol></li><li> Namensnennung von Zellen, Pipetten <ol><li> Nach der Auswahl der Zellen von Interesse, weisen Sie die Pipette jede Zelle aufnehmen wird. Die grafische Oberfläche bietet Zuordnung Steuerelemente, die eingestellt werden soll. Visualisieren Sie eine Vorschau auf die endgültige Konfiguration indem Sie die Kontrollkästchen &#39;Final Positionen Show&#39;. </li><li> Wählen Sie jede Pipette, für die die endgültige Position Vorschau gewünscht oder überprüfen Sie die &quot;Select All&quot; Kontrollkästchen. Deaktivieren Sie die Anzeige der aktuellen Position zur besseren Visualisierung, wenn nötig. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Pipetten <ol><li> Füllen Sie die Pipetten (6-8 MOhm sind in der Regel am besten, wenn viele Pipetten verwendet werden) with intrazellulären Lösung und laden sie in ihre Inhaber. Legen Sie die headstages in ihren Aufzeichnungen aber nicht schieben Sie sie nach vorne zu vermeiden, berühren Sie das Bad mit der Pipettenspitze. </li><li> Aktivieren Sie die positive Drucksteuerung und wählen Sie alle Pipetten, um sicherzustellen, dass die Spitzen bleibt sauber. Schieben Sie jede heads an Ort und Stelle. </li></ol></li><li> Auffinden der Pipettenspitzen <ol><li> Positionieren Sie das Mikroskop in eine zentrale Position mit Fokus 3 mm über der Scheibe durch Drücken der Taste bei gedrückter R2-Taste &#39;A&#39;. Verwenden Sie die entsprechende Position für jeden Manipulator aus dem vorherigen Experiment durch Drücken der Taste L2-Taste gespeichert werden, während A. Halten Hinweis: An dieser Stelle sollte es entweder ein unverwechselbares Schatten einer Pipette in Aussicht oder eine kleine Bewegung entlang der Pipette Achse sein sollte, genug, um es in den meisten Fällen zu beobachten. Vergütung für die leichte Unterschiede in Form Pipette muss manuell durchgeführt werden. </li><li> Bringen Sie die Pipettenspitze in den Fokus. Die Spitze auf dem roten Punkt in der Mitte des Videoanzeige ohne Bewegung des Mikroskops (es sollte noch in Position [0, 0 2000] sein). </li><li> Informieren Sie die Software, die die Pipette ist in der Mitte der Anzeige durch Drücken der Taste Z, während die Taste C gehalten Nach jeder Pipettenspitze befindet, senden diese Pipette nach hinten, so dass die folgende kann man durch Drücken der Taste L1-Taste, während A. hält befinden </li></ol></li><li> Annäherung an die Zellen <ol><li> Sobald alle Pipettenspitzen haben genau lokalisiert worden und jede Pipette wird mit einer Zelle zugeschrieben, die Pipetten in der Nähe ihrer jeweiligen Zellen automatisch zu positionieren. Einfach mit der rechten Maustaste in der Mitte der Gruppe von Zellen, und wählen Sie die Option &#39;Cluster&#39; im Popup-Menü. Auf dem Cluster-Optionen-Fenster, die angezeigt wird, wählen Sie alle Pipetten, die Sie in dieser Zeit positionieren möchten, und klicken Sie auf &#39;Go mit allen Pipetten überprüft. Wiederholen dieses Vorgangs für jedes Cluster von Zellen von Interesse. </li><li> Perform den Endanflug manuell. Die Position der Pipette in Bezug auf die Zellen unterschiedlich festgelegt werden, aber gewöhnlich ist einfach 200 &amp;mgr; m entfernt von der Zelle in der Achse der Pipette und 200 um darüber in der vertikalen Richtung, die ausreichen, um die Pipettenspitze außerhalb des Gewebes zu halten, ist . Warten Sie, bis die Positionierung der Pipetten ist fertig und das Mikroskop zu bewegen in Richtung einer Pipette durch Drücken der Taste bei gedrückter R1-Taste C. </li><li> Kalibrieren Sie jede Pipette Position durch die Fokussierung des Mikroskops auf der Spitze überall in der Videoanzeige und Drücken der Taste B bei gedrückter Taste C ein quadratisches Gitter sollte kurz erscheinen, die die identifizierten Position der Pipette. Wenn die Position nicht korrekt ist, positionieren Sie die Spitze auf dem zentralen Punkt der Videoanzeige und drücken Sie die Taste Z gedrückt gehaltener Taste C. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Cell-Attached-Konfiguration <ol><li> Bestätigen Sie, dass die Zelle von Interesse für die aktuelle Pipette richtig istmarkiert. Ansonsten bewegen das Mikroskop, um die Zelle von Interesse mit dem zentralen roten Punkt übereinstimmen. Markieren Sie die Zelle mit der Taste Y-Taste bei gedrückter C-Taste drücken, während L2 Taste C halten, um die Pipette 200 um weg von dem ihm zugewiesenen Zelle positionieren, wird das Mikroskop automatisch in die entsprechende Position zu bewegen. </li><li> Stellen Sie die Pipette Position, damit es den roten Punkt übereinstimmt. Stellen Sie die Pipette durch Drücken der Taste R1-Taste, während X. hält Offset </li><li> Aktivieren Sie den Testimpuls durch Drücken der Taste bei gedrückter L1-Taste X. Langsam nähern sich der Pipette auf seine Zelle zurückgeführt. </li><li> Nach Beobachtung der Bildung einer Vertiefung auf der Oberfläche der Membran der Zelle gelten eine kurze Puls der Unterdruck durch Drücken der Taste Y, während die Taste Z halten, damit der aufgebrachte Druck, um die Zelle zu erreichen. Ein Haltepotential von etwa-65mV sei an dieser Stelle durch Drücken der Taste L2, während die Taste X. Holding gegründet </li></ol></li><li> Whole-Cell-Konfiguration<ol><li> Sobald eine Giga-Dichtung für jede Zelle gebildet, beginnen Aufbrechen der Membranen durch Aufbringen von Unterdruck. </li></ol></li><li> Führen Aufnahmen <ol><li> Verwenden Sie die Stimulation / Erfassungssystem, um Ihre Aufnahmen durchzuführen. Gelten Impulse oder Impulsfolgen auf einer Einzelzelle zu einer Zeit und Reaktionen beobachten, auf den übrigen Zellen, um die Verbindung zwischen den aufgenommenen Zellen abzubilden. </li></ol></li><li> Zurücktreten Pipetten <ol><li> Sobald Aufnahmen fertig sind, zurücktreten Pipetten langsam aus dem Gewebe mit der rechten Maustaste auf die Tabelle Radio-Button. Wählen Sie &quot;zurücktreten-&gt; Pipetten 500 um&quot; zu haben, die Pipetten rücken eine kurze Strecke entlang ihrer Achsen. Beachten Sie die Drift in Potential der Zellen (Clearing die Tipps durch die Anwendung einiger positiver Druck kann helfen). </li><li> Um Pipetten ganzen Weg zurück zurückgehen, stellen Sie die Positionierungsgeschwindigkeit auf &#39;Fast&#39; und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, aber wählen Sie das &quot;Alle&quot;-Option. Entfernen Sie die verbrauchtePipetten durch vorsichtiges Schieben Sie die headstages und Lösen der Pipetten aus den Halterungen. Es ist nützlich, um zu vermeiden, drehen die Inhaber in ihren Höhlen da dies stark mit der Pipettenspitze Position stören. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Eine unmittelbare Frage stellt sich in der Regel über die Erfolgsquote des Verfahrens, die wir beschrieben. Für hohe Erfolgsraten Vorbereitung ist unerlässlich. Pipetten müssen Spitzenöffnungen, die ausreichend für den aufgenommenen Zellen Wesen sind. Filtern des intrazellulären Lösung verstopfte Pipette zu vermeiden, ist ebenfalls wichtig. Extrem sauber, frisch gezapftes Pipetten sind eine weitere Voraussetzung. Eine Binomialverteilung ist das einfachste Modell, die verwendet werden können, um zu verstehen, wi...

Die Fähigkeit, mehrere Seiten mit Mikrometer-Präzision aufnehmen und zu stimulieren ist sehr nützlich für experimentell ein besseres Verständnis der neuronalen Systemen. Viele Techniken haben zu diesem Zweck entwickelt worden, aber die submillivolt Beschluss der Patch-Clamp-Technik, die für das Studium unterschwellige Aktivität und einzelnen postsynaptischen Potentiale erreicht keiner erlauben. Hier behandeln wir die Entwicklung eines Zwölf-Elektrode computergestützten Patch-Clamp-System bei gleichzeitiger Aufnahme und Förderung einer großen Anzahl von Einzelzellen mit ausreichender Genauigkeit für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität gerichtet. Während viele andere Anwendungen für ein solches System konzipiert werden, eignet es sich besonders gut für die Untersuchung von synaptischer Verbindungen gegeben, dass die Anzahl der möglichen Verbindungen innerhalb einer Gruppe von Neuronen wächst proportional zu dem Quadrat der Anzahl von Neuronen in Frage. Während also ein System mit drei Elektroden ermöglicht die Prüfung derAuftreten von bis zu sechs Verbindungen und meist Aufnahme eines einzigen, Aufzeichnungs zwölf Neuronen ermöglicht das Testen des Auftretens von bis zu 132 Anschlüsse, und oft mehr als ein Dutzend beobachtet (Abbildung 1). Die Beobachtung von Dutzenden von Verbindungen gleichzeitig ist es möglich, die Organisation von kleinen Netzwerken zu analysieren und zu schließen statistische Eigenschaften der Netzwerkstruktur, die nicht anderweitig 1 untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglicht eine präzise Stimulation von zahlreichen Zellen auch die Quantifizierung der Rekrutierung von postsynaptischen Zellen 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

Die Patch-Clamp-Technik ist heute die etablierten Verfahren zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen, Zellen oder Zell Fächern. Dennoch Erreichen eines stabilen Aufnahmen, auch aus einzelnen Zellen, bleibt ein zeitaufwendiges Verfahren von beträchtlicher Komplexität. Automatisierung von vielen Schritten in Verbindung mit effizienter Informationsanzeige kann sehr helfen Experimentatoren bei der Durchführung einer größeren Anzahl von Aufnahmen mit größerer Zuverlässigkeit und in weniger Zeit. Um großflächige Aufnahmen zu erreichen schlossen wir der effizienteste Ansatz ist nicht vollständig zu automatisieren den Prozess, sondern um die experimentellen Schritte zu vereinfachen und reduzieren die Chancen auf menschliche Fehler während effizient Erfahrung des Experimentators und visuelles Feedback Einbeziehung. Mit diesen Zielen vor Augen haben wir ein computergestütztes System, das alle notwendigen Kontrollen für eine Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experiment in einer einzigen Schnittstelle, einem commerc zentralisiert entwickeltmathematisch verfügbaren Wireless-Gamepad, während der Anzeige Experiment bezogene Informationen und Führungssignale auf dem Computer-Bildschirm. Hier beschreiben wir die verschiedenen Komponenten des Systems, die uns die Zeit zum Erreichen der Aufnahmekonfiguration zu reduzieren und die Chancen für die erfolgreiche Aufnahme einer großen Anzahl von Nervenzellen gleichzeitig zu erhöhen erlaubt.

Nach den oben beschriebenen Verfahren ist es gelungen, gleichzeitig ausführen Ganzzell-Aufzeichnung von bis zu zwölf Neuronen nahezu verdoppelt die größte Anzahl von Neuronen gleichzeitig patch-geklemmt so weit. Beispiele für Netzwerke der direkten synaptischen Verbindungen zwischen den pyramidalen Neuronen in Schicht V im somatosensorischen Cortex von Ratten sind in Abbildung 6 gezeigt. Die Bestimmung der Verbindungswahrscheinlichkeit Profile als eine Funktion der Zwis...

Watch this Scientific Journal Video about A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System at JoVE.com

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Aufrufe.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen. 

Serie: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.