Diese Arbeit wurde von CIHR MOP-142209 auf TJS unterstützt.

Alle Experimente und Protokolle Versuchstiere wurden von der University of Manitoba Tierethikkommission genehmigt und mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care-konform waren. 1. Herstellung von Instrumenten, Puffer und Lösungen <ol><li> Sterilisieren durch alle Dissektion Ausrüstung Autoklavierung, Glas Pasteur-Pipetten, Pipettenspitzen, Filtervorrichtung und deionisiertes Wasser. </li><li> Vorbereiten einer 20% (w / v; 1,1 M) stock Glucoselösung in entionisiertem Wasser und Filter-Sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Vorbereiten einer 100 mM Natriumpyruvat-Lösung in entionisiertem Wasser und Filter-Sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten calcium- und magnesiumfreier Hank Balanced Salt Solution (CMF-HBSS) durch eine Lösung aus 10% HBSS (10x) zu machen, 10 mM HEPES und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin in deionisiertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate. </li><li> Bereiten 10 mg / ml Desoxyribonuclease I (DNase) in CMF-HBSS,und dann filtrieren sterilisieren und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten glial Medium durch eine Lösung von 30 mM Glucose-Herstellung (von der sterilen Lösung), 95 U / ml Penicillin-Streptomycin und 10-15% Rinderwachstumsserum (BGS) in Minimum Essential Medium (MEM). HINWEIS: Wie im Protokoll angegeben, kann eine Lösung von 5% BGS verwendet werden, wenn erforderlich, die Zellproliferation zu verlangsamen. Pferdeserum anstelle von BGS verwendet werden, aber beachten Sie, dass jede Partie muss aufgrund inter-batch Variation vor dem Einsatz getestet werden. Lagern Sie die zubereitete Lösung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate. Obwohl viele Laboratorien FBS verwenden, beobachteten wir immer wieder, dass in BGS Glia-Wachstum wie in FBS so robust ist. BGS ist aus fötalem Kälberserum abgeleitet sind, die mit chemisch definierten Komponenten ergänzt wird. Darüber hinaus ist BGS wesentlich wirtschaftlicher als FBS. </li><li> Vorbereiten des Neurons Wachstum und Erhaltungsmedium (Neurobasal-B27, NBG), indem eine Lösung von 1x B27 Herstellung Ergänzung und 0,5 mM L-Glutamin in 500 mL Neurobasalmedium MediÄh. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate. L-Glutamin kann mit GlutaMAX substituiert sein, die vorgeschlagen wurde, in dem Wachstumsmedium stabiler zu sein. </li><li> Vorbereiten das Neurons Plattierungsmedium eine Lösung von 30 mM Glukose, indem sie (von der sterilen Lösung), 1 mM Natriumpyruvat (von der sterilen Lösung) und 10% BGS in MEM. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate. </li><li> Es wird eine Lösung von 1 mM Cytarabin (Ara-C) und Filter-Sterilisieren. Aliquot in 1 ml-Portionen und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten einer Lösung von 100 mM APV in 100 mN NaOH sterilfiltriert. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Man löst 1 mg / ml Poly-L-Lysin in Boratpuffer, pH 8,5 (50 mM Borsäure und 12 mM Borax) und Filter-Sterilisieren. Aliquot und Lagerung bei -20 ° C. Anstelle von Poly-L-Lysin, kann ein Poly-L-Ornithin verwendet werden, die auf Zellen weniger toxisch sein können. </li></ol> 2. Glia Kultur Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie kortikale Astroglia-Zellkultur <ol><li&gt; Innerhalb von 24 Stunden von Geburt erhalten Rattenjungen. Legen Sie die Welpen auf Eis, sie zu betäuben. </li><li> Sprühen Sie die Jungen mit 70% Ethanol und enthaupten sie. </li><li> Platzieren Sie die Köpfe in einer 100 mm-Schale auf Eis mit 15 ml CMF-HBSS. </li><li> Jedes Gehirn seziert, indem die Kopfhaut zu schneiden, das Öffnen des Schädels, die brainstem Abtrennen und dann Transferieren, das Gehirn auf 60 mm Petrischalen auf Eis, enthaltend 3 ml CMF-HBSS. </li><li> Trenne die zerebralen Hemisphären vom Hippocampi und dann die Meningen sie umgebenden abstreifen. Übung ausreichend Vorsorge minimale Kontamination von meningeal Fibroblasten zu gewährleisten. Meningeale Fibroblasten in der Kultur kann mit Glia für Wachstum konkurrieren und für Neuron Gesundheit schädlich sein. Sammle alle zerebralen Hemisphären in einer 60 mm-Petrischale auf Eis mit 5 ml CMF-HBSS. </li><li> Entfernen Sie den CMF-HBSS und dann zerkleinert das gesammelte Rindengewebe so fein wie möglich unter Verwendung von Mikro-seziert feder Schere. </li><li> Gebe ausreichend CMF-HBSS zum hackenped Gewebe. Unter Verwendung einer Glaspasteurpipette übertragen die Gewebestücke in ein 15 ml Röhrchen. Bringt das Gesamtvolumen auf 12 ml durch Zugabe von CMF-HBSS. </li><li> 1,5 ml jeweils von 2,5% Trypsin und 10 mg / ml DNase-Lösung. Inkubieren der resultierenden Mischung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 12 min. </li><li> Man reibt das Gewebe 10-15 mal mit einer Glaspasteurpipette, und weiter für 3 min in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert. </li><li> Filtriere den Überstand durch Linsenpapier oder Filtergewebe in ein 50 ml-Röhrchen, die 5 ml BGS. Dies geschieht, Stücke von undissoziierten Gewebe zu entfernen. Alternativ können Sie auch im Handel erhältliche Zellsiebe. </li><li> Hinzufügen 13,5 ml CMF-HBSS und 1,5 ml 2,5% Trypsin zu dem Rohr um die verbleibenden Gewebestücke enthält, und weiter inkubieren bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 10 min. </li><li> Man reibt das verbleibende Gewebe noch einmal, und dann die Suspension Filter wieder in die 50 ml-Röhrchen das anfängliche Filtrat enthalten. Als nächstes spült die lens Papier mit 3 ml BGS. Das endgültige Volumen sollte ca. 38 ml sein. </li><li> Zentrifugieren der Suspension, die die dissoziierten Gliazellen für 6 min bei 130 x g enthält. verwerfen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Glaspasteurpipette. Stellen Sie sicher, dass die pelletierten Zellen am Boden nicht gestört werden. Die Unterseite des Pellets erscheint leicht rötliche Blutkomponenten enthält. </li><li> Übertragen die Gliazellen in 1 ml glial Medium in ein frisches Röhrchen, dabei nicht den rötlichen Teil des Pellets zu stören. </li><li> Fügen Sie bis zu 2 ml Glia-Medium pro pup die kombinierte distanzierten Gliazellen zu suspendieren. Zum Beispiel wurden, wenn 10 Welpen verwendet wird, und dann würde die Gesamt Resuspension Volumen 20 ml betragen. </li><li> Bereiten einer 75 cm 2 Zellkulturflasche pro Pup. Fügen Sie 18 ml vorgewärmtem glial Medium zu jedem Kolben. </li><li> Transfer 2 ml der Zellsuspension zu jedem Kolben und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach einem Tag ersetzen mit 20 ml Glia mittel. In diesem Stadium ist die Kultur eine Mischung aus Glia und anderen unerwünschten Zelltypen. </li><li> Vier Tage nach den Zellen Aussaat, kräftig schütteln die Flaschen nicht-Astrozyten Zellen zu entfernen. Um dies zu tun, spülen Sie die Kolben einmal mit CMF-HBSS, und fügen Sie dann 10 ml frisch CMF-HBSS in jeden Kolben. Schütteln Sie die Kolben kräftig 5-10 mal, und dann die CMF-HBSS absaugen. Spülen zweimal mit CMF-HBSS, und dann 20 ml glial Medium. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um die Entfernung von Nicht-Zielzelltypen zu gewährleisten, und nicht zum Verlust der gewünschten Astrozyten führen. </li><li> Ersetzen mit frischem Glia - Medium zweimal pro Woche , bis die Zellen konfluent sind (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Einfrieren Glia <ol><li> Nachdem die Kulturen konfluent sind, um das Medium absaugen und die Zellschicht mit 10 ml CMF-HBSS waschen. </li><li> 10 ml 0,25% Trypsin / EDTA zu jedem Kolben und Inkubieren bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Tap-Kolben sanft um die Zellen zu entfernen. 1 ml BGS to Jeder Kolben übertragen und die Zellsuspensionen in 15 ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 130 x g für 6 min. Entsorgen Sie den resultierenden Überstand. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 2 ml Medium glial. </li><li> Bereiten Sie die glial Einfriermedium (1-Teil Dimethylsulfoxid und 4-Teilen BGS). 0,5 mL dieser Lösung in jedem von 4 Kryoröhrchen pro Kolben. </li><li> Übertragung von 0,5 ml der Zellsuspension zu jedem Fläschchen, und dann die Zellen einzufrieren langsam, indem die Phiolen in einem isolierten Behälter in einen -80 ° C Gefrierschrank über Nacht platziert. Nach einem Tag überträgt die Fläschchen in einem flüssigen Stickstoff Gefrierschrank für die Langzeitlagerung. </li></ol></li><li> Plating wieder Glia <ol><li> Platte Glia 1-2 Wochen vor dem Neuron Kultur Tag. </li><li> Vorbereiten ein 50 ml-Röhrchen mit 10 ml Medium glial erwärmt. </li><li> Auftauen 1 gefrorene Ampulle von Gliazellen in einem Wasserbad 37 ° C für 2-3 min. </li><li> Transferieren des Inhalts des Fläschchens in das 50 ml-Röhrchen, das 10 ml Medium glial. </li><li> Zentrifugee das Röhrchen für 5 min bei 130 xg und absaugen Überstand. </li><li> Das Pellet in 20 ml Medium glial. </li><li> 3 ml frisches Medium glial zu jedem der Kulturschalen (60 mm), und übertragen dann 1 ml der Zellsuspension zu jeder Schale. Inkubieren der Kulturen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Führen Sie die Zellen zweimal pro Woche. Wenn die Zelldichte 50% Konfluenz gut, bevor das Neuron Kultur Tag erreicht, schalen Sie auf Glia Medium 5% BGS mit der Glia-Wachstumsrate zu verlangsamen. Die gewünschte Einmündung der glial einschichtigen für neuron Kultur beträgt 50% - 70%. </li><li> Ersetzen des Mediums mit glial NBG-Medium (6 ml / Schale) 1-2 Tage vor dem Neuron Kultur. </li></ol></li></ol> 3. Coverslip Vorbereitung <ol><li> Reinigung und Herstellung von Paraffin Beads <ol><li> Unterzutauchen Deckgläser in konzentrierter Salpetersäure (70% wt / wt; VORSICHT: hochkorrosiven) und beschallen sie für 30 min bei Raumtemperatur. Andere Laboratorien haben found es vorteilhaft, die Deckgläser in 70% iger Salpetersäure in Keramikträgern für 12-24 h bei Raumtemperatur statt inkubieren. </li><li> die Salpetersäure in einer bestimmten chemischen Abzugshaube nach institutionellen Richtlinien sorgfältig entsorgen. Spülen Sie das Deck 3-5 mal mit entsalztem Wasser. </li><li> Unterzutauchen die Deckgläser in entionisiertem Wasser und beschallen sie wieder für 30 min (überspringen, wenn die alternative Methode folgende). </li><li> Entfernen Sie die VE-Wasser und spülen Sie die Deckgläser noch dreimal. </li><li> Unterzutauchen die Deckgläser in 50 ml deionisiertem Wasser und sterilisieren, sie durch Autoklavierung. Alternativ sterilisiert die Deckgläser bei 225 ° C in einem Ofen für 6 h. Bei Verwendung dieses alternativen Ansatz überspringen 3.1.9 Schritt. </li><li> Sobald autoklaviert, übertragen die Deckgläser in einen sterilen Laminarströmungshaube für die folgenden Schritte. </li><li> Entfernen des entionisierten Wassers und Spülen mit 20-30 ml 100% igem Ethanol. </li><li> In 20 bis 30 ml 100% Ethanol und übertragen Sie die Deckgläser undEthanol zu einem 100 mm-Petrischale. </li><li> Verwenden stumpfen Pinzette Deckgläser bis 60 mm Petrischalen zu übertragen, 4-5 Deckgläschen pro Schale, und dann lassen sie an der Luft trocknen, indem die Deckgläser gegen den Rand des Tellers lehnt. Nachdem das Ethanol verdampft ist, liegt die Deckgläser auf der Oberfläche flach. </li><li> Übertragung von 10 g Paraffin auf eine geeignete hitzebeständigen Glasflasche. Schmelzen des Paraffins und halten sie auf etwa 150-200 ° C auf einer heißen Platte für mindestens 1 h. Die ideale Temperatur, an der das Paraffin erhitzt werden kann, einige Optimierungen nehmen. Nicht-ideale Temperaturen können zu Schwierigkeiten führen, die richtige Größe der Paraffinkügelchen. Die Wartezeit nach dem Schmelzen hilft einheitliche Temperatur der Flüssigkeit zu gewährleisten. </li><li> Tauchen einer Pasteur-Pipette in das Paraffin, und dann schnell berühren drei Flecken in der Nähe der Kante jedes Deckglas (jeder Punkt etwa 120 ° voneinander entfernt sind). Die Tropfen werden ca. 0,3-0,5 mm hoch und 1,0-2,0 mm im Durchmesser zu Perlen erstarreneter und funktioniert einen Raum zwischen den Neuronen auf dem Deckglas zur Verfügung zu stellen und die gliale einschichtigen unten (Abbildung 2). </li><li> Sterilisieren des Geschirrs unter UV-Licht für 30 min und dann bedecken sie mit Aluminiumfolie und bei Raumtemperatur lagern. Vorbereitete Deck kann für bis zu einem Monat gespeichert und verwendet werden. Paraffinkügelchen sollte das Deck für mindestens eine Woche vor dem Gebrauch haftet gelassen werden. Dadurch wird das Paraffin von Ablösen während der verbleibenden Schritte des Protokolls verhindern. </li></ol></li><li> Beschichtung mit Deckgläsern Poly-L-Lysin <ol><li> Erhalten Petrischalen zuvor hergestelltes Deck mit dem Paraffinkügelchen enthalten. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; l Poly-L-Lysin in Boratpuffer auf der Oberfläche jedes Deckglases und ließ die Lösung auf die Deckgläser sitzen, über Nacht, bedeckt, bei Raumtemperatur. Coat die gleiche Oberfläche wie der, auf dem die Paraffinperlen liegen. Beachten Sie, dass, wenn sie richtig gereinigt, sollte das Poly-L-Lysin leicht verbreitendie Oberfläche des Deckglases zu bedecken. </li><li> Nach einem Tag wäscht die Deckgläser zweimal mit ihnen in sterilem, deionisiertem Wasser für 2 h bei jedem Einweichen. Nach der letzten Wäsche das Wasser mit 4 ml neuronaler Plattierungsmedium pro Schale ersetzen. Man beachte, dass es, dass die Oberfläche der Deckgläser wichtig ist, nicht erlaubt werden, nach dem trocknet nachdem mit Poly-L-Lysin beschichtet wurde. </li><li> Platzieren Sie die Deckhaltigen Speisen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Die beschichteten Deck sollte mindestens 24 Stunden vor dem Neuron Kultur inkubiert werden. Dies wird prime Medium für Neuron Kultur getan. </li></ol></li></ol> 4. Dissection von Hippocampus und Plating Neurons <ol><li> Erhalten eine schwangere Ratte (Embryonaltag 18-19, wie aus dem Tag der Vaginalpfropfens Entdeckung gemessen) und euthanize durch Isofluran-narkotisierten Enthauptung oder andere anerkannte Methode. </li><li> Sprühen der Unterseite der Ratte mit 70% igem Ethanol, und dann einen Einschnitt von der Schamgegend machen through bis zum Ende der Bauchhöhle. Um Verunreinigungen zu vermeiden, achten Sie darauf bei diesem Schritt nur durch die Haut zu schneiden. </li><li> Spülen Sie die Dissektionsinstrumente erneut mit 70% Ethanol und dann geschnitten durch die Bauchdecke in die Gebärmutter zu belichten. Entfernen Sie die beiden Uterushörner und sie in einem sterilen 100 mm Petrischale. </li><li> Führen Sie die verbleibenden Schritte in einer laminaren Strömungshaube. Entfernen Sie die Gebärmutter-Membran, die Föten umgeben. Köpfen und legen sie die Köpfe in einer 100 mm Petrischale mit 20 ml CMF-HBSS. </li><li> Sezieren die Gehirne sofort und sie in eine 60 mm Petrischale mit 2 ml CMF-HBSS auf Eis. Sammeln Sie nur 2-3 Gehirne pro Schale ausreichend Platz für den nächsten Schritt zu ermöglichen. </li><li> Unter einem Binokular abzustreifen die Meningen von der Mittellinie der zerebralen Hemisphären entfernt, und dann die Hippocampi sezieren und legen sie in eine 60 mm Petrischale, enthaltend 4,5 ml CMF-HBSS. Beachten Sie, dass der Hippocampus kann als sichelförmigen struk unterscheidentur in der medialen Oberfläche des kortikalen Hemisphäre, und ist leicht zu entfernen, wie es von einem Ventrikel seitlich begrenzt wird. </li><li> Übertragen der gesammelten Hippocampusgewebe und CMF-HBSS in ein 15 ml Röhrchen. Mit 0,5 ml 2,5% Trypsin, und dann bei 37 ° C inkubieren für 10 min. Papain kann anstelle von Trypsin verwendet werden, da es sanfter ist und die Ausbeute erhöhen. </li><li> Sanft entfernen, indem Pasteurpipette die Trypsinlösung, das Hippocampus-Gewebe am Boden des Röhrchens ungestört bleibt. </li><li> zweimal mit 5 ml CMF-HBSS sanft in das Gewebe waschen, während sie bei 37 ° C für 5 min inkubiert. Nach dem zweiten Waschen, bringen das Gesamtvolumen auf mindestens 5 mL, indem ein ausreichendes Volumen von CMF-HBSS zum Gewebe hinzugefügt wird. Wenn es Hippocampi von mehr als 10 Welpen sind, bis zu 8 ml CMF-HBSS kann hinzugefügt werden. </li><li> Bereiten Sie zwei Varianten von feuerpolierten Pipetten für Gewebedissoziation. Die Spitze einer Variante ist das Normaldurchmesser der Pipette aber mit feuerpolierten geglätteten Kanten. Die andere Variant ist eine mit dem Spitzendurchmesser auf die Hälfte reduziert. belichten kurz auf die Spitze einer Pipette Glas Pasteur diagonal zu einer Flammenquelle, und dann die Spitzen der Pipetten untersuchen. <ol><li> Wiederholen dieses Schritts, bis die Spitzenkante Smoothened worden oder der Durchmesser verringert wurde. Es ist wichtig, den idealen Durchmesser zu finden zu üben, um sicherzustellen, dass das Gewebe einzelne Zellen zu erhalten, ohne zu beschädigen, diese Zellen dissoziiert. </li></ol></li><li> Verreibe das Hippocampusgewebe zuerst von etwa 10 Durchgängen durch eine glattrandige normale Glaspasteurpipette, und dann mit dem reduzierten Durchmesser die Pipette weiteren 5 bis 10 durch. Das Ziel ist es, eine homogene Lösung von Zellen ohne oder mit nur sehr wenigen Gewebeklumpen zu erhalten. </li><li> Bestimmt die Zelldichte einen Hämozytometers oder einen automatisierten Zellzähler verwenden. Typischerweise werden 0,8 bis 1,0 Millionen Zellen pro Pup erhalten, wenn Hippocampi aus den beiden Hemisphären kombiniert sind. </li><li> Bringen Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension zu Gerichtendie Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser in 4 ml Plattierungsmedium eine Plattierung Dichte von 300.000 Zellen pro 60 mm-Schale zu erhalten. Die Dichte der Zellen kann von 100.000 bis 500.000 variiert, abhängig von dem beabsichtigten Experiment. </li><li> Nach 3-4 h, übertragen die Deckgläser mit Neuronen Geschirr angebracht Gliazellen in NBG-Medium enthält. Dies sollte so erfolgen, dass die Seite, auf die die Neuronen überzogen wurden, wird nach unten in Richtung der Glia-Zellschicht. In insgesamt 4-5 Deckgläser pro Glia Gericht. </li><li> Zwei oder drei Tage nach dem Ausplattieren, fügen die Ara-C-Lösung auf eine Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M pro Schal glialen Wachstum zu verhaften. </li><li> Führen Sie die Zellen einmal in der Woche durch Ersetzen von 2 ml des alten Mediums, das mit 2,5 ml frischem Medium bei jeder Fütterung. Das zusätzliche Medium gegeben ist für die Verdampfung über die Zeit zu kompensieren, und nur ein Teil des Mediums verändert wird konsistent Konditionierung des Mediums von den Gliazellen zu gewährleisten. Diese Kulturen sind in der Regel gesund für mindestens einen Monat (Abbildung 3). Neuron überleben kann durch Zugabe von APV zu dem Kulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 100 uM verbessert werden. APV ist ein NMDA-Rezeptor-Antagonist und das Überleben fördert durch Glutamatexzitotoxizität reduzieren. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Während das „Sandwich“ Verfahren zur Kultivierung Neuronen gut beschrieben worden ist , an anderer Stelle 2, 11, gibt es mehrere Schritte im gesamten Protokoll , das ziemlich schwer allein zu beschreiben , in Text, der für die Ermittler zu Frustration führen kann , die es annehmen wollen. Glia-Kultur, Deck Vorbereitung und Neuron Kultur und Unterhaltung: Das Verfahren kann in drei großen Workflows unterteilt werden. Jede der ...

Das Gehirn ist in komplizierte Netzwerke von Neuronen organisiert. Der Beitrag der einzelnen Neuronen zu Netzwerk-Aktivität und Funktion des Gehirns kann durch selektive Veränderung ihrer molekularen Zusammensetzung und perturbance ihrer physiologischen Eigenschaften untersucht werden. Genetische und chemische Manipulation einzelner Neuronen ist wohl einfacher in kultivierten Neuronen als in intakten Hirngeweben, unbelastet von dem zellulären Heterogenität und Komplexität des letzteren. Neurone in Kultur entwickelt wohldefinierte axonalen und dendritischen Dorne und miteinander umfangreiche synaptischen Verbindungen bilden. Während Neuron Kultur von erwachsenen Tieren oder aus anderen Regionen des Nervensystems möglich ist, werden embryonale Hippocampus - Kulturen aufgrund ihrer definierten Pyramidenzellpopulation häufig bevorzugt und eine relativ geringe Dichte Glia 1, 2. Hippocampus-Neuronen bei niedriger Dichte in Kultur gezüchtet sind besonders ameNable auf die Untersuchung von subzellulärer Lokalisierung, Protein Handel, Entwicklung neuronaler Polarität und Synapse. Neuronen in Kultur wird auch bei der Untersuchung molekulare Prozesse in der synaptischen Plastizität 3, 4, 5, 6 extensiv verwendet worden. Neuron Kultur Präparate von Mäusen , die mit globalen genetischen Deletionen , die postnatal nicht überleben haben sich als besonders nützlich erwiesen in 7 zellulären und synaptischen Rollen bestimmter Gene zu studieren. Wie im Gehirn, kultiviert Hippocampus-Neuronen abhängig von trophischen Unterstützung von Gliazellen. Dies erschwert ihre Kultur, und hat zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt, durch die diese Unterstützung geliefert wird. Ein allgemein verwendetes Verfahren beinhaltet Neuronen direkt auf eine Monoschicht von Gliazellen Plattierung 8 oder Verunreinigung ermöglichen Gliazellen aus dem erfassten Hippocampal Gewebe proliferieren und eine Monoschicht unter den Neuronen 9 zu bilden. Während dieses Verfahren einen gewissen Erfolg gefunden hat, ist die Verunreinigung der resultierenden neuronalen Kultur für die Bildgebung Experimente unvorteilhaft. Eine weitere , häufig verwendete Methode der Neuronenkultur verlassen den glial-out feeder insgesamt Schicht und stattdessen trophische Unterstützung in der Form eines definierten Wachstumsmediums 10 bereitzustellen. Hier beschreiben wir das „Sandwich“ oder „Banker“ Methode der Neuron Kultur 2, 11. Dieses Verfahren beinhaltet die Hippokampus-Neuronen auf Glasdeckgläschen Plattierung, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen durch Paraffinwachsperlen abgetrennt suspendiert. Dies erleichtert die langfristige Kultur einer homogenen Population von Neuronen ohne Glia kontaminiert, während für trophische Unterstützung von dem darunterliegenden Glia einschichtigen ermöglicht. Wenn Neuronen sind von ausreichendem Alter oder Reifegrad,die Neuronendeckgläser kann der glial Schale und verwendet in Bildgebung oder funktionelle Assays klappten werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#PP)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25&#160;mm</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflorane</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>2105-841</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butane bunsen burner</td>
			<td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td>
			<td>Model 65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>Corning, Inc</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks (75 cm^2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3054103</td>
			<td>Heat-inactivation is recommended before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9876-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity Convection Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89511-404</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>62786-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Staining Racks</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&#160;GmbH</td>
			<td>1001/18</td>
			<td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-16Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

low-density primary hippocampal neuron culture

Die Fähigkeit, die Struktur und Physiologie der einzelnen Nervenzellen in Kultur zu untersuchen ist entscheidend für das Studium der Neurobiologie und ermöglicht Flexibilität bei der genetischen und chemischen Manipulation einzelner Zellen oder Netzwerk definiert. Eine solche einfache Manipulation in der reduzierten Kultursystem einfacher, wenn auf den intakten Hirngewebe verglichen. Während viele Verfahren zur Isolierung und Wachstum dieser primären Neuronen vorhanden sind, jeder hat seine eigenen Beschränkungen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultivierung von niedriger Dichte und hohe Reinheit rodent embryonale Hippocampusneuronen auf Glasdeckgläschen, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen suspendiert. Diese ‚Sandwich-Kultur‘ ermöglicht exklusives langfristiges Wachstum einer Population von Neuronen während von der darunterliegenden Glia einschichtigen für trophische Unterstützung ermöglicht. Wenn Neuronen ausreichenden Alters oder Reifegrad sind, können die Deckgläser werden in Neuronen Bildgebung oder funktionelle Assays klappt den glial dish und verwendet wird. Neurone grown durch dieses Verfahren typischerweise mehrere Wochen überleben und umfangreiche Dorne, synaptische Verbindungen entwickeln und Netzwerkeigenschaften.

In diesem „Sandwich“ -Methode von Primärnervenzellkultur wachsen Hippocampusneuronen (Figur 3) auf einem Bett von Gliazellen (Abbildung 1) , getrennt durch Paraffinkügelchen (Abbildung 2). Dadurch wird sichergestellt, dass Neuronen wächst selektiv auf Glasplättchen mit minimalen Gliazellen Kontamination aber eine angemessene trophische Unterstützung von Gliazellen auf der Gewebekulturschale wachsen. Typischerweise können Neuron...

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Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K Aufrufe.  University of Manitoba.  Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays. 

Serie: Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...