Dieses Protokoll ermöglicht es dem Anwender, klinisch analoge Schadensmarker in der Netzhautbildgebung von Mäusen quantitativ zu messen, was die Übersetzbarkeit nachfolgender Befunde stärkt. Diese Methoden ermöglichen es uns, die Analyse zu rationalisieren und geben uns die Möglichkeit, die Bildgebung zwischen Versuchstieren zuverlässig zu vergleichen. Während diese Methoden entwickelt wurden, um eine Mausmodellübersicht zu untersuchen, können sie leicht auf die Erforschung von Netzhauterkrankungen ausgedehnt werden, die die gleichen bildgebenden Verfahren verwenden.
Schalten Sie den Lichtkasten des Netzhautbildmikroskops, den optischen Kohärenztomographen und die beheizte Mausplattform ein. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Imaging-Programm. Fügen Sie jedem Auge einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid hinzu.
Injizieren Sie 100 Mikroliter 1% Fluorescein intraperitoneal. Platzieren Sie die Maus auf der Plattform. Passen Sie die Höhe und den Winkel der Plattform an, bis die Sicht auf den Netzhautfundus klar und fokussiert ist.
Machen Sie ein Foto vom Fundus. Öffnen Sie die Software für Bildgebung und optische Kohärenztomographie. Im optischen Kohärenztomographie-Programm stellen Sie den Nudge auf 10 ein.
Nehmen Sie ein optisches Kohärenztomographie-Bild, fügen Sie 75 Mikrometer distal von der Verbrennung hinzu. Wiederholen Sie dies für die anderen drei Quadranten der Netzhaut. Schalten Sie die Kamera auf einen 488-Nanometer-Filter um.
Erhöhen Sie die Kameraverstärkung auf 5. Machen Sie ein Foto des Fundus genau 5 Minuten nach der Fluorescein-Injektion. Öffnen Sie das Fluoreszenzbild in der Bildverarbeitungssoftware.
Duplizieren Sie das Bild. Verfolgen Sie die wichtigsten Schiffe sorgfältig mit einem Auswahlwerkzeug. Ignorieren Sie alle Schiffe, die von diesen Gefäßen abzweigen.
Löschen Sie im ersten Bild die Auswahl, und lassen Sie nur das Schiff übrig. Speichern Sie dieses maskierte Bild. Verschieben Sie die Auswahl auf das zweite Bild, kehren Sie die Auswahl um und löschen Sie sie, wodurch der Hintergrund isoliert wird.
Speichern Sie dieses maskierte Bild. Öffnen Sie das Hintergrundbild und messen Sie die integrierte Dichte. Öffnen Sie das Gefäßbild, wählen Sie den Umriss der Gefäße aus, und messen Sie dann die mittlere Intensität.
Teilen Sie die integrierte Dichte des Hintergrunds durch die mittlere Intensität der Gefäße, wodurch das Leckageverhältnis für das Auge erzeugt wird. Zeichnen Sie dieses Leckageverhältnis für jedes Auge in einer experimentellen Kohorte auf. Um den Hintergrund weiter zu kontrollieren, normalisieren Sie experimentelle Augen auf das mittlere Leckageverhältnis von unverletzten Kontrollaugen.
Öffnen Sie das Bild der optischen Kohärenztomographie in der Bildverarbeitungssoftware. Verfolgen Sie die Grenzen der Ganglienzellschicht, der inneren Plexiformschicht, der inneren Kernschicht, der äußeren plexiformen Schicht, der Photorezeptorschicht und der RPE-Schicht. Exportieren Sie die Dateien als CSV.
Messen Sie die mittlere Dicke jeder Schicht und wiederholen Sie dies für jedes Auge in der experimentellen Kohorte. Öffnen Sie das Bild der optischen Kohärenztomographie in Abbildung J.Messen Sie mit dem Linienwerkzeug den Abstand, in dem der obere Rand der äußeren plexiformen Schicht undeutlich ist. Messen Sie horizontal und behalten Sie den Breitengrad bei, in dem die Desorganisation beginnt.
Berechnen Sie die Summe der ungeordneten Abstände im Bild. Teilen Sie die Länge der Desorganisation durch die Gesamtlänge der Netzhaut, um das Verhältnis der Desorganisation zu erhalten. Wiederholen Sie die Messung und Berechnung für optische Kohärenztomographiebilder aus den anderen drei Quadranten der Netzhaut.
Nehmen Sie den Mittelwert der Desorganisationsverhältnisse aus den vier Bildern der optischen Kohärenztomographie. Diese Zahl stellt die durchschnittliche Desorganisation für die gesamte Netzhaut dar. Wiederholen Sie dies für jedes Auge in der experimentellen Kohorte.
Die maskierten Bilder, die für die Berechnung des Leckageverhältnisses für jedes Netzhautbild verwendet werden, können mit anderen verglichen und analysiert werden, wobei das Hauptgefäßsystem von anderen Bereichen der Netzhaut getrennt wird. Die Fluoreszenzquantifizierung ermöglicht den Vergleich der Schwere der Verletzung und der Wirksamkeit der Behandlung sowie die Untersuchung von Veränderungen der Leckage im Verlauf der Verletzungszeit. Eine Abgrenzung der Schichten der Netzhaut in einem OCT-Bild wird beobachtet.
Die Quantifizierung der Dicke für jede Netzhautschicht zeigt, dass die anfängliche ödematöse Reaktion einen tieferen Einfluss auf die inneren Netzhautschichten hat. Aus einer Analyse eines zeitlichen Verlaufs von Netzhautvenenverschlussschäden kann die anfängliche entzündliche Schwellung der Netzhautschichten und die eventuelle degenerative Ausdünnung beobachtet werden. Die innere Kernschicht erfährt eine viel größere Reaktion auf die anfängliche Verletzung, aber die innere plexiforme Schicht zeigt eine stärkere Ausdünnung, nachdem das anfängliche Ödem stabilisiert wurde und zum Ausgangswert zurückkehrt.
Die Desorganisation der inneren Netzhautschicht manifestiert sich als Verschwinden der oberen Grenze der äußeren plexiformen Schicht, wodurch die äußeren plexiformen und inneren Kernschichten miteinander vermischt werden. Die Netzhautdesorganisation zweier experimenteller Gruppen wurde verglichen, um die Wirksamkeit eines Inhibitors bei der Milderung von Netzhautschäden zu untersuchen. Die Bildqualität ist für die Analysequalität von entscheidender Bedeutung.
Nehmen Sie sich bei der Aufnahme von Netzhautbildern die Zeit, um sicherzustellen, dass der Fundus und die Netzhautschichten so klar und fokussiert wie möglich sind. Diese nicht-invasiven Methoden können longitudinal und in Verbindung mit biochemischen und immunhistochemischen Untersuchungen von Gewebe verwendet werden, um facettenreichere und detailliertere Krankheitsprofile zu erstellen. Diese Technik ermöglicht die zuverlässige Quantifizierung von In-vivo-Netzhautbilddaten in Modellen neurovaskulärer Erkrankungen, so dass Daten leichter in menschliche Erkrankungen übersetzt werden können.
