This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of California, Irvine genehmigt und durchgeführt. Alle Verfahren wurden unter Isofluran-Narkose durchgeführt und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren. 1. Erzeugung von ekotropischen Retrovirus <ol><li> Bereiten hochwertige Plasmide mit einer Konzentration von mindestens 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l entweder eine kommerzielle maxi-prep Kits oder Cäsiumchlorid-Reinigung verwendet wird. HINWEIS: Dazu gehören ein MSCV Rückgrat Vektor codiert , das Gen von Interesse (in diesem Fall CALR 7,8) und Marker der Wahl (GFP, Neo, etc.) sowie eine ekotropischen Verpackung Plasmid, Codierung gag-pol-env (bezeichnet hier als Plasmid). </li><li> Tauen und erweitern Low-Passage 293T-Zellen in DMEM mit 10% FBS und L-Glutamin mit Penicillin / Streptomycin (D10) ergänzt. Platte 5 x 10 6 Zellen in einer 10 cm Gewebekultur-behandelte Schale in einem befeuchtetenGewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> 293T-Zellen in Kultur erweitern. Am Tag vor der Transfektion, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS und absaugen Überstand in ein Vakuumflasche. </li><li> Um Zellen trypsinize, 2 ml 0,05% Trypsin und Inkubation Gerichte in einem befeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 2 - 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> So stoppen Sie Trypsinierung, 3 ml D10 auf Schüssel und Transfer-Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Spin-Zellen bei 400 xg für 10 min. </li><li> Absaugen Überstand in einen Vakuumkolben und resuspendieren Zellpellet in 2 ml D10. </li><li> Zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss unter Verwendung einer Zählkammer. </li><li> Seed 2 x 10 6 Zellen pro Schale in drei 10 cm - Gewebekulturschalen pro behandelten Virus erzeugt. HINWEIS: Für optimale Ergebnisse erlauben nicht die Zellen 30 zu überschreiten - 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion oder eine schlechte Virus Ausbeute erhalten werden kann. </li><li> Unmittelbar vor der Transfektionabsaugen Medien in eine Vakuumflasche und ersetzen mit 5 ml frischem D10. </li><li> Für 10 cm Petrischale zu transfizierenden eine individuelle sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten. </li><li> Pipette 760 ul reduziert Serum Medien in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie dann vorsichtig 40 ul Transfektionsreagenz direkt in den Medien. Die Röhrchen in der Gewebekultur-Haube bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In 30 ug MSCV Vektor mit Gen von Interesse (15 ug, wenn ein leerer Vektor verwendet wird) sowie 5 ug Plasmid zu jedem jeweiligen Rohr und vorsichtig mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren bei Raumtemperatur in der Gewebekultur-Haube für weitere 15 min. HINWEIS: Kleinere Vektoren höhere Virusausbeuten zu neigen. </li><li> Vorsichtig das Gesamtvolumen jeder Reaktion (etwa 800 ul) tropfenweise in die jeweiligen 10 cm Petrischale und sanft die Schale von einer Seite kippen zu mischen zu Seite. Rück Zellen an die befeuchtete Gewebe culture Inkubator. </li><li> Nach einer 8 Stunden oder über Nacht Inkubation in Gewebekultur-Inkubator, absaugen Medien in eine Vakuumflasche und ersetzen vorsichtig mit 10 ml frischem D10. </li><li> Bei 48 h nach der Transfektion Überstand in ein 35 ml-Spritze gesammelt und filtriert durch ein 0,45 um Membranzelltrümmer zu entfernen. </li><li> OPTIONAL: Platz 10 ml frisch D10 zurück auf den 293T-Zellen und zusätzliche Virus kann bei 72 Stunden nach der Transfektion geerntet werden. </li><li> Entsorgen 293T-Zellen in Biohazard Abfall, wenn keine zusätzlichen Virus gesammelt wird. </li><li> Aliquotieren Virusüberstand in den einmaligen Gebrauch Volumina (zum Beispiel 1 ml für Virustiter oder 6,5 ml für BM-Infektion). Flash-Freeze-Virus mit flüssigem Stickstoff und Speicher-Virus bei -80 ° C. Hinweis: Wiederholtes Einfrieren / Auftauen vermeiden , da sie stark Virustiter reduzieren. </li></ol> 2. Bestimmen Relative Virustiter von Flow Cytometry <ol><li> Thaw 3T3-Zellen und in D10 halten. Kultur der Zellen in einem 10 cmGewebekulturschale in einem befeuchteten Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 behandelt. </li><li> Führen Sie virale Titer in dreifacher Ausfertigung. Zur Herstellung von Zellen, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS und absaugen Überstand in ein Vakuumflasche. </li><li> Um trypsinize Zellen, 2 ml 0,05% Trypsin und Inkubation Gerichte in einem befeuchteten Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> So stoppen Sie Trypsinierung, 3 ml D10 auf Schüssel und Transfer-Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Spin-Zellen bei 400 xg für 10 min. </li><li> Absaugen Überstand in einen Vakuumkolben und resuspendieren Zellpellet in 2 ml D10. </li><li> Zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss unter Verwendung einer Zählkammer. </li><li> Seed - 3T3 - Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen in fünfzehn 60 mm Gewebekultur-behandelten Speisen und über Nacht inkubieren. </li><li> Machen 1: 3, 1.10, 1.30 und 1: 100 Verdünnungen der aufgetauten viralen Überstand unter Verwendung von D10 in insgesamt 1 ml. Auch gehören eine virenfreie Kontrolle. </li><li> absaugen michdia von 3T3-Zellen in einen Vakuumkolben und ersetzen mit 4 ml D10. </li><li> Überlagern, die 3T3-Zellen mit den Verdünnungen des Virusüberstand und fügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml zu jeder Schale. Inkubieren für 48 Stunden in der Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Bestimmen relativer Virustiter mittels Durchflusszytometrie: <ol><li> Um Zellen zu waschen, saugen die Medien in eine Vakuumflasche und mit 5 ml PBS. </li><li> Saugen Sie das PBS in eine Vakuumflasche. 1 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 2 bis 5 min Zellen von Schale zu lösen. </li><li> 3 ml D10 und Pipette nach oben und unten um alle verbleibenden Zellen von der Platte zu lösen. Übertragung der Zellen auf eine FACS-Röhrchen und zentrifugiert bei 400 xg für 10 min. </li><li> Dekantieren Überstand und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min und umfüllen Überstand. Resuspendieren in 200 ul PBS. </li><li> Führen Zellen auf einem Durchflusszytometer 9. Sammeln Sie zwischen 20.000 - 30.000 Ereignisse innerhalb von ter leben Zell - Gate (bestimmt durch FSC gegen SSC) und berechnen Sie den Prozentsatz der GFP + und GFP - Zellen. HINWEIS: Der Virustiter wird als akzeptabel angesehen , wenn die Verdünnung 01.30 viraler Überstand Ausbeuten von mindestens 50% GFP + 3T3 - Zellen. Wenn diese Verdünnung führt zu weniger als 50% GFP + Zellen dann suboptimale Transduktion Ergebnisse erhalten werden. Die Berechnung auf virale Titer Bestimmung wurde von Limon et al angepasst. , Blood (1997) 9. </li><li> Um zu bestimmen , relativ Virustiter, verwenden Sie die Gleichung: Virustiter = Partikelbildenden Einheiten (PFU) / ml = [(Anzahl der 3T3 - Zellen × Häufigkeit von GFP + Zellen) / Volumen der Überstand (ml)] × Verdünnungsfaktor. </li></ol></li></ol> 3. transduzieren Spender-Knochenmarkzellen <ol><li> Um Spendermäuse für Knochenmark (BM) Ernte ersten Mäuse betäuben durch Isofluran Verdampfer mit einer Flussrate von 5% kombiniert zusätzliche VorbereitungSauerstoff bei 1 l / min. Pinch Fuß Ansprechbarkeit zu beurteilen. HINWEIS: Donor - Mäuse (weniger als 8 Wochen alt) sollte 5 Tage vor der Ernte des Knochenmarks (8 Tage vor der Transplantation) hergestellt werden. Ein Spendermäuse genügend Zellen zur Verfügung stellen für mindestens zwei Empfänger. </li><li> Injizieren von 150 mg / kg 5-Fluorouracil (5-FU) über retro-orbitale Injektion an narkotisierten Mäusen unter Verwendung einer 27 G × ½ &quot;Nadel. VORSICHT! 5-FU ein Anti-Krebs-Chemotherapeutikum. Immer Griff 5-FU in einem zertifizierten chemischen Abzugshaube oder ein Abluft- Biosicherheitsschrank. Wenden Sie sich an den Labor- und Tierschutzausschuss des Instituts entsprechende Kennzeichnung von Mäusen, die mit 5-FU behandelt zu bestimmen. <ol><li> Positionieren Sie den narkotisierten Maus auf die Seite und zurückhalten, indem Sie sowohl den Daumen und Zeigefinger, so dass das Auge leicht aus dem Kopf herausragt. </li><li> Beginnend mit der Nadel seitlich zur inneren Augenwinkel und mit der Fase nach oben, legen Sie die Nadel in einem 45° Winkel in medialer Richtung und zu stoppen, wenn die Nadel zur Hälfte eingelegt ist. Langsam Zellen injizieren und sorgfältig Nadel entfernen entfernen. HINWEIS: Wenn diese Technik richtig ausgeführt wird, sollte das Auge etwas einfahren und keinen Widerstand sollte bei Nadelung zu spüren sein. </li><li> Untersuchen Sie die Maus auf Anzeichen von Verletzungen wie Schwellungen oder Blutungen. </li></ol></li><li> Ernte-Knochenmark 5 Tage nach der 5-FU-Behandlung (3 Tage vor der Transplantation). <ol><li> Anästhesieren Mäuse durch Isofluran-Verdampfer mit einer Durchflussrate von 5% kombinierten zusätzlichem Sauerstoff bei 1 L / min. Pinch Fuß Ansprechbarkeit zu beurteilen. </li><li> Sacrifice Maus durch Genickbruch. Sterilisieren Maus durch großzügig mit 70% EtOH Spritzen bis Fell nass wird. </li><li> Mit einer Schere zu sezieren, machen einen Einschnitt in der Haut und sezieren aus der Beinmuskulatur der Faszie entfernt. Als nächstes sezieren von der Maus, das Bein weg durch den Femur an der Hüfte und der Tibia an dem Knöcheltrennen. </li><li> Biegedas Bein in eine &quot;L&quot; -Form und trennen Sie die einzelnen Beinknochen, indem sie mit Dissektionsscheren am Kniegelenk zu schneiden. </li><li> Um Knorpel an den distalen Enden jedes Beinknochen zu entfernen, verwenden Sie die Dissektionsscheren sanft Muskel zu einem Ende des Beinknochen kratzen, bis Knorpel ausgerückt ist. </li><li> Unter Verwendung einer Spritze mit einer 27 G x ½ inch Nadel, ergänzt flush jedes Bein Knochen mit PBS mit 2% FBS über eine 100 uM Nylonmembran in einem 50 ml konischen Röhrchen. Flush Knochen, bis Knochen weiß wird die Anzahl der Zellen geerntet zu maximieren. </li><li> Verwenden Sie den Kolben einer Spritze Zellen durch die Nylonmembran in die 50 ml konischen Röhrchen Maische eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Wiederholen Sie mit anderen Maus Bein. </li></ol></li><li> Zentrifugenzellen bei 4 ° C für 10 min bei 400 xg und Überstand verwerfen. Resuspendieren BM in 5 ml Ammoniumchlorid Kalium (ACK) -Puffer roten Blutkörperchen zu lysieren. Inkubieren Zellen auf Eis für 10 min. </li><li> Füllen Sie Röhrchen mit PBS Zell-Lyse zu stoppen. Centrifuge Zellen bei 4 ° C für 10 min bei 400 xg und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Lyse Schritt, wenn das BM-Pellet rote Farbe hat. </li><li> Resuspendieren in 5 ml PBS und Zellen durch Trypanblau-Ausschluss zählen eine Zählkammer. </li><li> Die Zellen bei 2 x 10 6 Zellen pro m mit 2x pre-stim Cocktail, enthält DMEM mit 20% FBS ergänzt, L-Glutamin, Penicillin / Streptomycin, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) und SCF (112 ng / ml). Plate 2 ml pro Vertiefung in 6-Well-Platten. </li><li> Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> 2 ml Virusüberstand in jeder Vertiefung enthält, BM-Zellen und fügen Polybren (8 ug / ml). Spin-Platten bei 30 ° C für 90 min bei 1500 xg dann zurück Platte auf die über Nacht Inkubator Kultur Gewebe. </li><li> Pipette Zellsuspension in konische Röhrchen und Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 400 · g, nicht verwerfen die Platte. Die Zellen in 2 ml frisch 2x pre-stim Cocktail pro Vertiefung und Rückkehr zu den ursprünglichen Brunnen. </li&gt; <li> Führen Sie eine 2. spinoculation durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen. </li></ol> 4. Transplantations-Spenderzellen in Empfängermäuse <ol><li> Bereiten syngene Empfängermäuse für die Transplantation mit letalen Dosis Ganzkörperbestrahlung &lt;24 h vor der Injektion von BM-Zellen. HINWEIS: Lethal dose Bestrahlung für Balb / c - Mäusen ist in der Regel 800-900 cGy und 1000-1200 cGy für C57B / 6 10. Die Dosis wird in der Regel in zwei Sitzungen der Bestrahlung gespalten mindestens 3-4 Stunden Abstand. </li><li> Fortsetzung von Schritt 3.11 Ernte transduzierten Spenderzellen aus den 6-Well-Platten durch leichtes Überstand in konische Röhrchen pipettieren. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml PBS Restzellen zu sammeln und zu 50 ml konischen Röhrchen hinzufügen. </li><li> 0,5 ml von 0,05% Trypsin in die Vertiefungen und Inkubieren bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator für 5 min. </li><li> 1 ml D10 in die Vertiefungen und lösen alle verbleibenden Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Hinzufügen von Zellen zu dem jeweiligen Rohrs aus Schritt 4.2 und Pellet durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 400 x g. </li><li> Wasche die Zellen mit PBS und Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 400 x g. Resuspendieren in 5 ml PBS und zählen Zellen einer Zählkammer durch Trypanblau-Ausschluss verwenden. HINWEIS: Wenn der Vektor ein GFP - Tag hat dann quantifizieren den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen mit einem Durchflusszytometer. </li><li> Resuspendieren 5 x Oktober 5-02 x 10 6 Zellen in 50 bis 100 &amp; mgr; l PBS für die Injektion in Mäuse. </li><li> Injizieren Zellen über retro-orbitale Injektion in narkotisierten Mäusen eine sterile 27 G x ½ &quot;Nadel. Hinweis: andere Injektionstechniken umfassen Schwanz-Vene, Milz- oder femoralis. <ol><li> Anesthetize Maus Isofluran und Prise Fuß mit Ansprechbarkeit zu bewerten. </li><li> Bewegen Sie die Maus auf die Seite und zurückhalten, indem Sie sowohl den Daumen und Zeigefinger, so dass das Auge leicht aus dem Kopf herausragt. </li><li> Mit der Schräge nach oben ein, legen Sie die needle lateralen zur medialen Augenwinkel in einem 45 ° -Winkel. HINWEIS: Wenn diese Technik richtig ausgeführt wird, sollte das Auge etwas einfahren und keinen Widerstand sollte bei Nadelung zu spüren sein. </li><li> Untersuchen Sie die Maus auf Anzeichen von Verletzungen wie Schwellungen oder Blutungen. HINWEIS: Nach der Transplantation Mäuse werden für eine Reihe von Wochen niedrigen Blutbild und sind so anfällig für Infektionen. Prophylaxe mit Antibiotika oder die Verwendung von angesäuerten Wasser verwendet werden. </li></ol></li><li> Einen Monat nach der Transplantation, messen Sie die% GFP im peripheren Blut als Indikator für die transplantierten Spenderzellen mittels Durchflusszytometrie. HINWEIS: GFP allein kann nicht den Erfolg der Transplantation der Zellen zu bestimmen. Die virale Transduktion konnten möglicherweise nicht noch Verpflanzung aufgetreten sind. In diesem Fall + keine GFP Zellen würde erkannt, aber engraftment der transplantierten Zellen erfolgreich war. <ol><li> Nehmen Sie sich 10 ul peripheren Blut by Punktierung der Vena Beinvenen mit einem 21 G x 1 ½ &quot;Spritze und fügen Sie es zu 100 mM EDTA in PBS Koagulation zu verhindern. </li><li> 1 ml ACK an Blut und lyse auf Eis für 10 min. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 400 xg für 10 min. </li><li> Überstand wird abgesaugt in einem Vakuumkolben und 1 ml PBS mit 2% FBS Lyse zu stoppen. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 400 xg für 10 min. </li><li> Überstand wird abgesaugt in einem Vakuumkolben und Pellet in 100 ul PBS, ergänzt mit 2% FBS. </li><li> Führen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer und sammeln 300.000 Ereignisse innerhalb des Live - Zell - Gate (bestimmt durch FSC gegen SSC) und berechnen Sie den Prozentsatz der GFP + und GFP - Zellen 9. </li></ol></li><li> Zusätzlich nach 1 Monat nach der Transplantation, führen Sie ein komplettes Blutbild (CBC) , ein automatisiertes veterinär Hämatologieanalysator 18 mit Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. HINWEIS: Weiter Krankheit , die durch% zu überwachenGFP im peripheren Blut und monatlichen CBC. </li><li> Um das Experiment zu beenden, betäuben Maus mit Isofluran und Prise Fuß Ansprechbarkeit beurteilen. Sacrifice Maus durch Genickbruch und Ernte Milz und Knochenmark für die Histopathologie. HINWEIS: Die Länge des Experiments ist subjektiv und das Abschlussdatum zu erwarten auf der Grundlage der Krankheits - Phänotyp beurteilt werden. </li></ol>

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	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model.">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li><li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis.">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li><li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F.">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18 (2006).</li><li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease.">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li><li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , (2015).</li><li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li><li>Araki, M., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+thrombopoietin+receptor+by+mutant+calreticulin+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. , (2016).</li><li>Lim&#243;n, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells.">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells.">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li><li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis.">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li><li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells.">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li><li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells.">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms:+JAK+of+all+grades.">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li><li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloproliferative+neoplasm+animal+models.">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Beschreibung, wie Knochenmark-Transplantationen bei Mäusen führen ein wesentlicher thrombocythemia ähnliche Erkrankung mit Progression zu Myelofibrose mit CALRdel52 Mutation als Treiber der Krankheit zu rekapitulieren. Erfolgreiche Transplantation von Zellen CALRdel52 führt zu einer erhöhten Thrombozyten Expansion von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose exprimieren. Als Knochenmarktransplantation ein mehrstufiger Prozess ist, ist es wichtig, Maßnahmen zu erkennen, wo tec...

Transduktion-Transplantation ist eine nützliche Methode hämatologischen Malignomen in Mäusen zu modellieren. Diese Technik ist besonders wertvoll myeloischen malignen Erkrankungen , für das Studium an der ersten Demonstration aus dem Jahr die ektopische Expression von BCR-ABL1 getreulich chronischer myeloischer Leukämie in Mäusen 1 rekapitulieren könnte. Diese Technik hat in der Folge der umfangreichen Studie von JAK2 V617F und MPL W515K / L mutierten myeloproliferativen Neoplasien (MPN) erleichtert. MPN sind eine Gruppe von hämatologischen durch die Überproduktion von reifen myeloischen Zellen und Knochenmarkfibrose gekennzeichnet malignen Erkrankungen. Diese Krankheiten im Allgemeinen ergeben sich aus der klonalen Expansion einer hämatopoetischen Stammzellen, die eine somatische Mutation in entweder Jak2, MPL oder CALR erworben hat. Transduction-Transplantation JAK2 V617F und MPL W515K / L - Modelle zeigen die klinischen Merkmale von Polyzythämie und Myelofibrose 2 bis 5 &lt;/ Sup&gt;. Vor kurzem wurde ein Mausmodell für Calreticulin-mutierten MPN auch mit der Transduktion-Transplantationsverfahren 6 erzeugt worden ist . Diese Mäuse eine essentielle Thrombozythämie-ähnliche Erkrankung mit einem erhöhten Blutplättchen, erhöhte Anzahl von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose entwickeln. Zusammen haben diese Modelle nicht nur bot die Gelegenheit, einen Einblick in die molekularen Pathogenese der MPN zu gewinnen, sondern auch die Fähigkeit Therapeutika in einer präklinischen Einstellung zu entwickeln und zu studieren. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Transduktion-Transplantation Methodik mit einem Schwerpunkt auf der CALRdel52 Mutation. Diese Technik beinhaltet die Transplantation von retroviral transduzierte Knochenmarkszellen exprimieren die Mutante in bestrahlte syngene Empfängermäuse konstruieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELL LINES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASMIDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoPak, also known as pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td>Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional &#947;-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20672</td>
			<td>Additional &#947;-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONSUMABLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-052-CI</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FU</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974061B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365809001</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction-transplantation mouse model of myeloproliferative neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Die Transduktion-Transplantationstechnik führt in hämatopoetische Rekonstitution der Empfängermäuse mit Zellen, die das Gen von Interesse exprimieren. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die transduktionsfertige Transplantation Mausmodell der Calretikulin mutiert MPN. Kurz gesagt, wird Retro CALRwt oder CALRdel52 exprimieren, verwendet BM-Zellen aus einem C57B / 6 Spendermaus zu infizieren. Transduzierten Zellen transplantiert in bestrahlten C57B / 6 Empfängerm...

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Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.8K Aufrufe.  University of California, Irvine. This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation. 

Serie: Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Forschung

Krebsforschung

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor types, numerous mouse models have been developed in order to investigate the next generation of cancer therapies. However, in GIST, most in vivo studies use xenograft mouse models which have inherent limitations. Here, we describe an immunocompetent, genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor harboring a KitV558&#916;/+ mutation. In this model, mutant KIT, the oncogene responsible for most GISTs, is driven by its endogenous promoter leading to a GIST which mimics the histological appearance and immune infiltrate seen in human GISTs. Furthermore, this model has been used successfully to investigate both targeted molecular and immune therapies. Here, we describe the breeding and maintenance of a KitV558&#916;/+ mouse colony. Additionally, this paper details the treatment and procurement of GIST, draining mesenteric lymph node, and adjacent cecum in KitV558&#916;/+ mice, as well as sample preparation for molecular and immunologic analyses.

The goal of this manuscript is to describe the KitV558&#916;/+&#160;mouse model and techniques for successful dissection and processing of mouse specimens.

Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...