We thank the Western University of Health Sciences for the Intramural Grant.

Das Protokoll weiter unten beschrieben wird, unter Anleitung und Genehmigung der Western University Animal Care und Verwenden Ausschuss ausgeführt. Alle Versuche werden unter Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden durchgeführt. 1. Zellkultur <ol><li> Herstellung von Komplettmedium <ol><li> Mit einer Klasse-II-biologischen Sicherheitsschrank, bereiten komplettes Medium durch aseptisches Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (P / S) in einen 500-ml-Flasche RPMI-Medium. Vorsichtig mischen durch Schwenken. Die Endkonzentration jedes Ergänzungsmittel ist 10% FBS und 1% P / S (v / v). Beispielsweise ergänzen 500 ml Medium mit 56 ml FBS und 6 ml P / S. </li><li> Platzieren Komplettmedium in einem Wasserbad bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Auftauen und Propagierung von Zellen <ol><li> Abrufen PANC-1-GFP-Zellen aus flüssigem Stickstoff. Tauen Sie das Fläschchen durch vorsichtiges Schütteln in einem Wasserbad bei 37 ° C. Hinweis:Auftauen sollte schnell sein (ca. 2 - 3 min). </li><li> Aufkleber-T-75-Flaschen verwendet werden mit (a) Zell-Linie Name, (b) Passage-Nummer, (c) das Datum und (d) Forscher Initialen. </li><li> Wischen Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol und Transfer Fläschchen zu einem Bio-Sicherheitsschrank. </li><li> Um die Zellen zu propagieren, fügen 9,0 ml vollständigem Medium in ein 15 ml konischen Röhrchen. Unter Verwendung einer 1,0 ml Pipette vorsichtig die Zellsuspension und suspendieren es in 9 ml Vollmedium. </li><li> Zentrifuge bei 125 × g für 8 min bei RT. Übertragen Sie die konische Fläschchen auf einem Bio-Sicherheitsschrank und den Überstand aspirieren, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 10 ml frischem Komplettmedium durch sanft die Suspension bis Pipettieren und ab. </li><li> Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und Platte sie in T-75 - Kolben mit einer Dichte von 2,1 x 10 6 Zellen / Kolben. Danach wird der Kolben in einen Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Überwachen Sie die Zellen täglich von Auge und unter dem Mikroskop. Wenn Grippeid Erneuerung erforderlich ist, aseptisch aspirieren die vollständige Wachstumsmedium aus dem Kolben und entsorgen. In gleichem Volumen von frischem Vollmedium. </li></ol></li><li> Propagierung von Zellen <ol><li> Aseptisch entfernen Medium aus dem Kolben. 5 ml Dulbecco-Phosphatpuffer-Salzlösung (DPBS) Zellen zu spülen und zu verwerfen. </li><li> Lösen sich die Zellen aus dem Kolben durch Zugabe von 3 ml 0,25% Trypsin. Inkubieren Kolben bei 37 ° C und 5% CO 2 für 5 bis 10 min , enthaltend Trypsin. </li><li> Beobachten Zellen unter dem Mikroskop (10-facher Vergrößerung) und sicherzustellen, dass sie sind rund und verdrängt. </li><li> Neutralisieren Trypsin durch ein gleiches Volumen von komplettem Medium Zugabe und brechen Klumpen durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und übertragen die entsprechenden Zellsuspensionsvolumen an neue Kolben bei der Zelldichte in 1.2.7 erwähnt; fügen Sie genug frische Medien so das endgültige Volumen 10 ml pro Flasche ist. </li></ol></li><li> Handy SuspensIonen-Injektionspräparat Hinweis: Da die Basalmembranmatrix, hohe Konzentration, bei RT erstarrt, halten alle Materialien auf dem Eis. Legen Sie alle sterilen Pipettenspitzen und Fläschchen in den Gefrierschrank über Nacht, und auf Eis halten, während auf der Aufhängung arbeiten. <ol><li> Halten Sie eine Flasche von RPMI-Medium ohne Zusätze auf Eis. Auftauen Basalmembranmatrix, hohe Konzentration, durch Anweisungen folgenden Herstellers. Vorzugsweise aliquoten in kleinere Fläschchen , um mehrere Gefrier-Auftau - Zyklen 10 zu vermeiden. </li><li> Absaugen Medien aus allen Flaschen und spülen mit 5 ml DPBS. Wiederholen Sie alle Schritte auf dem letzten Abschnitt bis 1.3.4 zu treten. </li><li> Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 125 g für 8 min bei RT. Übertragen konische Fläschchen auf die biologische Sicherheit Kabinett und erneut zu suspendieren Pellet mit 10 ml DPBS. </li><li> Pipette vorsichtig die Suspension des Pellets aufzubrechen nach oben und unten. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifuge wieder wie in s skizzierttep 1.4.3. Überstand absaugen und in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen, fügen geeignete Verdünnungsmittel , um 3 x 10 6 Zellen in einem Volumen von 50 &amp; mgr; l. 1 (v / v) Verhältnis: Das Verdünnungsmittel wird in einer 1 ein Gemisch von serumfreien Medien und hohe Konzentration Keller Matrix Membran sein. </li><li> Vortex die Suspension sanft und auf Eis halten zu allen Zeiten. Die Suspension ist jetzt bereit für die Injektion. </li></ol></li><li> chirurgische Implantation Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Materialien und Instrumente sind steril. Üben Sie aseptische Techniken zu allen Zeiten. <ol><li> Legen Sie ein Heizkissen auf den Tisch und Deckel mit einem sterilen Tuch. Stellen Sie die Anästhesiegerät und sicherzustellen, alle Lieferungen in greifbarer Nähe sind. </li><li> Legen Sie die Schnauze des Tieres in die Narkosemaske und eingerichtet, um die Anästhesie bis 1 l / min Sauerstoff und 2,5% Isofluran. </li><li> Vorsichtig schrubben die Flanke des Tieres mit Jod und spülen mit 70% Ethanol. Dreimal wiederholen. </li><li> Bestätige dasTier wird durch Einklemmen der Hinterpfote vollständig betäubt. Das Tier ist völlig betäubten und bereit für die Operation, wenn keine Antwort beobachtet wird. Wenn jedoch das Tier zuckt zusammen, gewährleisten eine ausreichende Anästhesie im Verdampfer ist und lassen Sie das Tier mehr Zeit vollständig unter Narkose zu gehen. </li><li> Last etwa 200 &amp; mgr; l der Zellsuspension in ein 1,0 ml TB-Spritze mit einer 18 G-Nadel (vorher abgekühlt). Ersetzen Sie die Nadel mit einer 27 G-Nadel und zurück zum Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Suchen Sie den allgemeinen Bereich der Milz (linken oberen Quadranten des Bauches) und mit einer Pinzette Drücken Sie die Haut an der Spitze dieser Region. Mit chirurgische Scheren einen Einschnitt machen von etwa 1,0 cm eine Tasche zu erstellen. In ähnlicher Weise eine Prise der glatten Muskulatur auf der Oberseite der Milz und durchgeschnitten, um die Bauchhöhle zu gelangen. </li><li> greifen Sie vorsichtig das Schwanzende der Milz und ziehen Sie sie aus dem Körper heraus. Die Bauchspeicheldrüse wird die Milz angebracht werden. Verbreiten Sie die Bauchspeicheldrüse ein nasses st miterile Q-Tip und den Schwanz des Pankreas finden. </li><li> die 50 &amp; mgr; l Injektion in den Schwanz des Pankreas liefern, lassen Sie die Nadel innerhalb 10 Sekunden und drehen sich langsam die Nadel aus der Bauchspeicheldrüse. Eine erfolgreiche Implantation wird aussehen wie eine oberflächliche Blase ohne Leckagen. </li><li> Rückkehr der Bauchspeicheldrüse und Milz in die Bauchhöhle. Zuerst die Muskeln umschließen und dann die Haut getrennt umschließen. Verwenden Sie einen 6-0 Naht oder Klammer den Schnitt zu schließen. Zur Vermeidung von Schmerzen im Tier, verabreichen Ketoprofen subkutan (SC) (5 mg / kg) über 24 Stunden. (- 0,1 mg / kg 0,05) alle 12 Stunden über einen 36 Stunden-Zeitraum Alternativ Buprenorphin sc verabreichen. </li><li> Gewinnen Sie das Tier aus der Narkose und wieder in seinem Käfig. Auch für Schmerzen zu überwachen. Chirurgie - Die Tiere müssen mit der Schmerzlinderung bei der (präemptive oder sogar vor) zur Verfügung gestellt werden. Zusätzliche Schmerzlinderung müssen Tiere zur Verfügung gestellt werden, die Schmerzen nach IACCUC-Protokoll auftreten oder wie sie die vorgeschriebene beidazu neigt, Tierarzt oder designee. </li></ol></li><li> In vivo Imaging Hinweis: Bildaufnahme wurde ein kommerzieller Bildsystem mit einer dunklen Kammer und den entsprechenden Filtern für GFP-Bildgebung ausgestattet unter Verwendung. Die Bildaufnahme wurde mit einer CCD-Kamera und ein optisches System durchgeführt, bestehend aus austauschbaren Anregungs- / Emissionslinsen (Anregung: 455 bis 495 nm; Emission: 513-557 nm). Hellfeldbilder wurden für jeden Zeitpunkt bei 1 x 1 Binning ohne Filter eingefangen. Die Anregung von GFP verwendet, um eine Xenon Multispektraldaten Lichtquelle. Die Tiere wurden unter Anästhesie während des gesamten Bilderzeugungsprozesses gehalten , indem die Anästhesiemaschine zu einem Gasverteiler Anästhesie in die dunkle Kammer des Abbildungssystems integriert verbindet. <ol><li> Anesthetize das Tier, wie in 1.5.2 beschrieben. Ein Narkosemaske ist im Inneren der kommerziellen dunklen Kammer des Bildgebungssystems, um das Tier unter Narkose während der Bildgebung zu haltenverarbeiten. </li><li> Stellen Sie die richtigen Anregungs- und Emissionsfilter auf. </li><li> Beginnen Sie, indem nur ein Anfangsbild mit weißem Licht zu erhalten. Halten Sie die gleiche Position des Tieres in der gesamten Imaging-Sitzung und wechseln Sie zu GFP Filter ein zweites Bild zu nehmen. </li><li> Die besten Ergebnisse erzielen beide Bilder überlagern. Analysieren Sie das Bild für fluoreszierende Fläche und Intensität. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smyth, E., Cunningham, D., Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harrison's Principles of Internal Medicine. , (2015).</li><li>Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+borderline+resectable+pancreatic+cancer.">Management of borderline resectable pancreatic cancer.</a> World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).</li><li>De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+pancreatic+cancer.">Diagnosis and management of pancreatic cancer.</a> Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+orthotopic+xenografts:+better+mimic+of+metastasis+than+subcutaneous+xenografts.">Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts.</a> Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo.">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).</li><li>Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+orthotopic+pancreatic+cancer+mouse+model:+cells+suspended+and+injected+in+Matrigel.">Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel.</a> World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).</li><li>Arranz, A., Ripoll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optical+imaging+for+pharmacological+studies.">Advances in optical imaging for pharmacological studies.</a> Front Pharmacol. 6, 189 (2015).</li><li>Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+serial+selection+of+human+pancreatic+cancer+cells+in+orthotopic+mouse+models+produces+high+metastatic+variants+irrespective+of+Kras+status.">In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status.</a> J Surg Res. 184, 290-298 (2013).</li><li>Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).</li><li>Katz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+efficacy+of+adjuvant+cytosine-analogue+CS-682+in+a+fluorescent+orthotopic+model+of+human+pancreatic+cancer.">Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer.</a> Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).</li><li>Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein orthotoper murinen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs , die GFP zum Ausdruck bringt, so dass nicht-invasive Überwachung des Tumorwachstums unter Verwendung von ganzen Körper in vivo Fluoreszenz - Bildgebung (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht es, die Tumor - Entwicklung in Echtzeit (Abbildung 3) zu überwachen; es kann ein wichtiges Instrument für die Forscher, die therapeutische Wirksamkeit von neuen Wirkstoffen gegen Bauchspeicheldrüsenkrebs zu ...

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist mit einer erhöhten Frequenz im Vergleich zu anderen Krebsarten diagnostiziert und ist das 4. häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Ab dem Zeitpunkt der Diagnose, über 90% der Patienten sterben innerhalb von fünf Jahren 1,2. Derzeit ist die chirurgische Tumorentfernung die einzige Heilung für Bauchspeicheldrüsenkrebs, aber weniger als 20% der Patienten sind berechtigt , Chirurgie vor allem , weil zum Zeitpunkt der Diagnose zu unterziehen , die Krankheit in einem fortgeschrittenen Stadium und hat 3,4 metastasiert. Der Mangel an spezifischen Symptome macht Bauchspeicheldrüsenkrebs eine stille Krankheit; einige der Symptome sind Bauchschmerzen, Rückenschmerzen, Appetitlosigkeit, Gelbsucht und Übelkeit; die als gemeinsame Verdauungskrankheiten werden kann 4 leicht zu interpretieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, neue pharmakologische Werkzeuge zur Entwicklung in der Diagnose und Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu unterstützen. Die Verwendung von Tiermodellen ermöglicht es uns, die Biologie der Pancré zu verstehenatic Krebs und bietet einen Einblick in dieses Wissen auf den Menschen anzuwenden. Xenograft orthotoper Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs sind realistisch, da Tumoren im Ursprungsorgan 5 wachsen. Im Gegensatz zu heterotoper Modelle, in denen Zelllinien oder Tumorfragmente subkutan implantiert werden, ermöglicht orthotoper Modellierung für die Erholung der Tumor - Mikroumgebung und ahmt die Wechselwirkung von Tumorzellen mit ihrer Umgebung 6. Das Xenograftmodell hier beschrieben leitet Tumoren aus der menschlichen Pankreas-Krebszelllinie PANC-1-GFP, die gentechnisch verändert ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) zum Ausdruck bringen. GFP Detektion ermöglicht für eine nicht-invasive Abbildung und Überwachung von Tumorwachstum und Metastasierung 7. Tumorentwicklung erfolgt schnell, spontan und sehr ähnlich , dass von primären Tumoren des menschlichen Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs 8. Orthotope Modelle bieten eine genauere Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit in Reaktion auf therapeutische Mittel, währendNachahmen der Tumor-Mikroumgebung. Wie oben erwähnt, ermöglicht dieses Tiermodell Fluoreszenz Nachweis von Tumorwachstum und Metastasierung in Echtzeit. Fluoreszenznachweis ermöglicht eine direkte / Live-Bildgebung zu Lumineszenz verglichen. Mit Fluoreszenz ist das emittierte Licht das Ergebnis einer Anregung durch ein anderes Licht einer kürzeren Wellenlänge; wohingegen in Lumineszenz, ist das emittierte Licht das Ergebnis einer chemischen Reaktion und nicht starke Emission 9 aufweisen. Weiterhin ist ganzen Körper in vivo Fluoreszenzabbildung für das Tier nicht nachteilig und ermöglicht es den Forschern Tumorwachstum über die Zeit in Reaktion auf therapeutische Behandlungen zu überwachen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI media 1640&#160;</td>
			<td>Caisson Labs&#160;</td>
			<td>RPL03-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Ficher Sci</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel HC&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SutureVet PGA 6-0 PGA</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>39010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcare or Foamed Antiseptic Handrub</td>
			<td>Steris</td>
			<td>639680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dubelcco&#39;s Phosphate-Buffered saline)&#160;</td>
			<td>Thermo Ficher Sci</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe 27G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Blutler Schein</td>
			<td>50562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen&#160;</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, 5.5&#34;straight mayo&#160;</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>22-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 GFP cell line&#160;</td>
			<td>Anticancer, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Imaging System:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBOx Scientia, UVP :</td>
			<td>UVP, LLC&#160; Upland, CA.&#160;</td>
			<td colspan="2">Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent orthotopic mouse model of pancreatic cancer

Bauchspeicheldrüsenkrebs bleibt eine der Krebsarten, für die das Überleben verbessert hat sich nicht wesentlich in den letzten Jahrzehnten. Nur 7% der diagnostizierten Patienten werden länger als fünf Jahre überleben. Um die Mikroumgebung von Tumoren der Bauchspeicheldrüse zu verstehen und nachzuahmen, verwendeten wir einen murinen orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die in Echtzeit nicht-invasive Bildgebung von Tumorprogression ermöglicht. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen exprimieren , grün fluoreszierendes Protein (GFP PANC-1) wurden in Basalmembran - Matrix, hoher Konzentration, ausgesetzt (zB Matrigel HC) mit serumfreiem Medium und dann in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse durch Laparotomie injiziert. Die Zellsuspension in der hohen Konzentration Basalmembran-Matrix wird zu einer gelartigen Substanz, sobald es Raumtemperatur erreicht; daher geliert es, wenn es in Kontakt mit der Bauchspeicheldrüse kommt, um eine Dichtung an der Injektionsstelle zu schaffen und eine beliebige Zelle Auslaufen zu verhindern. Tumorwachstum und Metastasierung in andere Organe werden in lebenden wachtenTiere durch Fluoreszenz unter Verwendung. Es ist wichtig, die geeigneten Filter für die Anregung und Emission von GFP zu verwenden. Die Schritte für die orthotope Implantation sind in diesem Artikel beschrieben so Forscher leicht, das Verfahren in nackten Mäusen replizieren können. Die wesentlichen Schritte dieses Protokolls sind Herstellung der Zellsuspension, chirurgische Implantation, und der ganze Körper fluoreszierendes in vivo Bildgebung. Dieses orthotoper Modell ist entwickelt, um die Wirksamkeit neuer Therapeutika auf primären und metastatischen Tumoren zu untersuchen.

Dieses Verfahren beschreibt eine chirurgische orthotope Implantation von fluoreszierenden menschlichen Zellen Bauchspeicheldrüsenkrebs, bei der Herstellung der Zellsuspension zur Injektion, richtige Anästhesie für Nagetiere, Lieferung der Zellsuspension durch Laparotomie Fokussierung und die Verwendung von Fluoreszenz - in - vivo Kleintierbildgebung. Die Detektion eines grünen Fluoreszenzsignal (GFP - Signal) zwischen zwei und drei Wochen nach der Implantation, biet...

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

fluorescent-orthotopic-mouse-model-of-pancreatic-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K Aufrufe.  Western University of Health Sciences. A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here. 

Serie: Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Forschung

Krebsforschung

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and basic cancer researches. Generations of PDX models in traditional host mice are time-consuming and only working for a small proportion of samples. Recently, zebrafish PDX (zPDX) has emerged as a unique host system, with the characteristics of small-scale and high efficiency. Here, we describe an optimized methodology for generating a dual fluorescence-labeled tumor xenograft model for comparative chemotherapy assessment in zPDX models. Tumor cells and fibroblasts were enriched from freshly-harvested or frozen pancreatic cancer tissue at different culture conditions. Both cell groups were labeled by lentivirus expressing green or red fluorescent proteins, as well as an anti-apoptosis gene BCL2L1. The transfected cells were pre-mixed and co-injected into the 2 dpf larval zebrafish that were then bred in modified E3 medium at 32 &#176;C. The xenograft models were treated by chemotherapy drugs and/or BCL2L1 inhibitor, and the viabilities of both tumor cells and fibroblasts were investigated simultaneously. In summary, this protocol allows researchers to quickly generate a large amount of zPDX models with a heterogeneous tumor microenvironment and provides a longer observation window and a more precise quantitation in assessing the efficiency of drug candidates.

This protocol describes optimization procedures in a virus-based dual fluorescence-labeled tumor xenograft model using larval zebrafish as hosts. This heterogeneous xenograft model mimics the tissue composition of pancreatic cancer microenvironment in vivo and serves as a more precise tool for assessing drug responses in personalized zPDX (zebrafish patient-derived xenograft) models.

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

Kultur, Manipulation und orthotopische Transplantation von Mausblase Tumororganoiden

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...