Name: removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
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Wir danken Gary Laevsky für hilfreiche Diskussionen über die Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert gewährt R01GM061107 und R01GM067758 zu ERG

Hinweis: Das Verfahren für die Muskelentfernung (Abbildung 1) ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Verfahren für die Larven Filets vor. Die Schritte , die Muskelentfernung vorangehen und folgen , werden kurz skizziert und der Leser wird auf die bisherige Arbeit 10 bezeichnet, 11 für detailliertere Beschreibungen. 1. Dissect Larve in Cold Saline <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von kaltem HL3.1 Salz 15 oder kalt Ca 2+ -freien HL3.1 saline 11 (Tabelle 1). Legen Sie die Larve in einem Silikon-Elastomer-Schale mit gerade genug kaltem Salz den Boden der Schale zu bedecken. HINWEIS: Siehe Diskussion in Bezug auf die Wahl der Kochsalzlösung. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 Kochsalzlösung (pH 7,2) </td></tr><tr><td> 5 mM HEPES </td></tr><tr><td> 70 mM NaCl </td></tr><tr&gt; <td> 5 mM KCl </td></tr><tr><td> 1,5 mM CaCl 2 (weglassen für Ca 2+ -freien Salzlösung) </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 5 mM Trehalose </td></tr><tr><td> 115 mM Sucrose </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Filter zu sterilisieren und lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Hinweis: Zusammensetzung ahmt Insekten Hämolymphe </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Zusammensetzung des Kalten Saline. <ol start="2"><li> Positionieren Sie die Larve mit der Bauchseite nach oben. Die ventrale Oberfläche der Larven durch die Bauch Dentical Riemen und der Rückenseite durch die primären Larven Trachealtuben von anterior nach posterior verlauf identifiziert werden. Dehnen Sie die Larve in der anterior-posterioren Richtung und stecken den Kopf und den Schwanz einSiliconelastomerschale mit Insektenstifte sezieren. Verwenden Sie feine Präparierscheren entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, die an einem Ende beginnen und Fortschritte in Richtung auf die andere. HINWEIS: Diese Ausrichtung bewahrt die häufigsten studierte dorsalen Cluster von da Neuronen. </li><li> Nachdem die Larve aufgeschnitten wird, an die Sezieren Gericht die vier Ecken stecken, als ob ein Buch zu öffnen. Verwenden einer Pinzette zu greifen und entfernen Sie die inneren Organe einschließlich des ZNS, Darm und Luftröhre. Stellen Sie Insektenstifte, so dass das Filet ist straff, aber nicht maximal gestreckt. HINWEIS: Die Muskeln werden auf Segmentgrenzen an der Körperwand verankert. Obwohl Muskeln die meisten der Körperwand bedecken, sind sie in einem engen Bereich in der Nähe der Rückenmittellinie fehlt. </li></ol> 2. Muskelentfernung <ol><li> Suchen Sie die Rückenmittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt. Positionieren Sie eine einzelne Zange Zinke so dass es unter dem Muskelgewebe in der flachste mögliche Ausrichtung eingefügt werden. </li><li> Beginnt umder Rückenmittellinie in der Nähe der vorderen Begrenzung des Segments gleitet vorsichtig die Zange Zinke zwischen dem Muskel und der Epidermis, wobei darauf geachtet Kontakt zwischen der Zange und der Epidermis zu minimieren. </li><li> Ziehen Sie die Zange nach oben die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Hemi-Segment (e) von Interesse. HINWEIS: Dieses Protokoll Erhaltung des hinteren jedes da Neuron Dendriten Bereich optimiert. Um den vorderen Teil des Dendriten Feld zu erhalten, ist es am besten, die Zange Zinke am hinteren Ende jedes Segments einzufügen. </li><li> Nachjustieren Insektenstifte, so dass die Larven Filet maximal in alle Richtungen gedehnt wird. </li><li> Befestigen Sie das Filet, während es noch auf dem Sezieren Schüssel mit kaltem, frisch zubereiteten 4% Formaldehyd in PBS für 25 min fixiert ist. </li><li> Spülen Sie 5-mal in PBS. </li><li> Verwenden einer Pinzette vorsichtig Muskelgewebe von den übrigen Ankerpunkte ziehen weg, wobei darauf geachtet Conta zu minimierenct mit der Epidermis. </li><li> Loslösen und entfernen Sie das Filet vom Sezieren Schale in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie alle nachfolgenden Waschen, Sperrung und Immunfluoreszenzanfärbung Schritte, wie zuvor 11 beschrieben. </li></ol> 3. Montieren Sie den Larval Fillet <ol><li> Entfernen Sie zuerst den Kopf und Schwanz mit feinen Präparierschere, um die Probe so flach wie möglich zu machen. Montieren Sie das Filet auf einem Deckglas in Antifade mountant mit der inneren Oberfläche des Filets das Deckglas gegenüber. </li><li> Platzieren Sie einen Objektträger auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig die Montage Medium zu dispergieren. Klappen Sie den Mikroskop-Objektträger über und versiegeln Sie das Deckglas auf dem Objektträger mit Nagellack. Objektträger für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol>

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	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier ist ein Protokoll für die manuelle Entfernung von Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets beschrieben. Dieses Protokoll modifiziert vorher Larven- Dissektion Techniken beschrieben 10,11. Nachdem die Larven in einer Silikonelastomerschale zergliedert wird, wird der dorsalen Mittellinie befindet. Eine einzelne Zange Zinke, in seiner flachsten mögliche Ausrichtung, ist zwischen dem Muskelgewebe und der Epidermis, in der Nähe der Rückenmittellinie sorgfältig eingeführt. Die Zange gezogen san...

Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen bieten ein wertvolles Modell für die neuronale Entwicklung des Studiums aufgrund ihrer Zugänglichkeit für genetische Manipulation und die Leichtigkeit , mit der sie abgebildet werden kann. Diese sensorischen Neuronen wurden bei der Identifikation zahlreicher Wege instrumental die Dendriten Morphogenese 1-3 steuern. Vier Klassen von da Neuronen (Klasse I - IV) innervate die Larven Epidermis. Diese Neuronen liegen zwischen der Basalmembran der Epidermis und mit ihren Dendriten bilden weitgehend zweidimensionale Arrays 4,5. Von den vier Klassen, Klasse IV da Neuronen sich die hochverzweigten Lauben haben und, wie sensorische Neuronen von anderen Tieren, erfordert die Ausarbeitung dieser Dorne intrinsischen Faktoren sowie Hinweise aus benachbarten Geweben, insbesondere die Epidermis, für ihre Entwicklung 6-9 . Studien, um festzustellen, wie solche neuronale und extra neuronale Tatsacheors steuern Dendriten Morphogenese Nutzen aus der Fähigkeit , die Proteinexpression in situ durch Immunfluoreszenz nachzuweisen. Die äußere Kutikula der Larve ist undurchdringlich für Antikörper, aber dieses Hindernis wird durch die Herstellung von Larven Filets durch gut etablierte Dissektion Methoden 10,11 leicht zu überwinden. Allerdings stellt die Körperwand Muskelgewebe, die gerade Inneren der Basalmembran liegt einige Herausforderungen zu Visualisierung von da Neuronen und epidermalen Zellen. Erstens, das Muskelgewebe, welche Linien die meisten der Körperwand, verschleiert stark fluoreszierende Signale von neuronalen oder epidermale Gewebe ausgeht. Dies reduziert erheblich das Signal-Rausch-Verhältnis in der Probe. Zweitens sind viele relevante Proteine ​​werden in das Muskelgewebe sowie in den Neuronen oder Epidermis exprimiert wird. Dieser Muskel abstammenden Fluoreszenzsignal wird weiter zu verdunkeln Erfassung eines Fluoreszenzsignals von dem Neuron oder Epidermis wahrscheinlich. Schließlich Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien keinew Genehmigung Bildgebung von Proben , die bei Unterbeugungs Auflösung und kann besonders hilfreich bei der Lokalisierung von Proteinen anspruchsvolle , die in Neuronen und die umliegenden Zellen der Epidermis 12,13 exprimiert werden. Allerdings Bildgebung mittels superauflösende Mikroskopie profitiert von einem starken Signal-Rausch-Verhältnis und die Nähe der Probe auf dem Deckglas. Zusätzlich zu dem Signal-Rausch-Verhältnis zu reduzieren, die Larvenkörperwand Muskel Abstände da Neuronen aus dem Deckglas, wodurch die verbesserte Bildauflösung zu begrenzen, die mit Superauflösungsmikroskopieverfahren erreicht werden kann. Neben Herausforderungen für die Immunfluoreszenzanalyse, stellt das Muskelgewebe eine Barriere für die Aufnahme elektro von sensorischen Neuronen im Larvenkörperwand. Seine Entfernung profitiert daher neurophysiologischen Manipulation von sensorischen Neuronen 14. Hier ist ein Verfahren zur manuellen Entfernung von Drosophila Larve Muskelgewebe beschrieben. Wir zeigen, dass unser Protokoll permits Immunofluoreszenz Bildgebung von Proteinen, die sonst durch Muskelgewebe verdeckt, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis für die Visualisierung der Klasse IV da Neuronen und ermöglicht die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie zur besseren räumlichen Beziehungen von Proteinen und Zellstrukturen in da Neuronen unterscheiden und die Epidermis.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>for dissecting plates</td></tr><tr><td>Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 light source</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>for structured illumination microscopy</td></tr><tr><td>Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Coracle antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Mouse anti-Discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-dsRed antibody</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>dilute 1:500</td></tr></tbody></table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen sind ein beliebtes Modell für Mechanismen der neuronalen Morphogenese zu untersuchen. Da Neuronen entwickeln in Kommunikation mit den Epidermiszellen sie innervieren und so ihre Analyse Nutzen aus in situ Visualisierung beider neuronal und epidermal exprimierten Proteine durch Immunofluoreszenz. Traditionelle Methoden der Larven Filets für Immunofluoreszenz Experimente vorbereiten lassen das Muskelgewebe intakt, dass die meisten der Körperwand erstreckt, mehrere Herausforderungen zu meistern neuronalen und epidermalen Proteine ​​Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets entfernen. Dieses Protokoll ermöglicht die Abbildung von Proteinen, die ansonsten durch Muskelgewebe verdeckt sind, verbessert die Signal-Rausch-Verhältnis, und erleichtert die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie DA-Neuronenentwicklung zu untersuchen.

Wir zeigen den Nutzen des Muskels Entfernungsprozedur für das Signal-Rausch-Verhältnis in Immunofluoreszenz Experimente Verbesserung der septate Junction-Proteine ​​Coracle (Cora) und Disketten-large (DLG) zusammen mit der Klasse IV da Neuronen mit der Membran Marker markiert zusammen visualisieren CD4- tdTomato. Cora wurde bisher verwendeten Flächen zu identifizieren , wo DA Neuron Dendriten von epidermalen Zellen eingeschlossen sind , und ist eine vo...

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Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

8.9K Aufrufe.  Princeton University.  Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert. 

Serie: Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Forschung

Neurowissenschaften

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetik

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Biologie

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

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Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila Larven NMJ Dissection

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks