Das Protokoll erleichtert die Zerlegung des GFP-markierten indirekten Flugmuskels von Drosophila zu verschiedenen Zeitpunkten während der Pupae-Entwicklung, um Veränderungen der Gen- und Proteinexpression zu bewerten. Mit diesen Techniken kann eine hoch angereicherte Flugmuskelprobe mit minimalem RNA-Proteinabbau erreicht werden, die für RT-PCR-, Western Blot- oder omic-Ansätze geeignet ist. Diese speziellen Abschnitte erfordern Übung und Geschicklichkeit, aber die Anzahl der Pupas, die seziert werden können und die Qualität der Proben verbessern sich mit der Erfahrung.
Die visuelle Demonstration dieser Zerlegung ist entscheidend für die Bestimmung, wie Flugmuskeln von nicht-muskelbem Geweben unterschieden werden können und was die schnelle Isolierung der Flugmuskulatur von Pupalproben erleichtert. Um die Pupae zu inszenieren, verwenden Sie einen nassen Pinsel, um Pre-Pupae zu sammeln und in eine 60-Millimeter-Petrischale zu übertragen, und die Pupae unter einem binokularen Mikroskop zu sexen. Männchen werden durch das Vorhandensein von Hoden identifiziert, die als durchscheinende Kugeln auf den ansonsten undurchsichtigen Pupas erscheinen.
Nachdem Sie das Gericht mit der Uhrzeit, dem Datum und dem Genotyp der Fliegen gekennzeichnet haben, altern Sie die Pupae in einem 25 bis 27 Grad Celsius Inkubator bis zum entsprechenden Stadium. Für die IFM-Sektion vor 48 H APF verwenden Sie einen benetzten Pinsel, um die entsprechend inszenierten Pupae auf eine schwarze Sezierschale zu übertragen, die etwa 2/3 mit gekühltem PBS gefüllt ist. Unter dem fluoreszierenden Sezieren mikroskop, verwenden Sie eine 5 Zange, um eine der Pupae auf den Boden der schwarzen Sezieren Schale zu drücken.
Passen Sie den Mikroskopzoom und -fokus an, bis die Welpen klar visualisiert werden können. Mit einem Paar Zange, um das Vorderteil der Pupae zu greifen, schlagen Sie die Pupae mit einer einzigen Spitze eines zweiten Paares von Zangen, leicht aus der Mitte im Bauch, direkt hinter dem Thorax. Verwenden Sie das erste Paar Zangen, um die vordere Hälfte des Pupal-Gehäuses zu entfernen, und um die exponierten Pupilben direkt hinter dem Thorax zu kneifen, um den Bauch vom Thorax zu trennen.
Als nächstes drücken Sie vorsichtig den vorderen Teil des Thorax, um die fluoreszierend beschrifteten IFMs freizulegen. Verwenden Sie dann die Zange, um den verbleibenden Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Schale zu werfen, und sezieren Sie die nachfolgenden Welpen auf die gleiche Weise. Wenn alle Pupas seziert wurden, verwenden Sie die Zange, um die IFM-Fasern zu sammeln, und organisieren Sie die Fasern in einem Stapel am Boden der schwarzen Sezierenschale.
Verwenden Sie die Zange, um Schmutz aus dem Sichtfeld zu schieben, und entfernen Sie alle Nicht-IFM-Muskeln, Fett, Nagelhaut oder anderes unerwünschtes Gewebe aus den Proben. Verwenden Sie dann eine abgeschnittene Pipettenspitze, um den Stapel von IFMs in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 250 Mikroliter gekühlten PBS zu übertragen. Für die IFM-Sektion nach 48 H APF, verwenden Sie einen leicht benetzten Pinsel, um die inszenierten Pupae auf einen Streifen aus doppelseitigem Klebeband zu übertragen, das auf einem Mikroskopschlitten montiert ist.
Richten Sie die Pupae in einer Linie, ventrale Seite nach unten und vorderin an der Unterseite der Folie aus. Wenn alle Pupillen platziert sind, verwenden Sie Zangen, um auseinander zu necken und öffnen Sie das erste Pupal-Gehäuse über den vorderen Spiracles, und schieben Sie sanft ein Paar Zangen dorsal, in Richtung des Hinterteils, schneiden Sie das Pupal-Gehäuse, während sich die Zangen bewegen. Befreien Sie die Pupae aus dem geöffneten Gehäuse und übertragen Sie die Pupae sofort auf einen Tropfen PBS auf einem zweiten Mikroskopschlitten.
Wenn alle Pupas befreit sind, verwenden Sie eine feine Schere, um den Bauch der Pupae vom Thorax wegzuschneiden, und schieben Sie den Bauch in einen separaten Haufen. Wenn alle Thoraxen entfernt wurden, verwenden Sie ein Stück Tissuepapier, um den Großteil der PBS und den Haufen Von Bauch zu entfernen. Fügen Sie einen Tropfen frische, gekühlte PBS zu den verbleibenden Thoraxen, bevor Sie die Schere verwenden, um vom Kopf entlang der Längskörperachse in einer einzigen Bewegung zu schneiden, um den Thorax in der Hälfte zu teilen.
Wenn alle Pupas seziert wurden, verwenden Sie die 5 Zangen, um eine der Halbsektionen auszuwählen, und legen Sie vorsichtig die Spitzen einer Zange über und unter der Mitte der IFMs ein. Halten Sie das erste Zangenpaar still, verwenden Sie eine feine Schere, um ein Ende des IFM von der Nagelhaut und den Sehnen wegzuschneiden, bevor Sie die Pupae um 180 Grad drehen, damit das andere Ende des IFM frei von Derhaut und Sehnen geschnitten werden kann. Verwenden Sie Zangen, um das IFM-Bundle vom Thorax an den Rand der PBS-Blase zu übertragen, indem Sie Wasserspannung verwenden, um das Bündel an Ort und Stelle zu halten.
Dann schieben Sie den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Rutsche, und sezieren Sie den Rest der IFMs auf die gleiche Weise. Wenn alle IFMs gesammelt wurden, verwenden Sie die 5 Zangen, um alle Sprungmuskel- oder Nagelhautfragmente zu entfernen, die ihren Weg in die Proben gefunden haben könnten. Verwenden Sie dann die Wasserspannung, um die sezierten IFMs zwischen einem Zangenpaar sanft einzufangen, und legen Sie die IFMs in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 250 Mikroliter gekühlten PBS.
mRNA-Sequenzierungsdaten von BRUNO1 IR IFMs zeigen Veränderungen der Expression auf der Geneinheitsebene im Vergleich zu Wildtyp-Sequenzierungsdaten. Mit Der Gesamten Proteom-Massenspektrometrie an sezierten IFMs wird eine ähnliche Regulation auf den Protein- und Proteinisoformspiegel beobachtet. Nach dem Einsetzen einer Proteinfalleinlinie in das endgültige Intron von Mhc kann die Aufnahme des GFP-markierten Proteins in IFM als zwei Punkte auf beiden Seiten der M-Linie bei 90 H APF beobachtet werden, während im Beinmuskelgewebe das GFP-Signal gleichmäßig über die Sarkome M-Linie beobachtet werden kann.
Bei Verwendung von RT-PCR auf seziertem IFM kann ein Mhc-Isoformschalter vom GFP-markierten exon 34- bis 37-Ereignis zum unbeschrifteten Exon-34-35-Ereignis zwischen 30 und 48 Stunden nach der Pupariumbildung bei 27 Grad Celsius nachgewiesen werden. Aus mRNA-Sequenzierungsdaten exprimieren Bein- und Sprungmuskelgewebe alle drei Mhc-Isoformen und erhalten so die Expression der GFP-markierten Isoform in reifen Muskeln. Sowohl Spalt-Hauptmutant als auch BRUNO1 IR-IFM konnten die Expression der GFP-markierten Mhc-Isoform bei ihrer Entwicklung nicht abschalten, was zu einem isoformen Expressionsprofil führte, das dem von Bein- und Sprungmuskelgewebe ähnelt.
Denken Sie daran, dass die Sezierungen in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden sollten, um den RNA-Abbau zu verhindern. Und darauf zu achten, die Kontamination durch andere Zelltypen zu begrenzen. Diese Methode erzeugt IFM-angereicherte Proben, die für biochemische Ansätze wie RT-PCR oder Western Blotting geeignet sind, sowie omic Style-Ansätze wie Massenspektrometrie, Hochdurchsatzsequenzierung, Chromatin-Konformierungsaufnahme und Metabolomik.
Diese Abschnitte können die leistungsstarken genetischen Ansätze in Drosophila mit Daten auf Systemebene ergänzen, um die grundlegenden Mechanismen der Entwicklung und Genregulation zu untersuchen.
