Name: an efficient method for the synthesis of peptoids with mixed lysine-type/arginine-type monomers and evaluation of their anti-leishmanial activity
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
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Wir danken der Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) für die finanzielle Unterstützung (HLB). Wir danken auch Sridevi Maalika Ramanoudjame für ihre Unterstützung während der Dreharbeiten zu diesem Verfahren.

1. Festphasensynthese von Peptoide HINWEIS: Peptoide werden manuell mit dem submonomeren Verfahren der Festphasen-Peptoid-Synthese synthetisiert. Dieses Verfahren ermöglicht eine hohe Kopplungseffizienz und gute Endprodukt Ausbeuten. Synthese an fester Phase ermöglicht auch überschüssigen Reaktanden am Ende jeder Stufe und das Verfahren modifiziert wurde hier leicht entfernt zu werden , um verschiedene funktionalisierte kationische Monomere (dh Arginin-Typ und Lysin-Typ - Reste) ermöglichen innerhalb desselben aufgenommen werden Sequenz. 1,2 <ol><li> Synthese eines linearen Peptoid Achtung: Führen Sie die Sicherheitsbeurteilungen vor der Synthese zu starten. Führen Sie alle Reaktionen in einem Abzug und tragen eine angemessene persönliche Schutzausrüstung geeignete (dh Einweg - Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel). Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die folgenden Reagenzien und Lösungsmittel. Dimethylformamid (DMF) ist ein Verdacht teratogen und dichloromethane (DCM) ist krebserregend. N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC) und Piperidin sind gefährlich für die Augen, die Haut, über den Atem Einatmen und kann zu Hautsensibilisierung führen. Hydrazin ist ein Verdacht, karzinogen, tödlich beim Einatmen und verursacht schwere Verbrennungen der Haut oder Augen. Bromessigsäure ist auch gefährlich für die Haut, die Augen und die Atemwege und kann zu Verbrennungen bei Kontakt verursachen. Trifluoressigsäure (TFA) ist eine flüchtige Flüssigkeit und verursachen schwere Verbrennungen so mit Sorgfalt zu behandeln. Schwerlast-Handschuhe empfohlen. <ol><li> Hinzufügen, 0,12 g Fmoc-geschütztem Rink-Amid-Harz (0,1 mmol, typische Beladung 0,7 mmol / g) zu einem verkappten 20 ml Polypropylen-Reaktionsgefäß mit zwei Fritten. 5 ml Dimethylformamid (DMF), um das Harz zu quellen und das Gefäß verlassen für mindestens 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Lassen Sie das DMF eine Festphasenextraktion Vakuum-Plattform. </li><li> Um die Fmoc-Gruppe auf die geschwollene Harz entschützen, 2 ml Piperidin-Lösung (20% in DMF v / v). Das Gefäß wird aufeine Schütteltablar bei Raumtemperatur (450 Umdrehungen pro Minute) und 5 min schütteln. Entfernen Sie die Lösung über Vakuumstation. <ol><li> Wiederholen Fmoc-Abspaltung mit 2 ml Piperidin-Lösung und schütteln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Lassen Sie nach wie vor die Lösung. </li></ol></li><li> Das Harz wird durch Zugabe von 2 ml DMF und Mischen des Harzes für 30 sec. Lassen Sie das DMF und wiederholen Sie drei weitere Male. </li><li> Für die Acetylierung 1 ml Bromessigsäure - Lösung (0,6 M in DMF) und 0,2 ml N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide Lösung (DIC, 50% in DMF v / v). Verlassen Reaktionsgefäß für 20 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. </li><li> Für die Verschiebung, 1 ml Aminlösung (1,5 M in DMF). Schütteln, um das Harz für 60 min bei Raumtemperatur. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. <ol><li> Um einen Arginin-Monomer hinzuzufügen, folgen Schritt 1.7. Je nach der gewünschten Peptoid-Sequenz, verschiedene Aminewird hinzugefügt werden. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5. </li><li> Um ein Guanidin funktionalisierten Monomer umfassen (dh, N Arg), 1 ml ungeschützter Diamin - Lösung (1,5 M in DMF) zu dem Harz und schütteln für 60 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. </li><li> In 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol in 0,5 ml DMF, 10 Äquivalente) die Dde-Gruppe an das freie primäre Amin zu addieren und für 60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. </li></ol></li><li> Weiterhin Submonomer-Synthese, wie in 1.1.4 bis 1.1.7, bis die gewünschte Sequenz hergestellt wird. 2 ml DMF, das Harz zu waschen und dreimal wiederholen. </li><li> Um die Dde-Gruppe auf Harz entschützen, 4 ml 2% Hydrazin-Lösung (in DMF v / v) und schütteln Sie für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lösung und dreimal wiederholen. </li><li> Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF drei times. </li><li> Hinzufügen , Pyrazol-1-carboxamidin (6 Äquivalente pro freie Amin, das heißt pro N Arg Monomeren, in dem minimalen Volumen an DMF) und N, N - Diisopropylethylamin oder DIPEA (6 Äquivalente pro freies Amin) und schüttle bei Raumtemperatur für 60 min . </li><li> Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml Dichlormethan dreimal. Lassen Sie das Harz in Luft für 10 Minuten, um zu trocknen, dann kann das Harz bis Spaltung (Abschnitt 2) gespeichert werden. </li><li> Um die Synthese pausieren, waschen Sie das Harz mit 2 ml DMF dreimal. 2 ml DMF, Stopfen der Synthesebehälter und lassen bei Raumtemperatur in einem Abzug. HINWEIS: Die Synthese angehalten werden kann, nachdem eine Verschiebung Schritt (mit Ausnahme des zweiten Verschiebungsschritt als Diketopiperazinen gebildet werden). </li></ol></li><li> Sidechain - Entschützung und Abspaltung vom Harz <ol><li> Verpflichten einen Test spalten den Fortschritt der Synthese (Reinheit und Masse) an jedem beliebigen Punkt während der Synthese nach dem displa zu überprüfenZement Schritte, Addition oder Entfernung von Dde-Schutzgruppe oder nach der letzten Sequenz gemacht wurden. <ol><li> Übertragen etwa 10 Harzperlen aus dem Reaktionsgefäß in eine neue 8 ml Polypropylen-Fritte Patrone. </li><li> 1 ml Trifluoressigsäure Spaltung Cocktail (mit 95% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% Triisopropylsilan) und schütteln Sie für 90 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Filtriere den TFA Spaltungscocktail aus dem Harz unter Verwendung des Frittenreaktionsgefäß in einen 10 ml-Rundkolben. </li><li> Man dampft die Spaltung Cocktail am Rotationsverdampfer abgeblasen, und der sich ergebende Öl in 1 ml Acetonitril / Wasser zur Vorlage bei LC-MS oder analytische HPLC. </li></ol></li><li> Für die endgültige Spaltung: in der gleichen Fritten Polypropylen - Reaktionspatrone für die Synthese verwendet, 4 ml TFA - Spaltung Cocktail (95% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% Triisopropylsilan) und das Gefäß bedecken. Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur. </li><li> Filter the TFA Spaltungscocktail aus dem Harz, das das Frittenreaktionsgefäß in einen 50 ml Rundkolben werden. </li><li> Dampfe das Spaltungscocktail mit einem Rotationsverdampfer. Nachdem die TFA entfernt wurde, sollte das Produkt als Öl erhalten werden. Zur Unterstützung der TFA Entfernung aus diesem Rohöl, 2 ml wasserfreiem Diethylether und die Peptoid sollte auszufällen. <ol><li> Entweder die Diethylether über eine Pipette entfernen und zu entsorgen oder einem Rotationsverdampfer verdampft werden. Wiederholen Diethylether Fällung dreimal. </li></ol></li><li> Man löst das rohe Peptoid in 10 ml Acetonitril / Wasser-Lösung angesäuert (50% Acetonitril, 0,1% TFA in Wasser v / v). In Behälter vorgewogen, bei 20 ° C einfrieren und lyophilisieren zu einem trockenen Pulver. </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung und Aufreinigung HINWEIS: Die Peptoid-Synthese kann überwacht werden und die endgültige Peptoid über analytische Umkehrphasen-HPLC beurteilt unter Verwendung einer C18-Säule und electrospray Flüssig-Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Alle HPLC-Lösungsmittel von Lösungsmitteln für die LC-MS sollte frisch zubereitet werden. <ol><li> analytische HPLC <ol><li> Wiegen 1 mg Peptoid in einem kleinen Glasfläschchen. Fügen Sie das Mindestvolumen von Acetonitril zu lösen und auf 1 ml mit Wasser verdünnen. Stellen Sie sicher, dass die Peptoid vollständig gelöst hat. </li><li> Einzuspritzen 10 ul einer analytischen HPLC (vorgeschlagen Gradient 0 bis 100% Lösungsmittel B über 30 min, wobei Lösungsmittel A = 95% Wasser, 5% Acetonitril, 0,05% TFA und Lösungsmittel B = 95% Acetonitril, 5% Wasser, 0,03% TFA) , gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Visualisieren bei 220 nm UV-Spektrum. </li></ol></li><li> ESI LC-MS <ol><li> Auffüllen auf 1 mg / ml Peptoid-Lösung, wie in Schritt 2.1.1. </li><li> Injizieren 1 ul LC-MS Elektrosprühverfahren wenn das Molekulargewicht des Ziel Peptoid zu bestimmen, vorhanden ist, den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Überprüfen Sie die Zielmasse der Peptoid-Sequenz eine Pept mitoid Rechner, gemäß den Anweisungen auf dem Rechner. 26 Dieses Web - Dienstprogramm ermöglicht auch die Zuordnung einer Streichung / Zusatzprodukte im Massenspektrum zu sehen. 26 </li></ol></li><li> Präparative Umkehrphasen - HPLC <ol><li> Auflösen rohe Peptoide in 2 ml angesäuertem Wasser / Acetonitril (95% Wasser, 5% MeCN, 0,1% TFA) und Reinigung durch präparative RP-HPLC unter Verwendung des Protokolls Herstellers. Bestimmen Sie die Steigung durch die Elutionszeit von analytischen HPLC und die erhaltene Menge injiziert wird von den Säulendimensionen ab. </li><li> Visualisieren Sie einen Detektor eingestellt bei 220 nm verwendet wird. </li><li> Sammle Fraktionen in 15 ml-Zentrifugenröhrchen bei 20 ° C und lyophilisiere einzufrieren. </li><li> Re-Analyse von Fraktionen mittels LC-MS und analytische HPLC nach dem Protokoll des Herstellers. Rekombinieren gereinigten Fraktionen. </li></ol></li></ol> 3. Biologische Testung gegen Leishmania mexicana Parasites Caution. Die Sicherheitsbewertungen vor Beginn der Synthese durchgeführt werden muss Leishmania mexicana ist eine Gefahr für die Gruppe 2 Erreger in Großbritannien und angemessene Kontrollmaßnahmen klassifiziert vor vorhanden sein müssen Tests beginnen. Alle Arbeiten müssen entsprechend getragen in einer Klasse 2 MSW und angemessene persönliche Schutzausrüstung durchgeführt werden (dh, Nitril Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel). <ol><li> Subculture von Parasiten <ol><li> Defrost 1 ml -150 ° C eingefroren Lager Leishmania mexicana M379 von Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 Sekunden platzieren. </li><li> Übertragung der Stammlösung zu 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 7,0 , supplementiert mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in einem 25 cm 3 Zellkulturkolben , der mit einem nicht belüftete Kappe. </li><li> 72 h bei 26 ° C inkubieren. </li><li> Untersuchen Sie Parasiten unter dem Mikroskop (400-facher Vergrößerung) Zustand zu überprüfen. they sollte mit vielen teilender Zellen in der log-Phase Insektenstadium Promastigoten, prozyklischen Formen sein. </li><li> Pflegen procyclischen Promastigoten durch Subkultivierung Parasiten zu einer Konzentration von 5 x 10 5 Parasiten / ml alle drei Tage. Zählen von Zellen eine Neubauer verbesserten Zählkammer. </li></ol></li><li> Die Transformation von L. mexicana Insekten Stadium in Säuger Stadium axenic amastigote Form 27 <ol><li> Tag 0: Vorbereiten 10 ml Kultur von log Stadium - Parasiten bei 5 x 10 5 Parasiten / ml in Schneider-Insektenmedium (bei pH 7,0 , supplementiert mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in einem 25 cm 3 Zell Kulturflasche mit einem nicht-Filtrierkappe. </li><li> für 48 Stunden bei 26 ° C inkubieren. </li><li> Tag 3: Transfer 10 ml Kultur in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 447 xg für 5 min. </li><li> Gießen alte Medium ab und gibt 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 5,5, ergänzt mit 20% hessen-inaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin). Vorsichtig das Pellet von Parasiten in dem neuen Medium mit einer Pipette. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Parasiten eine Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnt auf eine Konzentration von 5 x 10 5 Parasiten / ml mit pH 5,5 Medium und in einen 25 cm 3 Zellkulturflasche. </li><li> für etwa 6 Tage bei 26 ° C inkubieren. </li><li> Tag 9: Untersuchen Parasiten unter dem Mikroskop (400X). Sie sollten in der nicht-replizierenden, infektiöse metazyklisch promastigote Bühne. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Parasiten eine Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnt auf eine Konzentration von 5 x 10 5 Parasiten / ml mit pH 5,5 Medium. </li><li> Entfernen 10 ml der Zellkultur und Transfer in Zellkulturflasche. 5 Tage bei 32 ° C inkubieren. </li><li> Tag 14: Überprüfen Auftreten von Parasiten unter dem Mikroskop (400X). Sie sollten in der pathogenen amastigote Stufe sein, die Geissel Charakter fehltistisch von Promastigoten und bereit für den Test. </li></ol></li><li> Zytotoxizitätstest auf L. mexicana axenic Amastigoten. HINWEIS: Die biologische Prüfung der Peptoide verwendet Hochdurchsatz-Assays in 96-Well-Platten durchgeführt. Dieses Protokoll beschreibt das Testen von L. mexicana axenic Amastigoten, aber identische Assays können auch auf die Promastigoten Stadium - Parasiten in geeigneten Medien durchgeführt werden. 60 min 100 uM und anschließend 24 Stunden nach einer 10-fachen Verdünnung inkubiert - Verbindungen werden mit Parasiten in Konzentrationen von 3 inkubiert. Die Ergebnisse werden durch Messen der Fluoreszenz der Vertiefungen nach der Inkubation mit Resazurin-basierte Zellebensfähigkeit Lösung (zB alamarBlue) gewonnen. <ol><li> Bereiten Verbindung Stammlösungen. Abwiegen 1 mg des endgültigen gereinigten Peptoid Produkt einer Analysenwaage verwenden. Fügen Sie den entsprechenden Volumen der Molekularbiologie Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mM. Machen Sie 6 ul Aliquots undeinfrieren bei -20 ° C. </li><li> Herstellung der Verbindung Lösungen auf 96 - Well - Platten (eine empfohlene Plattenlayout in den Ergebnisteil zu sehen ist, Figur 6) in dreifacher Ausfertigung 100-3 uM. In 2 ul 5 mM Stammlösung jeder Verbindung in der oberen Reihe (dh A). In 48 ul frisch Schneiders Insektenmedium (bei pH 5,5 und 20% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin (P / S)) nach oben Reihe einen Mehrkanal-Pipette. In 25 ul Schneider-Insektenmedium für alle anderen Reihen (B - F). <ol><li> Führen Sie eine serielle Verdünnung durch Pipettieren von 25 ul Lösung aus der oberen Reihe. In der Zeile unterhalb und mischen. Führen Sie Verdünnungen bis zur letzten Zeile, wo die letzten 25 ul-Lösung verworfen werden sollte. </li><li> Verwenden Amphotericin B (5 mM Bestände) als positive Kontrolle und DMSO (2% ige Lösung) als negative Kontrolle in dreifacher Ausführung. </li></ol></li><li> Bereiten Parasiten Lösung: Kultur in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei447 × g für 5 min. Gießen Sie alte Medium und 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 5,5 und 20% FBS, 1% P / S). </li><li> Vorsichtig lösen sich die Pellets von Parasiten in dem neuen Medium mit einer Pipette und rechnen mit einem Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnte Kultur bis 8 x 10 &amp; sup6 ; Parasiten / ml. </li><li> In 25 ul L. mexicana Kultur in jede Kammer . Inkubieren Platten für 60 min bei 32 ° C. </li><li> Entfernen Platte aus dem Inkubator und entfernen Sie aus jeder Vertiefung 40 ul-Lösung. </li><li> In 90 ul frisches Medium und Inkubation für 24 Stunden bei 32 ° C. </li><li> In 10 ul Resazurin-basierte Lösung die Lebensfähigkeit der Zellen zu jeder Vertiefung. bei 32 ° C für 4 Stunden inkubiert. </li><li> Messen Sie die Fluoreszenz einen Plattenleser (λ ex = 540 nm, λ em = 600 nm), als den Anweisungen des Herstellers. Analysieren von Daten durch die durchschnittliche Entfernung Hintergrund (von Medium nur Wells) und Vergleichen der Fluoreszenz von Brunnen nach der Normalisierung in Bezug auf ter DMSO-Kontrollen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Peptoide werden zunehmend in der chemischen Biologie und der medizinischen Chemie Felder in Anwendungen wie neuartige Therapeutika untersucht 3-5, Zellabgabemittel 18,20 und Diagnose - Tools. 29 Typischerweise sind diese Sequenzen sind kationische eine gewisse Selektivität für den Krankheitserreger zu schaffen über Säugetierzellen, die Fähigkeit, durch Zellmembranen zu durchdringen und auch die Löslichkeit in wässrigen Systemen unterstützen. Es gibt zahlreiche Beispiele von kationischen Peptoide, die ausschließlich Lysin- oder Arginin-mimetische Reste in der Literatur enthalten. Jedoch bisher die Synthese von Peptoiden, die beide dieser kationischen Reste in der gleichen Sequenz enthalten wurde durch den Mangel eines geeigneten Syntheseverfahren behindert. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht gemischte kationische Peptoide in einer effizienten Weise zu synthetisierenden und ist sehr wünschenswert, da sie einen Weg bietet, die biologischen und chemischen Eigenschaften der amphipathischen Peptoide zu modulieren. nt &quot;&gt; Unser Verfahren verwendet eine Anpassung an die Submonomer Peptoid-Synthese allgemein verwendet und ermöglicht die Zugabe beider Lysin- und Arginin-Monomeren innerhalb der gleichen Sequenz. Es verwendet Kopplungen Raumtemperatur und etablierten Schutzgruppenchemie so ist es, dass dieses Verfahren zu erwarten ist eine Vielzahl von Diaminen kann, wird für die meisten Forschungsgruppen nützlich sein. Um orthogonale Schutz für die Arginin-Typ-Rest hinzufügen, wird ein ungeschützter Diamin unter Standardverdrängungsbedingungen gegeben und dann in einem 60-Minuten-Kupplung mit Dde-OH geschützt. sein verwendet , die jeweils Seitenketten von 2 Kohlenstoffatomen bis 6 Kohlenstoffe lang installiert werden, das heißt, 1,2-Diaminoethan zu 1,6-Diaminohexan werden können. Die Schutz Dde-OH löst sich gut in DMF und ist eine sehr effiziente und selektive Schutzgruppe für primäre Amine. die Dde-Schutzgruppe verlässt sekundären Aminen nicht betroffen, zum Beispiel die ungeschützten N - Terminus von Peptoid - Kette. 30 Eine Einschränkung besteht darin , dass die syn alleArbeit wurde manuell durchgeführt werden; jedoch wird erwartet, daß die Kopplungsbedingungen entwickelt das Verfahren zugänglich für die Verwendung mit automatisierten Peptid / Peptoid Synthesizern machen. Die auf Harz Entschützung der Dde-Gruppen wird mit einer 2% Hydrazin-Lösung in DMF durchgeführt, um freie Amine lassen, die auf Harz unter Verwendung von Pyrazol-1-carboxamidine guanidinylated werden kann. Sechs Äquivalente des Pyrazol-1-carboxamidine und sechs Äquivalenten DIPEA pro freie Amin auf dem Harz verwendet werden (dh sechs Äquivalente für jedes N Arg Monomer installiert werden). Wiederum ist diese Reaktion auch effizient und die Pyrazol-1-carboxamidin Reagenz eine gute Löslichkeit in DMF hat. Beendigung der Reaktion wird in der Regel über LC-MS nach 60 Minuten bei Raumtemperatur angesehen. Aufgrund der Vielseitigkeit der Submonomer-Verfahren kann eine Vielzahl von primären Aminen in der Verdrängungsstufe verwendet werden, so können die Bedingungen benötigen, zu erhöhen Kupplungs effi optimiert werdenzienz und die allgemeine Produktausbeuten oder Reinheit. 31 für die Sequenzen oben diskutiert wurde , waren keine besonderen Voraussetzungen für eine erfolgreiche Kupplungen. Allerdings könnten längere Verschiebung Zeiten oder höhere Aminkonzentrationen für problematische Verschiebungen verwendet werden (dh für schlecht nukleophilen oder sperriger Amine). Manche Amine können nicht vollständig löslich in DMF, in diesem Fall ist es empfehlenswert, diese in N - Methyl-2-pyrrolidon (NMP) oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel für Festphasenreaktionen statt , wie in einem vorhergehenden umfassende Methode zur Synthese Submonomer aufzulösen von Peptoiden. 32 einzuarbeiten Monomere , die ungeschützte Heteroatome in den Seitenketten, Acetylierung unter Verwendung von Chloressigsäure enthalten , wurde von anderen Gruppen als wirksam erwiesen. 33 Zusätzlich können andere Harze , die mit diesem Verfahren verwendet werden können Peptoide mit unterschiedlichen C - terminalen Funktionalisierung zu ergeben. Wang-Harze und 2-Chlortritylchlorid-Harze werden in die routinemäßig verwendetsubmonomeren Synthese von Peptoide. Beispielsweise wurde dieses Verfahren erfolgreich mit 2-Chlortritylchlorid - Harz , in unsere Gruppe verwendet. 2 verschiedene feste Träger wird eine andere Ladevorgang erfordern Rinkamid hier diskutiert (abhängig von der spezifischen verwendeten Harzes) , so sollte dies mit der Literatur überprüft werden , vor der Synthese. Ähnlich wie die Peptidsynthese, die Bedingungen für die abschließende Abspaltung der Peptoid-off-Harz kann auch für die spezifische Sequenz optimiert werden. In diesem Protokoll wurde ein TFA Spaltungscocktail (mit Triisopropylsilan und Wasser als Fänger) verwendet. Die Peptoide hier vorgestellten enthielt nur Boc-Schutz, die eine einigermaßen säurelabile Gruppe ist. Um eine vollständige Entfernung der Schutzgruppen von Sequenzen mit einem größeren Anteil von Schutzresten oder weniger säurelabilen Schutzgruppen, längere Spaltungszeiten erforderlich sein können (dh Spaltungszeiten von mehr als 2 Stunden werden für Sequenzen empfohlen, Pbf oder tertiär-bu enthaltentyl Ester geschützten Gruppen). Alternative Fängern kann auch für spezielle Seitenketten verwendet werden (beispielsweise Ethandithiol oder 2-Mercaptoethanol häufig in Peptiden verwendet werden, die schwefelhaltige Seitenketten wie Cystein oder Methionin). Der biologische Test vorgestellt, ist ein Standard-Zytotoxizitätstest, die verändert werden können, verschiedene Zelllinien anpassen. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder 96-Well-Platte ausreichende Kontrollen das Vertrauen in die erzielten Ergebnisse zu ermöglichen, enthalten sollte. In diesem Fall wird Amphotericin B als positive Kontrolle verwendet, da es ein bekanntes Medikament verwendet wird, um die Krankheit zu behandeln und DMSO wird als negative Kontrolle verwendet, da dies das Lösungsmittel, um Verbindung Bestände für den Assay verwendet wird. Wenn andere Zelllinien verwendet werden, alternative, sollten geeignete Kontrollen erhalten und vor Gebrauch validiert werden. L. mexicana ist mit dem Peptoid bei Konzentrationen zwischen 100 und 2 &amp; mgr; M für eine Stunde inkubiert und dann der Parasit / Peptoid - Lösung wird verdünnt , indemein Faktor von zehn für die Inkubation über Nacht (dh Brunnen zunächst mit 100 &amp; mgr; M Peptoid Lager sind auf 10 uM verdünnt). Die Lebensfähigkeit der Zellen Reagens wird am Ende des Tests in jede Vertiefung (10% der Gesamtvertiefungsvolumen) zugegeben. Eine sichtbare Farbänderung wird zwischen Brunnen mit lebensfähigen Parasiten (pink), Kontrollvertiefungen ohne tragfähige Parasiten (blau) und einem Spektrum zwischen mit Zwischen Zahlen von lebenden Parasiten gesehen. Die Fluoreszenz ist proportional zur Anzahl der lebenden Zellen und entspricht der Stoffwechselaktivität der Zellen; Resazurin Farbstoff (nicht fluoreszierenden) mit dem fluoreszierenden Resorufin durch Reduktionsreaktionen in metabolisch aktiven Zellen umgewandelt. 34 In diesem Test wird die Inkubationszeit mit der Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz für L. optimiert mexicana. Inkubationszeiten mit der Lebensfähigkeit Reagenz für Platten ausgesät bei verschiedenen Zellkonzentrationen oder mit verschiedenen Zelllinien variieren (beispielsweise kann dieses Verfahren auch verwendet werden,mit Säugerzellen). Abhängig von der genauen Plattenleser verwendet wird, müssen Überlegungen angestellt werden, bevor Fluoreszenzmessungen getroffen werden. Eventuell vorhandene Luftblasen in den Vertiefungen sollten genaue Messwerte entfernt werden, um sicherzustellen, ergriffen werden können. Einige Plattenleser gelesen von der Unterseite der Platten, wobei in diesem Fall flach 96-Well-Platten Boden verwendet werden. Andere Maschinen können von der Oberseite der Platte zu lesen, so dass der Deckel der Platte sollte vor der Messung entfernt werden. Schließlich wird in der Zukunft, so kann dieses Protokoll mit automatisierten Synthesizern kompatibel sein, die zur Herstellung vieler Sequenzen in der Lage sind, parallel. Zusätzlich ist die Synthese von cyclischen Peptoide diese Methode auch möglich verwenden. Dieses Protokoll sollte Forscher mit einer praktischen Syntheseverfahren bereitzustellen, das verwendet werden kann, mit neuen Peptoid Gerüste zuzugreifen sowohl Lysin- und Arginin-Monomeren, die in vielen Anwendungen nützlich sein können, einschließlich Materialien oder medizinischen Bereichen.

Peptoide (oder Poly- N - substituierten Glycine) sind eine Klasse von Peptid-Mimetika , die ähnliche Eigenschaften wie Peptide und als solche bieten zunehmend für Anwendungen , medizinische und Materialien untersucht. In Peptiden ist die Seitenkette jeder Aminosäure an den α-Kohlenstoff des Amid-Rückgrat verbunden ist; in Peptoide sind die Seitenketten an das Stickstoffatom des Gerüsts verschoben. Entscheidend ist, gibt dieser Peptoide größere Resistenz gegenüber Proteolyse. Peptoide werden unter Verwendung der Submonomer - Methode von Zuckerman Pionier allgemein synthetisiert et al., Wo Peptoid Monomere können an einen festen Träger und die anschließende Verdrängung des Halogens befestigt durch sequentielle haloacetylation einer Amin - Funktionalität aufgebaut werden , um ein primäres Amin verwendet wird . 1 Unsere Gruppe hat kürzlich entwickelte eine Anpassung an dieses Verfahren Submonomer Lysin- und Arginin-Typ-Peptoid-Reste innerhalb der gleichen Peptoid-Sequenz für die f enthalten sein sollen, damitrste Zeit. 2 Dieses Handbuch Festphasen - Ansatz Synthese zu Peptoid verwendet im Handel erhältlichen Reagenzien und gemeinsame Laborausrüstung, zugänglich für die meisten Labors zu machen. Peptoide wurden Peptide gezeigt , vielversprechende Aktivität gegen ein breites Spektrum von Gram - negativen Bakterien, Gram - positive Bakterien und Pilzarten haben, die viele bekannte antimikrobielle vergleichbar sind. 3-9 In unserer Arbeit wurden als neue Antiinfektiva-Verbindungen zur Behandlung der vernachlässigten Tropenkrankheit Leishmaniose. 5,10 Leishmaniose ist endemisch in mehr als 80 Ländern weltweit und es wird geschätzt , dass mehr als 12 Millionen Menschen infiziert sind global. 11 Die Peptoide verwendet Krankheit wird durch einzellige Parasiten verursacht , die durch den Biss eines sandfly übertragen werden. Leishmanienspezies kutanen Leishmaniose verursachen kann, eine Bedingung , die zu Narben und Schäden an den Schleimhäuten führt, oder die lebensbedrohlichen viszeralen leishmaniasis, die tödlich Organschäden verursacht. Kein Impfstoff ist derzeit für diese Krankheit und bestehende Therapien stützen sich auf eine kleine Anzahl von Medikamenten, die starke Nebenwirkungen haben. Darüber hinaus Resistenz gegen bestehende Medikamente ist ein aufstrebendes und ernstes Problem so neue Therapien dringend benötigt werden , um effektiv Leishmaniose in Zukunft zu behandeln. 12-16 In dieser antimikrobiellen Anwendungen werden Peptoide oft mit einem Gemisch aus kationischen und hydrophoben Monomeren sein amphipathischen gestaltet. Diese 3,4 Peptoide einen Grad an Selektivität gegenüber Bakterienzellen geben kann, reduzieren die Toxizität für Säugerzellen, und ihre Aktivität als Molekular Transporter zu verbessern . 17-20 enthalten die Mehrheit der anti-infektiöse Peptoide in der Literatur kationischen Seitenketten , die entweder von aminofunktionalisierten Lysin-Monomeren oder Arginin-Typ - Reste ausschließlich bestehen. Peptid-Peptoid-Chimären, in denen die kationische Ketten des a bestehenmino Säuren Lysin oder Arginin, haben auch die Wirkung der kationischen Gruppen auf Aktivität und Toxizität zu untersuchen , synthetisiert. 21-25 Poly-Lysin Peptoide leicht synthetisiert werden können, im Handel erhältliche Boc-geschützten Aminen. Die Poly-Arginin Peptoide berichtet können mit einem Verfahren hergestellt werden , die Pyrazol-1-carboxamidin als Guanidinylierung Mittel verwendet. 18. Dies ist jedoch nur durchgeführt werden kann , nachdem der Peptoid wurde von dem Harz und Boc - Schutz an Seitenketten entfernt, so gespalten jedes Lysin-Typ-Rest innerhalb der Sequenz wird in einen Argininrest umgewandelt. In dem Bemühen um eine Feinabstimmung der chemischen und biologischen Eigenschaften der Verbindungen, entwickelten wir ein Verfahren , das doppelten kationischer Funktionalität (beispielsweise N Lys und Arg N) in einem gegebenen Peptoid Sequenz ermöglicht zum ersten Mal aufgenommen werden. 2 Hier beschreiben wir die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von two neuartige Peptoide, die beide Lysin- und Arginin-Reste-Typ in der gleichen Reihenfolge enthalten. Das Verfahren verwendet orthogonal N - Boc und N -Dde Schutz auf Harz mit Pyrazol-1-carboxamidine als Guanidinylierungsreagenz. Die biologische Bewertung dieser Peptoide wird auch in Zytotoxizitätstests gegen Leishmania mexicana, dem Erreger der kutanen Leishmaniose beschrieben. Dies stellt eine praktische Methode, um Peptoide mit Dual kationischer Funktionalität zuzugreifen und ihre biologische Aktivität zu beurteilen. Es wird erwartet, dass diese Methode die Synthese von amphipathischen Peptoide durch die Peptoid Gemeinschaft in Zukunft helfen werden.

<table><tbody><tr><td>Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 and 12131015</td><td>20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>T0431-100g</td><td>&gt;98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&#039;&lt;/em&gt;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td><td>&gt;98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fischer Scientific</td><td>10407440</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99.8%; CAUTION: suspected carcinogen</td></tr><tr><td>Bromacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>&gt;99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-(-)-alpha methylbenzylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>115568-100G</td><td>98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,4-diaminobutane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1373-25g</td><td>&gt;98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,2-diaminoethane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1371-25g</td><td>&gt;97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer</td></tr><tr><td>1,4-diaminoethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td><td>&gt;99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage</td></tr><tr><td>Hydrazine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes</td></tr><tr><td>2-acetyl dimedone</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Amide resin</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 mesh, high loading</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>&gt;99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>Not classified as hazardous</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated</td></tr><tr><td>Solvent reservoirs</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>Used with multi channel pipette</td></tr><tr><td>Multi channel pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>Volume of tip dependent on pipette used. 10&amp;nbsp;&amp;micro;l, 10 - 200&amp;nbsp;&amp;micro;l and 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l recommended for assays</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; cell culture flasks</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulphoxide (molecular biology grade)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>Not classified as hazardous</td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>Abbreviation: P/S</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard</td></tr></tbody></table>

an efficient method for the synthesis of peptoids with mixed lysine-type/arginine-type monomers and evaluation of their anti-leishmanial activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Als ein repräsentatives Ergebnis der Synthese und Charakterisierung von zwei 12-Rest Peptoide, enthaltend zwei Lysin-Monomeren und zwei-arginine Monomeren jeweils beschrieben. Die nachfolgenden Ergebnisse Zytotoxizitätstest werden auch gezeigt. Zwei Peptoide [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] 2 (a) und [(N hArg N spe N spe) (N Lys N spe N spe)] 2 (b) wurden synthetisiert unter Verwendung von 120 mg Rinkamid each (Beladung = 0,79 mmol / g Harz). Alle Acetylierung und Verdrängungsschritte wurden durchgeführt, wie oben beschrieben, mit allen kommerziell erworben Reagenzien. - (-) - N spe (S) α-Methylbenzylamin, N ae N - (tert - Butoxycarbonyl) -1,2-Durchm: Für diese Rückstände wurden die folgenden Amine in dem Verschiebungsschritt verwendetinoethane, N Lys N - (tert - Butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutan. Für die Argininderivat - Reste wurden folgende ungeschützte Diaminen gekoppelt: N hArg 1,4-Diaminobutan oder N Narg 1,2-Diaminoethan, gefolgt von on-Harz Schutz mit 2-acetyldimedone (Dde-OH). Nachdem die gesamte Sequenz synthetisiert worden war, ergibt Hydrazin Abspaltung der Dde freie Amine zu guanidinylate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> Abbildung 1. Peptoid - Strukturen (a) [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] 2 und (b) [(N hArg N spe N spe) (N <stro<html> ng&gt; Lys N spe N spe)] 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> Abbildung 2. Das Verfahren für die gemischte Arginin / Lysin Peptoide synthetisieren. I. Standard-Verdrängungsschritt im submonomeren Verfahren mit Diamin; ii. Die Zugabe von Dde-OH, 90 Minuten schützen freie Amin; iii. Weitere Ergänzungen der Peptoid-Kette unter Verwendung des Submonomer-Verfahren zu verlängern; iv. Entschützung von Dde 2% Hydrazin in DMF verwendet wird; V. Guanidinylierung des freien Amins auf Harz mit Pyrazol-1-carboxamidine und DIPEA in DMF; vi. Saure Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe von Boc-Gruppen.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Nach der Spaltung vom Harz und Lyophilisierung wurden die Rohprodukte als weißes Pulver erhalten: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkte wurden mittels RP-HPLC gereinigt, wie es mit höchstens 50 mg Injektionen unter Verwendung einer LC-Pumpe mit einem UV-VIS-Detektor (λ = 250 nm) auf einer analytischen Säule beschrieben, 250 mm x 10 mm, 5 &amp; mgr; m; Fließgeschwindigkeit = 2 ml / min. Fraktionen, die die Zielmasse entsprechen, wurden kombiniert und als weiße Pulver erhalten: (a) 54 mg (b) 65 mg, endgültige Ausbeuten von ca. 30% für Anteile&gt; 90% rein. Die endgültige Verbindung Identitäten nach der Reinigung wurden mittels LC-MS (siehe Abbildung 3) bestätigte ein Triple - Quadrupol - Massenspektrometer mit einem UPLC ausgestattet ist und einem Photodiodenarray - Detektor. Die genaue Massenspektrometrie wurde unter Verwendung des gleichen Spektrometer auf T unternommen<html> er [M + 2H] 2+ -Ionen. Die folgenden berechneten und beobachteten Massen wurden in enger Übereinstimmung (Abbildung 4): (a) berechnet = 896,0026 amu beobachtet = 896,0038 amu; (B) berechnet = 952,0691 amu beobachtet = 952,0730 amu. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> Abbildung 3. LC-MS für gereinigtes Peptoide. (A) m / z = 1.792 und (b) m / z = 1.903. Wo die obere TIC ist, mittlere LC-MS - Spektrum, unten UV - Chromatogramm bei 220 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> Figur 4. Genaue Massenspektrometrische Daten für Peptoide (a) und (b).&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Produktreinheit wurde (mit einem UV-VIS-Detektor auf einer analytischen Säule LC Pumpe, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 &amp; mgr; m; Fließgeschwindigkeit = 1 ml / min) unter Verwendung einer analytischen RP-HPLC untersucht, und bei 220 nm sichtbar gemacht, die Extinktion von Amid - Rückgrat. 5a und 5b zeigt , daß die Verbindungen homogen sind. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> Figur 5. Analytische HPLC für die gereinigten Peptoide (a) und (b). Es gibt einen Gradienten von 0-100% B über 30 min, Säulenofen bei 40 ° C (A = 95% H 2 O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H 2 O, 0,03% TFA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">cl Bitte</a>ick hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die gereinigten Peptoide (a) und (b) wurden in Zytotoxizitätsassays gegen L. getestet mexicana axenic Amastigoten. Gefrorene Bestände von L. mexicana wurden aufgetaut und in die amastigote Bühne bereit für den Test umgewandelt. 72 Stunden nach dem Auftauen sollte die Parasiten Insekt Stufe Promastigoten in ihrer prozyklischen Form sein, in der log-Phase mit vielen teilender Zellen. In diesem Stadium können die Parasiten in den amastigote Stufe unter Verwendung des pH und Temperaturverschiebung beschrieben. 27 am Tag 9 der Transformation transformiert werden, werden die Parasiten in den nicht-replizierenden infektiösen metazyklisch promastigote Stufe. Schließlich am 14. Tag sollten die Parasiten in der pathogenen amastigote Stadium, wo Parasiten die charakteristische Geißeln der Promastigoten fehlen. 28 5 mM Stammlösungen der Verbindungen wurden in Zellkultur DMSO und getestet in dreifacher Ausführung hergestellt aufmindestens zwei Gelegenheiten eine robuste Datensatz, um sicherzustellen, wurde gesammelt. Ein repräsentativer 96-Well - Platte Plan ist in Figur 6 gezeigt ist . Am Ende des Tests wurde die Lebensfähigkeit der Zellen Reagenzes zu jeder Vertiefung und die Fluoreszenz hinzugefügt wurde gemessen , wie beschrieben , getestet , um die Lebensfähigkeit der Parasiten bei jeder Konzentration zu berechnen (siehe Abbildung 7 ). ED 50 -Werte wurden als Peptoid (a)&gt; 100 uM und Peptoid (b) 37 uM jeweils berechnet. Die Fehlerbalken aufgetragen, um die Unterschiede zwischen den Vertiefungen als Standardabweichung zeigen und es ist zu erkennen, dass diese angemessen sind für die meisten Bars. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative 96 - Well - Platte Plan für einen Zytotoxizitätstest auf 2 Peptoid - Lösungen (einschließlich positiver und negativer Kontrollen). Med + = mittel (Schneiders Insektenmedium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml Parasit Kultur in med +. AmphoB = 5 mM in DMSO. Peptoid = 5 mM Stammlösung in DMSO. Leere Brunnen sollte steriles Wasser enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> Abbildung 7. Die Ergebnisse aus Zytotoxizitätstest gegen L. mexicana axenic amastigote Parasiten unter Verwendung von Peptoid (a) und (b). Es ist ersichtlich, dass der Peptoid (b) ist wirksamer als Peptoid (a) auf den Prozentsatz der lebensfähigen Parasiten reduzieren, wobei beide Verbindungen eine dosisabhängige Wirkung. Die Fehlerbalken zeigen die Veränderung zwischen den Wells als Standardabweichung aufgetragen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Aufrufe.  Durham University. A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Serie: An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Forschung

Chemie

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and fold into higher order nanostructures. Structurally similar to peptides, peptoids are poly N-substituted glycines, where the side chains are attached to the nitrogen rather than the alpha-carbon. Their ease of synthesis and structural diversity allows testing of basic design principles to drive de novo design and engineering of new biologically-active and nanostructured materials.
Here, a simple manual peptoid synthesis protocol is presented that allows the synthesis of long chain polypeptoids ( up to 50mers) in excellent yields. Only basic equipment, simple techniques (e.g. liquid transfer, filtration), and commercially available reagents are required, making peptoids an accessible addition to many researchers' toolkits. The peptoid backbone is grown one monomer at a time via the submonomer method which consists of a two-step monomer addition cycle: acylation and displacement. First, bromoacetic acid activated in situ with N,N'-diisopropylcarbodiimide acylates a resin-bound secondary amine. Second, nucleophilic displacement of the bromide by a primary amine follows to introduce the side chain. The two-step cycle is iterated until the desired chain length is reached. The coupling efficiency of this two-step cycle routinely exceeds 98% and enables the synthesis of peptoids as long as 50 residues. Highly tunable, precise and chemically diverse sequences are achievable with the submonomer method as hundreds of readily available primary amines can be directly incorporated.
 
Peptoids are emerging as a versatile biomimetic material for nanobioscience research because of their synthetic flexibility, robustness, and ordering at the atomic level. The folding of a single-chain, amphiphilic, information-rich polypeptoid into a highly-ordered nanosheet was recently demonstrated. This peptoid is a 36-mer that consists of only three different commercially available monomers: hydrophobic, cationic and anionic. The hydrophobic phenylethyl side chains are buried in the nanosheet core whereas the ionic amine and carboxyl side chains align on the hydrophilic faces. The peptoid nanosheets serve as a potential platform for membrane mimetics, protein mimetics, device fabrication, and sensors. Methods for peptoid synthesis, sheet formation, and microscopy imaging are described and provide a simple method to enable future peptoid nanosheet designs.

A simple and general manual peptoid synthesis method involving basic equipment and commercially available reagents is outlined, enabling peptoids to be easily synthesized in most laboratories. The synthesis, purification and characterization of an amphiphilic peptoid 36mer is described, as well as its self-assembly into highly-ordered nanosheets.

Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Biotechnik

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Entwicklung eines Backbone zyklische Peptid-Bibliothek als potentielle Antiparasiten Therapeutics unter Mikrowellenbestrahlung

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). Traditional PAs possess charged amino acids as solubilizing groups (lysine, arginine), which are directly connected to a lipid segment or can contain a linker region made of neutral amino acids. Tuning the peptide sequence of PAs can yield diverse morphologies. Similarly, PPAs possess a hydrophobic segment and neutral amino acids, but also contain polyamine molecules as water solubilizing (hydrophilic) groups. As is the case with PAs, PPAs can also self-assemble into diverse morphologies, including small rods, twisted nano-ribbons, and fused nano-sheets, when dissolved in water. However, the presence of both primary and secondary amines on a single polyamine molecule poses a significant challenge when synthesizing PPAs. In this paper, we show a simple protocol, based on literature precedents, to achieve a facile synthesis of PPAs using solid phase peptide synthesis (SPPS). This protocol can be extended to the synthesis of PAs and other similar systems. We also illustrate the steps that are needed for cleavage from the resin, identification, and purification.

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles PPAs and Related Biomaterials

The synthesis of polyamine-based peptide amphiphiles (PPAs) is a significant challenge due to the presence of multiple amine nitrogens, which requires judicious use of protecting groups to mask these reactive functionalities. In this paper, we describe a facile method for the preparation of these new class of self-assembling molecules.

Facile Protokoll für die Synthese von selbst zusammenbauen Polyamin-basierte Peptid Amphiphilen (PPA) und der damit verbundenen Biomaterialien

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von &quot;Safety-Catch&quot;-Methodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Biologie

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...