This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Herstellung von Peptidarrays <ol><li> Programmieren der Peptidsequenzen <ol><li> Gestalten Peptidsequenzen für die Synthese mit dem MultiPep Spotter Software. Geben Sie die Peptidsequenzen in Einzelbuchstabencodes. Peptid 1: TARKSTGGKA </li><li> Gene Alanin oder Arginin Spaziergang Bibliotheken mit einem bestimmten Befehl (.replace, A), die für die Anerkennung der einen definierten Untergrund erforderlich wichtigen Aminosäuren zu untersuchen. Zum Beispiel in dem folgenden Beispiel wird die erste Zeile ist der Wildtyp-Sequenz und die aus der zweiten Zeile jeder Aminosäure in einem Peptid mit Alanin sequentiell verändert. ersetzen, A TARKSTG Ein -ARKSTG T- A -RKSTG TA-A -KSTG TAR- A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> Verwenden Sie ähnliche Befehle (.replace R,.ersetzen N etc.), wie in 1.1.2 mit allen natürlich vorkommenden Aminosäureresten (schließlich Weglassen Cystein, Methionin und Tryptophan beschrieben, weil diese Rückstände sind anfällig für Oxidation und manchmal niedriger Syntheseausbeute), um eine Peptidanordnung zur Bestimmung der Konsensus synthetisieren Substrat Sequenzmotiv für ein Enzym. HINWEIS: Wie in 4A gezeigt ist, stellt die horizontale Achse die gegebene Peptidsequenz und die vertikale Achse repräsentiert die Aminosäuren, die für die Befehls ausgewählt sind. Ähnlich zu der in 1.1.2 gezeigt durch A auf der vertikalen Achse bedeutet, daß ein Ala sequentiell jede Position der gegebenen Reihenfolge in der ersten Reihe in Fig ersetzt. 4A. Ähnlich Arginin nacheinander ersetzt jede Aminosäure in der zweiten Reihe und so weiter bei den anderen Aminosäuren. Komplette Peptidarray-Bibliotheken werden von systematisch in die bereitgestellten Peptidsubstrats Folge Ersetzen jedes Rückstand mit jedem th synthetisierte andere natürlich verfügbaren Aminosäureresten, das hilft, den Einfluss von jedem Rest an jeder Position des gegebenen Sequenz zu verstehen. </li><li> Alternativ kann die Methylierung von bekannten oder vorhergesagten Peptidsubstrate leicht verifiziert werden Synthetisieren von Peptid-Bibliotheken mit den Zielpeptide der PKMT zusammen mit positiven und negativen Kontrollen Methylierung (dh Peptide, die methylierte bekannt oder bekannten nicht methyliert sind). Synthetisieren Peptide durch Austausch des mutmaßlichen Ziel Lysin zu Alanin auf Methylierung des Ziel Lysin zu bestätigen, wie unten durch manuelle Programmierung angezeigt. Wildtyp-Peptid: StGG K PRQFL Mutant Peptid: StGG A PRQFL HINWEIS: Die Software ist auch inhärent Skripte verschiedenen Bibliotheken zu erstellen, wie Epitop-Kartierung mit einer gewünschten Rahmenverschiebung der Sequenz wichtig für eine Interaktion erforderlichen Aminosäuren abzubilden. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Membran, Aminosäuren eind Reagenzien <ol><li> Pre-schwellen die SPOT-Membran in DMF (N, N-Dimethylformamid) für 10 Minuten und dann die feuchte Membran auf der SPOT-Synthesizer Rahmen ohne Luftblasen oder Falten. </li><li> Dreimal mit 100% Ethanol waschen Membran. Man trocknet die Membranen vollständig mindestens 10 min vor Beginn der Syntheseprogramm. </li><li> Parallel frisch zubereiten 0,5 M Arbeitskonzentrationen von kommerziell erhältlichen Fmoc-geschützten Aminosäuren in NMP löst sie und auch den Aktivator und Base herzustellen, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Abfalllösungsbehälter des SPOT-Synthesizer geleert wurden und füllen Sie die Lösungsmittelbehälter mit dem DMF, Ethanol und Piperidin. HINWEIS: Das Gerät ist nun bereit für die Synthese. </li></ol></li><li> Spotten von der ersten Aminosäure <ol><li> Um die Amidbindung mit der freien Aminogruppe auf der Membran zu erzeugen, aktivieren Sie die Carboxy-Gruppe der ankommenden Aminosäure des Anbietersding der Aktivator (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) und Basenlösung (Ethyl hydroxyimino cyanoacetat) zu dem Aminosäurederivat. </li><li> Finde die gewünschten Volumina der aktivierten Aminosäuren an die Amino-PEG funktionalisierten Membran unter Verwendung der programmierbaren Roboter. HINWEIS: Dadurch wird der C-Terminus der Aminosäure an die Aminogruppe der Membran gekoppelt ist. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal, um eine bessere Kopplung der ersten aktivierten Aminosäure zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Membran für 20 Minuten und waschen mit DMF zu abgekoppelt Aminosäuren entfernen Sie dann. </li></ol></li><li> Das Blockieren der freien Plätze auf Non-Spot Bereiche HINWEIS: Nach der Kupplung der ersten C-terminalen Aminosäure aller Peptide an der Aminogruppe der Membran, werden die Aminogruppen zwischen den Flecken und einige der Aminogruppen in den Punktbereichen keine Bindungen mit den Aminosäuren bilden. <ol><li> Blockieren diese freien Aminogruppen durch Inkubation mit dem Capping-Lösung (20% Essigsäureanhydrid in DMF)für 5 min. ANMERKUNG: Dies vermeidet die Kupplung der Aminosäuren in den weiteren Zyklen mit der Membran anstatt der wachsenden Peptidkette. </li></ol></li><li> Die Entfernung der Fmoc-Gruppe <ol><li> Nach der Blockierung, Waschen der Membran mit DMF 4 mal und dann inkubiert mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen. Anmerkung: Dieser Schritt führt zu einer Entfernung der Aminoschutzgruppe Fmoc-Gruppen, und es heißt Entschützung. </li><li> Danach waschen Sie die Membran zweimal mit DMF und zweimal mit Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. HINWEIS: Nun ist die Membran ist für die Kopplung der nächsten Aminosäuren. </li></ol></li><li> Kettenverlängerung HINWEIS: Die Zugabe jeder Aminosäure wird als ein Zyklus bezeichnet. Abgesehen von der Kopplung der ersten Aminosäure, beginnt der Zyklus mit der Abspaltung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe der gekoppelten Aminosäure und es wird durch die Kopplung der aktivierten Carboxylgruppe einer ankommenden Aminosäure an die Aminogruppe der wachsenden pep gefolgtFlut Kette. <ol><li> Schritte 1.3 und 1.5, bis die gewünschte Peptidlänge erreicht wird. </li></ol></li><li> Färbung HINWEIS: Nach dem letzten Zyklus werden die Peptidarrays mit Bromphenolblau gefärbt, um die erfolgreiche Synthese von Peptiden zu bestätigen. Bromphenolblau bindet mit den freien Aminogruppen der Peptide. Peptid-Spots zeigen hellblaue Farbe nach dem Färben, aber die Intensität der Flecken variiert abhängig von der Peptidsequenz. Diese Färbung kann die Bestätigung der vollständigen Entfernung des Piperidin, weil in Gegenwart von Piperidin Bromphenolblau nicht die Peptide zu färben. Außerdem hilft dies auch, um die Peptid-Arrays für die weitere Verwendung zu markieren. <ol><li> Nach der Entfernung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe im letzten Synthesezyklus, waschen Sie die Membran mit DMF und 100% Ethanol. Dann behandeln die Membran mit Bromphenolblau (0,02% Bromphenolblau in DMF) für mindestens 5 Minuten, bis es vollständig blau. </li><li> Danach waschen Sie die Membran mit DMF und ethanol gefolgt von Trocknen für 10 min. Nun nehmen Sie die Membran aus dem Synthesizer und durchzuführen, Seitenkettenschutzgruppenentfernung (Abschnitt 1.8) von Hand. Falls benötigt, fotografieren der Membran, um die Ergebnisse des Peptid-Synthese (Fig. 2) zu dokumentieren. </li></ol></li><li> Side Chain Entfernung der Schutzgruppe <ol><li> Behandlung der Membran mit 20 bis 25 ml der Seitenkettenschutzgruppenabspaltung Mischung bestehend aus 95% Trifluoressigsäure (TFA), um die Seitenkettenschutzgruppen und Reagenzien Scavenger (2,5% Wasser und 2,5% Triisopropylsilan), um die Seitenketten von Aminosäuren aus schützen spalten Änderung bei diesem Schritt. Nehmen Sie eine ausreichende Menge an Entschützung Mischung, um sicherzustellen, dass er die Membran vollständig in einem dicht geschlossenen chemikalienbeständige Box und inkubieren Sie für 1-2 Stunden unter leichtem Schütteln. </li><li> Sechsmal Waschen der Membran mit 20-25 ml DCM (Dichlormethan), jeweils 2 min und schließlich zweimal mit 100% Ethanol und trocknet es im Exsikkator über Nacht. HINWEIS: Jetztkann die Membran für Experimente verwendet werden. Ein Schema der Peptidsynthese-Array ist in 1 bereitgestellt. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Protein Expression von PKMTs als GST Fusions <ol><li> Verwendung von Standardtechniken, klonen die über die gesamte Länge PKMT oder seine katalytische Domäne in einen bakteriellen Expressionsvektor (wie pGEX-6p2), um sie als GST-Fusionsprotein zu exprimieren kodierenden Gens. </li><li> Übertragen Sie den Vektor mit dem gewünschten PKMT einfügen in BL21 oder BL21-Codon und E. coli-Zellen durch das Hitzeschock-Methode oder jede andere Methode. </li><li> Vorbereiten einer Vorkultur in 30 ml Luria-Bertani (LB) Medium am Tag der Expression und Inkubation bei 37 ° C für 7 bis 8 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Als nächstes über 10 ml der Vorkultur in einen 2 l großen Schikane-Kolben mit 1 l LB-Medium und bei 37 ° C im Brutschrank unter ständigem Schütteln bis die Kultur die Reichweitees eine definierte optische Dichte bei 600 nm. Anmerkung: Dies kann zwar für jedes Protein optimiert werden wir routinemäßig bei einer OD 600 nm von etwa 0,8 zu induzieren. Die Induktionstemperatur muss für jedes Protein einzeln optimiert werden einige Proteine ​​zeigen eine gute Ausdrucks 22 ° C und einige bei höheren Temperaturen. </li><li> Verschieben die Zellen an den Induktionstemperatur für 15 min, dann mit 1 mM Isopropyl- &amp; beta; -D-thiogalactopyranosid induziert und damit der Kultur für 10-12 Stunden bei Induktionstemperatur wachsen. </li><li> Danach Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 15 Minuten und schließlich Waschen des Pellets mit 30 ml STE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA) resuspendiert und bei -20 ° C für die weitere Verwendung. </li></ol></li><li> Proteinreinigung <ol><li> Auftauen Zellpellet und resuspendiere in 30 ml Beschallungspuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) und stören durch Beschallung. HINWEIS: Dieser Puffer needs für jedes Protein schließlich optimiert werden. </li><li> Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 22.000 · g für 1 Stunde und später den Überstand zu sammeln und durch eine Säule, die 600 &amp; mgr; an Glutathion Sepharose 4B-Harz. </li><li> Mit 50 ml Beschallungspuffer und anschließend mit 100 ml Hochsalzpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) unspezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen Die Säule. Eluieren des gebundenen Proteins mit 5 ml Hochsalzpuffer, enthaltend 40 mM Glutathion. </li><li> Dialysieren des eluierten Proteins in 2 l Dialysepuffer mit niedrigem Glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 10% Glycerin) für 2 Stunden und dann in 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 70% Glycerin 8 Stunden oder über Nacht. Achten Sie darauf, alle Reinigungspuffer bei 4 ° C und führen Sie die Proteinreinigung im Kühlraum, um Proteindenaturierung zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 3. Peptid-Array-Methylierung <ol><li> Pre-incuBewährung von Peptidarrays <ol><li> Führen Peptidanordnung Methylierung entweder in einem Feld mit der entsprechenden Größe oder in einem Kunststoffbeutel, die Verschwendung des teuren Enzyms und radioaktiv markiertem AdoMet vermeiden. Pre-Inkubation der Peptidarray-Membran in versiegelten Plastikbeutel mit dem jeweiligen Methylierungspuffer ohne Enzym und mit [Methyl-3H] -AdoMet 10 min. Das Puffervolumen ist abhängig von der Größe des Arrays, beispielsweise verwenden 8 ml Methylierungspuffer für eine volle Spezifität Profil Peptidanordnung. Optimieren der Menge und Konzentration der AdoMet für jedes Enzym. </li></ol></li><li> Die Methylierung von Peptidarrays <ol><li> Entsorgen Sie die Vorinkubation Puffer und Inkubation der Membran in 8 ml Methylierungspuffer, der die jeweilige PKMT und mit [Methyl-3H] -AdoMet für 1 bis 2 Stunden. HINWEIS: Die Enzymmenge, für eine Methylierungsreaktion erforderlich ist, hängt von der Aktivität des speziellen PKMT initiieren wir unserem Screening-Experimente in der Regel mit 50 nM Enzym final-Konzentration. </li></ol></li><li> Das Waschen von Peptidarrays <ol><li> Danach verwerfen Methylierungspuffer in einer radioaktiven Abfallbehälter und waschen die Peptidarrays 5 mal mit 20 ml Puffer, enthaltend 100 mM Ammoniumbicarbonat und 1% SDS für 5 Minuten, um das gebundene Protein zu entfernen. Entsorgen Sie den Waschpuffer in einem radioaktiven Abfallbehälter. </li></ol></li><li> Detektion der radioaktives Signal <ol><li> Nach den Wäschen Inkubieren der Membran für 5 Minuten in 10 ml Lösung Amplify (NAMP100V). </li><li> Dann werfen Sie die amplify Lösung in die radioaktive Abfälle Behälter für organische Lösemittel, dichten den Peptidarray in einer Plastiktüte und legen Sie sie in einer Autoradiographie Kassette. </li><li> Platzieren Sie die Autoradiographie-Film auf dem Peptidarray in den dunklen Raum. Schließen Sie die Kassette vorsichtig und setzen Sie es bei -80 ° C für die erforderliche Zeit. Dann entwickeln die Folie, um die Ergebnisse zu analysieren. Nehmen Sie das Bild mehrmals mit unterschiedlichen exposition-mal, um eine Sättigung von stark methylierten Peptidsubstrate zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 4. Datenverarbeitung und -analyse <ol><li> Densitometrische Analyse der Spotintensitäten <ol><li> Scannen Sie den Film in einem konventionellen Scanner und die Spotintensitäten analysieren densitometrisch. Tun Sie dies mit ImageJ (die Freeware ist) oder ein kommerzielles Programm. BEMERKUNG: Wir verwenden Phoretix Software für diese Aufgabe. </li></ol></li><li> Normalisierung und Mittelwertbildung der Ergebnisse aus verschiedenen Membranen <ol><li> Führen Sie die Peptidarray-Methylierungsexperimente zumindest in dreifacher Ausfertigung. Normalisieren die gescannten Intensitäten für jedes Experiment durch Subtraktion des Hinter und Einstellung der Tätigkeit bei einer Referenzsubstrat als 1,0. Der Mittelwert der Daten für die einzelnen Punkte und melden sie als Mittelwerte und Standardabweichungen. </li></ol></li><li> Datenanalyse und Anzeige <ol><li> Zeichnen Sie die Daten in 2D mit einem Graustufen- oder Farbschema, um die relative Tätigkeit hinweisen. Tun Sie dies with Excel oder Sigmaplot wie hier gezeigt. Auch bereiten eine graphische Darstellung der Verteilung der Standardabweichungen der wiederholten Versuchen, um die Qualität der Daten zu analysieren. </li><li> Vergleichen und zeigt die Genauigkeit der Erkennung von jedem Rest in dem Substrat Peptid quantitativ berechnen die relative Präferenz der PKMT für jede Aminosäure i an Position x durch ein Diskriminierungsfaktor D 16,17: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Wobei v i ist die Geschwindigkeit der Methylierung der Peptidvariante trägt Aminosäure i an Position x und &lt;v j ≠ i&gt; ist der Durchschnittskurs der Methylierung aller 19 Peptiden mit unterschiedlichen Aminosäure j ≠ i an der Position x (einschließlich der Wildtyp-Sequenz). HINWEIS: Das Diskriminierungsfaktor dadurch definiert, hängt von der Hintergrundebene. Wenn nur ein Rückstand an einer bestimmten Position mit einem Hintergrund von 3%, eine Diskriminierung akzeptiertFaktor von 32,3 erhalten wird. Keine Präferenz in einer Position ergibt sich eine Diskriminierungsfaktor von 0. </li></ol></li></ol>

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No conflicts of interest declared.

SPOT-Synthese, wie hier beschrieben ist eine leistungsfähige Methode zur Karte Protein-Protein-Interaktionsstellen und untersuchen die Substraterkennung von Peptid-modifizierende Enzyme. Jedoch hat SPOT Synthese noch bestimmte Nachteile, denn obwohl die Peptide von der SPOT-Verfahren synthetisiert wird berichtet, daß mehr als 90% Reinheit 21 haben, ist dies schwierig, in jedem Fall zu bestätigen. Deshalb müssen Ergebnisse, die durch andere Methoden zum Beispiel mit Proteindomänen oder mit gereinigten Pep...

In den letzten zwei Jahrzehnten, zeigen mehrere Berichte die Bedeutung der post-translationale Modifikationen (PTM) in zellulären Entwicklung und mehrere Krankheiten wie Krebs, aber vor kurzem Protein Lysin-Methylierung hat sich als eine andere lebenswichtige PTM entstanden. Während zunächst Histon Lysin-Methylierung wurde festgestellt, eine wesentliche Chromatin Marke werden, zeigten spätere Arbeit auch Lysin-Methylierung von mehreren Nicht-Histon-Proteine ​​1-4. Die sequentielle Übertragung der Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin zu der ε-Aminogruppe der Lysinreste wird durch eine Familie von Enzymen, genannt Protein Lysin-Methyltransferasen (PKMTs), die mehr als 60 Proteine, die in das menschliche Genom enthält katalysiert. PKMTs wurden zunächst als Histon-modifizierenden Enzymen, die spezifisch Lysinrest methylieren aber später Berichte gezeigt, dass sie auch zu methylieren Nicht-Histon-Proteine ​​5 entdeckt. Bisher wurden etwa 5.000 Lysin Methylierungsstellen auf verschiedenen Proteinen 6 ermittelten </sup&gt;, aber die Enzyme, die für diese Änderungen verantwortlich sind oft nicht identifiziert. Ein Grund dafür ist, dass die Spezifität der meisten PKMTs nicht ausführlich untersucht worden. Daher ist es immer wieder vor, dass neuartige Substrate PKMTs entdeckt werden. Das Fehlen einer detaillierten Kenntnis der Substratspezifität PKMTs behindert Verständnis ihrer biologischen Funktion und Rolle. Um die Spezifität einer PKMT im Detail zu untersuchen, müssen die Methylierung Geschwindigkeiten vieler Peptidsubstrate, die in einer oder einigen Aminosäuren unterscheiden, gemessen und verglichen werden, die im Idealfall unter Verwendung von Peptid-Arrays durchgeführt wird werden. Basierend auf den erhaltenen Spezifität Profile können potentielle Substrate PKMTs identifizieren, die weiter untersucht werden können. Peptid-Arrays werden häufig verwendet Werkzeuge für die biochemische Analyse von Antikörpern, Peptid modifizierende Enzyme und Kartierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen (Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand) 7-9. Mehrere hundert Peptide zur suc erforderlichh Anwendungen. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung für die Peptidsynthese, unter ihnen die Peptidsynthese am Harz wird sehr häufig verwendet, aber es kann nur eine beschränkte Durchsatz und relativ teuer ist. Diese Probleme wurden mit der Einführung des SPOT-Syntheseverfahren von Frank und seine Kollegen 10 gelöst. Die SPOT-Syntheseverfahren erlaubt die Synthese von mehreren hundert Peptide parallel und im Mittel er preiswert ist, verglichen mit der Harzsynthese. Die synthetisierten Peptide auf Cellulosemembran kann entweder direkt für verschiedene Anwendungen oder Peptide verwendet werden, können aus der Membran geschnitten und als freie Peptide in Lösung Assays verwendet werden oder Peptid-Mikroarrays 10-13 vorzubereiten. SPOT-Synthese ist eine Variante des Festphasen-Peptidsynthese, die eine Cellulose-Membran als fester Träger verwendet und verwendet den Standard-Fmoc-Chemie 10-13. Daher ist die Synthese der Peptidketten beginnt am C-terminalen Ende und schreitet in Richtungdie N-terminalen Ende im Vergleich zu der biologischen Synthese in Ribosomen. Cellulosemembranen sind für die Befestigung des ersten aktivierten Aminosäuren (Fig. 1) funktionalisiert. Der Spot-Verfahren basiert auf der sequentiellen Abgabe aktivierten Aminosäuren in einem Tröpfchen von Lösungsmittel zu definierten Spots auf der Membran unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems bezogen. Die Flüssigkeitströpfchen auf der porösen Membran, wo sie eine Kreis nassen Fleck, der später wirkt als offener Reaktor für die chemischen Reaktionen bei der Peptidsynthese bildet verzichtet. Die Fleckgrße wird durch das Volumen abgefüllt und die Absorptionskapazität der Membran bestimmt wird, werden Vielfache von solchen Stellen als Arrays angeordnet sind. Der Synthesemaßstab korreliert mit der Punktgrße und die Belastbarkeit der Membran. Der Abstand zwischen den Flecken und der Dichte des Arrays werden durch Variation der Punktgrßen verwaltet. Cellulosemembran hat mehrere Vorteile, wie Festphasenpeptidsynthese, preiswert, tolerant gegenüber dem chemic ist esals in der Peptidsynthese verwendet, in wässrigen Lösungen stabil ist und leicht zu handhaben. Darüber hinaus macht seine hydrophile Natur es für verschiedene biologische Testsysteme geeignet. SPOT-Synthese kann manuell oder automatisiert (für 1000 von Peptiden), je nach der gewünschten Anzahl von Peptiden werden. Eine vollautomatische SPOT-Synthesizer von Intavis (Köln, Deutschland) ist für unsere Anwendungen. Es ermöglicht die Synthese von Peptiden in unterschiedlichen Mengen und von unterschiedlicher Länge. Lineare Peptide sind regelmäßig mit 15 bis 20 Aminosäuren Länge synthetisiert, zusätzlich Peptiden von bis zu 42 Aminosäuren können auch durch stufenweise Synthese 14,15 hergestellt werden. Eine Erhöhung der Anzahl von Aminosäuren führt zu einer Verringerung in der Gesamtkopplungsausbeuten, die die Qualität der Peptide beeinträchtigen. Wegen der geringen Menge an Peptiden pro Spot, die Produkte sind oft schwierig zu reinigen, und die Qualität der einzelnen Peptide können nicht einfach beurteilt werden. Daher sind die Ergebnisse von SPOT Pept erhaltenenide Arrays müssen entweder mit Peptiden nach Standardverfahren in größerem Maßstab, die gereinigt und nach Standards in der Peptidsynthese oder durch Synthese der Proteine, die die gewünschten Peptidsequenzen analysiert werden können synthetisiert bestätigt werden. Dennoch fanden wir die SPOT-Synthese durch hohe Zuverlässigkeit und führt in der Regel reproduzierbar sein. SPOT-Synthese ist nicht beschränkt auf Aminosäuren, mehreren kommerziell erhältlichen modifizierten Aminosäuren können auch für die Synthese verwendet werden proteinogenen, wodurch Peptide, die vor und nach der abschließenden Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppe und ferner modifiziert werden, sondern ermöglicht auch den Einbau von phosphoryliert, methyliert oder acetyliert Aminosäuren 11. Immobilisierte Peptidbibliotheken durch die SPOT-Verfahren synthetisiert können direkt für viele biologische und biochemische Assays verwendet werden. Wir verwendeten Peptidarrays, umfassend 300-400 Peptide, die Substratspezifität von PKMTs untersuchen. Für enzymatische modifiKationen werden die Peptid-Arrays mit den entsprechenden PKMT inkubiert und mit [Methyl- 3 H] -AdoMet in einem geeigneten Puffer. Die Methylierung des jeweiligen Substrats durch folgenden die enzymatische Übertragung von radioaktiv markierten Methylgruppen von AdoMet auf das Peptidsubstrat über Autoradiographie (Fig. 3) untersucht. Durch dieses Verfahren werden die Peptid-Arrays erlauben das Studium der Methylierung von verschiedenen Peptidsubstrate gleichzeitig. Ein wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist, dass alle Peptide in Konkurrenz methyliert, so dass während der linearen Phase der Methylierung Kinetik, ist die relative Methylierungs jedes Peptids proportional zu der katalytischen Geschwindigkeitskonstante geteilt durch die Dissoziationskonstante (k cat / K D) des Enzyms für die jeweiligen Peptidsubstrat. Daher wird die Menge an Radioaktivität in jedem Spot einge direkt mit der enzymatischen Aktivität gegenüber dem jeweiligen Peptids korreliert. Mit derErgebnisse einer Peptidarray-Methylierung Experiment kann die Spezifität Profil des PKMT definiert und basieren auf dieser neuartige Substrate ausgesagt werden. Peptidarrays ermöglichen die schnelle und kostengünstige Überprüfung der Methylierung neuartige Substrate in Peptiden. Hierzu werden Arrays hergestellt, die die vorhergesagten neuen Substrate mit modifizierten Peptide, die eine Ala anstelle von Lys an den Zielorten sowie positive und negative Kontrollpeptide enthalten. Schließlich können die erfindungsgemäßen Proteine ​​als Substrate zusammen mit Mutanten, in denen das Ziel Lys Ala verändert und die Methylierung kann auf Proteinebene zu bestätigen, hergestellt werden. Je nach Ergebnis wird diese dann von biologischen Studien zu möglichen Rollen der Methylierung der neu beschriebenen Proteinsubstraten gefolgt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lysin-Methylierung ist ein aufstrebendes posttranslationale Modifikation und es hat auf mehreren Histon und Nicht-Histon-Proteine ​​identifiziert worden, wo er eine entscheidende Rolle bei der Zellentwicklung und viele Krankheiten spielt. Rund 5.000 Lysin Methylierungsstellen wurden auf verschiedene Proteine, die von einigen Dutzenden von Protein Lysin-Methyltransferasen eingestellt werden identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass jede PKMT methyliert mehrere Proteine ​​jedoch bis jetzt nur ein oder zwei Substrate wurden für mehrere dieser Enzyme identifiziert worden. Um dieses Problem anzugehen, die wir eingeführt haben Peptidarray basierte Substratspezifität Analysen PKMTs. Peptidarrays sind mächtige Werkzeuge, um die Spezifität PKMTs charakterisieren, da die Methylierung der mehrere Substrate mit verschiedenen Sequenzen können auf einem Array getestet werden. Wir Peptidarrays auf Cellulosemembran mit einem Intavis SPOT-Synthese und analysiert die Spezifität der verschiedenen PKMTs. Basierend auf den Ergebnissen aus mehreren dieser Enzyme, neuartige substrates identifiziert werden. Zum Beispiel kann für NSD1 durch Verwendung Peptidarrays, zeigten wir, dass es methyliert K44 H4 statt der berichteten H4K20 und zusätzlich H1.5K168 ist stark bevorzugt Substrat über dem vorbekannten H3K36. Daher Peptid-Arrays sind leistungsfähige Werkzeuge, um biochemisch charakterisieren die PKMTs.

Peptidarrays wurden erfolgreich eingesetzt, um biochemisch charakterisieren die Spezifität PKMTs, und mehrere neue Histon und Nicht-Histon-Substrate PKMT identifiziert durch diesen Ansatz 5,16-19. Definieren der richtigen Substrat-Spektrum einer PKMT (oder einem Enzym), ist ein wesentlicher Schritt in Richtung auf das Verständnis des molekularen Mechanismus und zellulären Funktionen. Als ein Beispiel für die Anwendung der Peptidfleckenanordnung Methylierungsmethode beschreiben...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Aufrufe.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Serie: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...