In diesem Protokoll wurde das Sulfoniumsalz konstruiert, das als neue Hand fungieren konnte, die mit dem Protein Cystein auf die besondere Nähe reagierte. Der Vorteil dieser Technik war, dass diese Reaktion schnell und effizient und Met-katalysatorfrei war und eine einfache und effiziente Methode zur Stabilisierung von Peptiden entwickelte. Zu Beginn wird die N-terminale 9-Fluorinylmethyloxycarbonyl-Deprotection-Lösung aus 20% Piperidin oder 50% Morpholin und DMF in einem 500-Milliliter-Becherglas oder -Kolben hergestellt.
Dann fügen Sie 10 Milliliter der Deprotection-Lösung in die Säule und blasen Stickstoff für 30 Minuten oder zweimal für fünf Minuten in die Lösung. Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander fünfmal mit Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid. Um das Harz als dunkelgelbe Farblösung zu erkennen, fügen Sie einen Milliliter N, N-Dimethylformamid zu einer kleinen Menge Harz hinzu und fügen Sie 200 Mikroliter 5% Ninhydrin zu einem Glasrohr hinzu.
Erhitzen Sie es drei Minuten lang bei 130 Grad Celsius, um Veränderungen in der Harzfarbe zu beurteilen. Für die Kopplung von Peptiden wird eine Mischungslösung wie im Manuskript beschrieben in einem Polypropylenröhrchen hergestellt und in drei Milliliter N,N-Dimethylformamid gelöst. Dann fügen Sie 173 Mikroliter N, N-Diisopropylethylamin oder 154 Mikroliter N, N'diisopropylcarbodiimid zur Lösung hinzu, um die Aminosäure zu inaktivieren.
Als nächstes fügen Sie die Mischung mit Harz in die Säule und blasen Sie sie zwei Stunden lang mit Stickstoff auf. Nach dem Ankuppeln einen Milliliter N,N-Dimethylformamid zu einer kleinen Menge Harz hinzufügen und 200 Mikroliter 5% Ninhydrin in ein Glasrohr geben. Erhitzen Sie es drei Minuten lang bei 130 Grad Celsius, während das Harz farblos wird, was das Fehlen einer freien Aminogruppe vor dem Deprotektionsschritt bestätigt.
Nach dem Abtropfen der Lösung waschen Sie das Harz wie zuvor demonstriert und geben Sie 10 Milliliter der Deprotection-Lösung in die Säule. Dann 30 Minuten oder zweimal fünf Minuten lang mit Stickstoff sprudeln. Und wieder fügen Sie eine neue Lösung hinzu.
Fügen Sie 10 Milliliter wasserfreies Methanol mit Harz zur Dehydrierung in die Säule und trocknen Sie sie mit Stickstoff für die nächste Verwendung. Wiegen Sie 100 Milligramm des Harzes in eine Säule und waschen Sie das Harz vor dem Kupplungsschritt mit Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid. Eine Lösung zum Entfernen der Trityl-L-Cystein-Schutzgruppe wird durch Zugabe von Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Dichlormethan in einem 100-Milliliter-Becherglas oder -kolben zum Entfernen der Schutzgruppe hergestellt.
Geben Sie fünf bis 10 Milliliter der vorbereiteten Lösung in die Säule, um die Schutzgruppe für 10 Minuten zu entfernen. Wiederholen Sie sechsmal mit stickstoffsprudelndem Stickstoff, bis die gelbe Farbe vollständig verschwindet. Nach dem Ablassen der Lösung durch eine Vakuumpumpe waschen Sie das Harz wie zuvor gezeigt.
Anschließend wird eine Lösung für die Reaktion mit degeschütztem Cystein durch Zugabe von dihalogeniertem Linker und N,N-Diisopropylethylamin in einem 50-Milliliter-Becherglas oder -Kolben mit N,N-Dimethylformamid hergestellt. Geben Sie fünf bis 10 Milliliter der Reaktionslösung in die Säule, um mindestens drei Stunden lang mit geschütztem Cystein zu reagieren, wobei Stickstoff sprudelt. Lassen Sie die Lösung erneut mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander, wie zuvor gezeigt.
Zur Herstellung der Peptidcyclisierungslösung wird ein Trifluoressigsäuregemisch in ein 20-Milliliter-Becherglas oder einen Kolben im Abzug für die Peptidcyclisierung gegeben. Dann fünf bis 10 Milliliter der Mischungslösung in das Polypropylenrohr geben und das Harz drei Stunden lang unter dem Trifluoressigsäurecocktail spalten. Nach dem Dehydrieren und Waschen des Harzes, bevor der Kupplungsschritt zuvor demonstriert wurde, wird eine 1%ige Ameisensäure-wässrige Lösung und ein Millimolarpropargylbromid hergestellt und der Methioninpeptidlösung zugegeben.
Als nächstes schütteln Sie die Kopplungsreaktion von Methionin und Propargylabromid bei Raumtemperatur für 12 Stunden. Nach der Reaktion das Produkt in einem Polypropylenrohr und Acetonitril lösen und durch eine 0,22 Mikrometer lange Filtermembran filtrieren. Dann reinigen Sie die Lösung sofort durch Umkehrphasen-HPLC und gefriertrocknen Sie sie zu Pulver für die nächste Verwendung.
Die synthetisierten cyclischen Peptide mittels Bis-Alkylierung zwischen Cystein und Methionin wurden durch HPLC- und LCMS-Spektrum charakterisiert, was zeigt, dass die Epimere unterschiedliche Retentionszeiten und identische Molekulargewichte aufwiesen. Die HPLC-Spuren der Epimere und ihres konjugierten Produkts zeigten die zeitabhängige Umwandlung zwischen dem cyclischen Peptid und seinem Produkt. Das Molekulargewicht zyklischer Peptide, die unter Verwendung einer Thiol-In-Reaktion synthetisiert wurden, wurde mittels LCMS bestimmt und das Peptid wurde mittels HPLC isoliert und gereinigt.
Die Peptide wurden weiter durch Protonen-NMR und heteronukleäre einzelne quantenkohärente Spektren charakterisiert, was die chemische Verschiebung enthüllte. Protonen-NMR-Spektren der zeitabhängigen Umwandlung zwischen cyclischem Peptid und Dithiothreitol und Deuteriumoxid wurden erhalten, um die Stabilität des Peptids aufgrund der Öffnung des Sulfoniumrings zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 24 Stunden keine Additions- oder Ringöffnungsprodukte gebildet wurden.
Dieses Verfahren etablierte eine effektive Strategie zur Synthese zyklischer Peptide. Die Reaktion besagt, dass die Selektivität auch durch die Bildung einer Bestätigung verbessert wird, die das Cyclisierungspeptid stabilisiert, was darauf hindeutet, dass zyklische Peptide vielversprechende Arzneimittelkatalysatoren waren.
