Name: preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
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Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

Das folgende Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von New England zugelassen. Das folgende Protokoll ist für Glia-Kulturen von 4 erwachsenen Maus Rückenmark vor. 1. Herstellung von Lösungen in einer Kultur Hood unter aseptischen Bedingungen <ol><li> Bereiten Kulturmedien: alle Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (cDMEM), enthaltend DMEM (mit 4,5 g / L Glucose), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin , 250 ng / ml Amphotericin B und 50 &amp; mgr; M 2-Mercaptoethanol (2-ME, siehe 1.1.1). Mischen Sie und filtern alle anderen Komponenten zu sterilisieren und dann FBS hinzufügen. Bewahren Sie die Kulturmedien bei 4 o C <ol><li> Bereiten Sie 50 mM 2-ME / Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) Stammlösung: 100 l konzentriert 2-ME (14,3 M) in 28,6 ml 1x PBS und Filter zu sterilisieren (die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden mehrere Monate). Use 1 ml 2-ME-Stammlösung für jede 1.000 ml Kulturmedien. </li></ol></li><li> Herstellung des Dichtegradientenmedien <ol><li> Bereiten Sie einen Vorrat isotonische Dichtegradientenmedien Lösung (zB 100% Percoll) von 1 Teil 10x regelmäßigen sterilem PBS und 9 Teile sterile Lager Dichtegradientenmedien (zB Percoll). </li><li> Verdünnen Sie die 100% Dichtegradientenmedien (hergestellt in Abschnitt 1.2.1) mit regelmäßigen 1x steriler PBS mit 20% Dichtegradientenmedien zu machen (zB 10 ml 100% Dichtegradientenmedien mit 40 ml 1x PBS) und speichern sie in 4 o C. Bringen Sie die 20% Dichtegradientenmedien auf Raumtemperatur (RT), bevor die Zellkultur vorbereitet. </li></ol></li><li> Herstellung von Lösungen aus dem Papain Dissoziation System ANMERKUNG: Das System Papain Dissoziation in der Werkstoff - Tabelle identifiziert werden. Andere ähnliche Dissoziation kits (einschließlich zusammengebaut in-house) können ebenfalls verwendet werden. Alle components müssen steril sein. <ol><li> In 32 ml Balanced Salt Solution Earle (EBSS) zum Ovomucoid Hemmittelgemisches (Pulver). </li><li> In 5 ml EBSS einem Papain Fläschchen (Pulver). Platzieren Sie die Papain Phiole in einem 37 ° C Wasserbad für 10 min oder bis das Papain aufgelöst wird. </li><li> In 500 ul EBSS einem DNase Fläschchen (Pulver). Vorsichtig mischen. </li><li> In 250 ul der DNase-Lösung (siehe oben) auf die Papain Fläschchen. </li><li> Berechne die Gesamtmenge der oben Papain / DNase-Gemisch benötigt wird (etwa 800 &amp; mgr; l Papain / DNase Mischung pro Rückenmark der Maus) und übertragen die benötigte Mischung in ein 50 ml-Röhrchen für die Gewebeverdauungs (Schritt 3.2). Bewahren Sie die Überbleibsel in der Originalflasche bei 4 ° C für mindestens zwei Wochen. </li><li> Halten Sie alle Komponenten aus den Kits auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Rückenmark Sammelröhrchen: ein steriles 15 ml-Röhrchen mit 5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; von der Papain Dissoziation System,0; für Rückenmark) und einem sterilen 15 ml-Röhrchen mit 1x PBS (zum Auffüllen der 5-ml-Spritze zu sammeln, siehe Schritt 2.4). Darüber hinaus bereiten eine sterile Petrischale (35 mm oder 60 mm) mit 5 ml HBSS und halten es in der Kultur Kapuze. </li></ol> 2. Spinal Cord-Sammlung HINWEIS: Alle Geräte müssen steril sein. Führen Sie die Sammlung in einem bestimmten Bereich durch die IACUC genehmigt. <ol><li> Beziehen Sie die folgenden Werkzeuge für die Ernte Maus Rückenmark: gerade scharf / stumpf 18 cm chirurgische Schere, ein 12-cm-Standard Skalpell (# 3 fest), Kohlenstoffstahl sterile Skalpellklingen # 10, ein kleines Tier Decapitator, 12-cm-Standard gebogen Zange und eine sterile Nadel 20G auf eine 5-ml-Spritze angebracht ist. </li><li> Euthanize das Tier mit CO 2 und desinfizieren Sie die Mauskopf und den hinteren Bereich mit 70% Ethanol (EtOH). </li><li> Enthaupten Tier mit dem Decapitator. Machen Sie einen mittleren Längsschnitt auf der unteren Rückseite der Muskelschicht zu belichten. Macheneine saubere Durchtrennung durch die wirbel Säule an der Hüfte Ebene (auch durch die Muskelschicht schneiden, die die wirbel Säule umfasst) mit den sterilen gerade chirurgische Scheren (18 cm). </li><li> Legen Sie das Tier auf einem Blatt frischen Einweg-Feger. Schieben Sie die 20 G-Nadel (an einer 5-ml-Spritze gefüllt mit sterilem 1x PBS (Schritt 1.4)) in die Wirbelsäule in Richtung der rostralen Seite. Halten Sie das Tier nach unten fest, und drücken Sie schnell die Spritze. Die gesamte Rückenmark sollten aus dem zervikalen Ende kommen. Sammeln Sie das Rückenmark in das 15 ml-Röhrchen mit HBSS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 für den Rest der Mäuse. Zwischen jedem Tier, Desinfektion aller verwendeten Instrumente mit 70% EtOH. HINWEIS: In der Regel eine einzige 12-Well-Platte für alle 4 Maus Rückenmark festgelegt werden (siehe 4.3). </li></ol> 3. Herstellung der Einzelzellsuspension Hinweis: Führen Sie die Schritte 3 und 4 in einer Kultur Haube alles steril zu halten. <ol><li> Übertragen Sie alle Rückenmark in die HBSS enthaltende Petrischale (Schritt 1.4). Schneiden Sie jede der Rückenmark in viele feine, kleine Stücke mit einer sterilen Schere und Pinzette. Übertragen das Rückenmarksgewebe zu dem 50 ml konischen Röhrchen die vorbereitete Papain / DNase Enzymmischung (Schritt 1.3.5) unter Verwendung einer sterilen Pinzette oder einem 10 ml-Pipette enthält (HBSS vermeiden zu der Enzymmischung hinzufügen, wie dies weiter verdünnt das hergestellte Enzymlösung und zu einer verringerten Leistung des Enzyms führen kann). </li><li> Mischen Sie den Schlauch vorsichtig zu mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator / Schüttler mit Orbital bei 150 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Vortex das Rohr wieder und kräftig verreiben der Enzymlösung mit dem Gewebe einer 5 ml Pipette weitere Dissoziation zu fördern. </li><li> Übertragen die Zellsuspension in eine 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Während der Zentrifugation mischen 2,7 ml EBSS mit 300 &amp; mgr; l der rekonstituierten Albumin-Ovomucoid Einwibitor Lösung (1.3.1) in ein steriles Röhrchen. In 150 ul der DNase-Lösung (Schritt 1.3.3). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand und Zellpellet mit der Lösung oben hergestellt (Schritt 3.5). Vortex gut das Zellpellet zu brechen. </li><li> 3 ml rekonstituiert Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung (Schritt 1.4.1) zu der Zellsuspension. Zentrifugen Zellen bei 70 x g für 6 Minuten bei RT. Entfernen Sie den Überstand (die Membranfragmente enthält). </li></ol> 4. Weitere Entfernen von Myelin aus der Einzelzellsuspension <ol><li> 8 ml 20% Dichtegradientenmedien (hergestellt in Schritt 1.2.2) in das Rohr das Zellpellet enthält, vortex sanft das Pellet zu stören, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 · g für 30 min bei RT ohne Bremse. Entfernen Sie vorsichtig die oberste Schicht von Schutt (meist Myelin) und der Überstand, aber das Pellet halten. </li><li> So entfernen Sie Reste des Dichtegradienten, waschen Sie die Zellen durch resuspending des Zellpellets mit 8 ml einer verdünnten cDMEM (1 Teil cDMEM und 2 Teile HBSS). Zentrifugieren der Zellen bei 400 xg für 10 min bei 4 o C. Entfernen Sie den Überstand und wasche die Zellen erneut mit dem verdünnten cDMEM (oben) in der gleichen Weise. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis sie Aussaat. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in Kulturmedien (cDMEM geliefert mit 2-ME (hergestellt in Schritt 1.1)). Für eine 12-Well-Platte, verwenden Sie 3 ml x 4 (Anzahl der verwendeten Mäuse) + 2 ml = 14 ml Medien. Dadurch wird sichergestellt, dass eine ausreichende Zellsuspension für die gesamte Platte (12 Vertiefungen) und wird für zusätzliche Vertiefungen schaffen, die verwendet werden können, die durchschnittliche Zellzahl pro Vertiefung und die Mikroglia-Gehalt der Kultur zu bestimmen. Wenn andere Arten von Kulturgefäßen verwendet werden, die Berechnung der Gesamtmenge der benötigten Kulturmedien proportional. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 35,9 o C mit 5% CO 2. </li><lÄndern i&gt; die Medien (entfernen alte Medien über Aspiration) auf D 1 und dann alle 3 - 4 d danach (in der Regel die Medien ändern auf D: 1, 4, 8 und 11, und verwenden Sie dann die Zellen am Tag 12). HINWEIS: Am Tag 1 kann das Kultur erhebliche Mengen an Ablagerungen enthalten aufgrund der Rückstand Myelin aus dem Rückenmarksgewebe; also, die Änderung der Medien am Tag 1 wird empfohlen (bitte die Diskussion für weitere Informationen). Kulturen sind bereit für die Behandlung zwischen D 12 - 14. Die Zellen sind in der Regel 80% konfluenten 12 D und kann durch D 14. Typischerweise in der Nähe von 100% konfluent sein, auf D 12, gibt es etwa 100.000 Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte . </li></ol><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Fig . 2: Repräsentative Bilder von gemischten Gliazellen zu verschiedenen Zeiten nach der Errichtung des gemischten Gliazellen Kultur Primärrückenmark wurden gemischt Glia hergestellt aus adulten C57BL / 6 - Mäusen. Repräsentative Bilderzeigen den Fortschritt der Glia-Kultur nach der Plattierung. Am Tag 1 werden einige Zellen auf der Kulturplatte angebracht, aber sie sind immer noch meist rund. Es gibt auch viele Floating-Zellen und erhebliche Rückstände. Am Tag 4 werden die meisten der Zellen auf der Kulturplatte befestigt. Zellen scheinen mit sichtbaren Prozesse verästelte. Die Zellen werden sporadisch verteilt und Kulturen sind etwa 20-30% konfluent zu diesem Zeitpunkt. Am Tag 8 Kulturen sind zwischen 50-60% konfluent. Einige Bereiche der Kulturen haben große Flecken von Zellen. Andere Bereiche der Kulturen sparse Wachstum von Zellen. Einige Zellen innerhalb der Patches nehmen auf einem &quot;Quadrat-like&quot; Aussehen. Am Tag 12 Kulturen werden bei oder über 80% konfluent (ca. 90% konfluent in dem Bild dargestellt). Die Zellen werden in der Log - Phase des Wachstums in dieser Zeit und zwischen den Tagen 12 bis 14 ist die optimale Zeit für die Gliazellen für Experimente verwenden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier anzuschauen</a>Größere Version der Figur. <ol start="7"><li> Untersuche die Mikroglia - Zellen Inhalt aus den zusätzlichen Vertiefungen (4.3 Schritt) über Standard - Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) Färbeprotokoll 11 unter Verwendung der Kombination von Anti-Maus-CD45 und anti-Maus - CD11b unter Verwendung monoklonaler Antikörper. CD45 + CD11b + Zellen werden als Mikrogliazellen identifiziert. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Es ist wichtig, alle Schritte-einschließlich der Medien zur Durchführung plan in einer konsistenten Art und Weise zu ändern, um zu reproduzierbaren Ergebnissen zwischen den Experimenten erhalten. Die folgenden Schritte sind besonders kritisch in ausgezeichneter Qualität erwachsenen gemischten Glia zu erhalten. Die enzymatische Verdauung ist ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls. Entscheidend ist, dass die Gewebestücke sind gut verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Allerdin...

Chronische Schmerzen sind ein ernstes gesundheitliches Problem , dass etwa 100 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten, mit einem geschätzten jährlichen Kosten von bis zu 635.000.000.000 $ 1 betrifft. Montage Beweise hat einen wesentlichen Beitrag des Rückenmarks Gliazellen bei der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen angegeben, einer der verheerendsten Arten von chronischen Schmerzen 2. Eine geeignete in vitro - Kultursystem würde dazu beitragen , deutlich weiter die Rolle von Gliazellen auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen. Derzeit umfassen die in - vitro - Glia - Kultursystemen von Forschern verwendet hauptsächlich Gliazellen aus Rindengewebe von neugeborenen Maus oder Ratte Gehirn abgeleiteten Zellen und verewigte Linien Gliazellen aus neonatalen Maus abgeleitet oder primäre Gliazellen Ratte. Neonatal Zellen enthalten eine signifikante Anzahl von undifferenzierten Zellen, die in Gliazellen unterschieden werden weiter können (vor allem Astrozyten und Mikroglia), so dass eine Bereitstellung vonbundant Zellen für die experimentelle Verwendung 3. Allerdings hat unsere früheren Studie gezeigt, dass die neonatale Gehirn Gliazellen Rückenmark Gliazellen auf Lipopolysaccharid (LPS) Stimulation signifikant unterschiedlich von Erwachsenen reagiert. Beispielsweise Interleukin (IL) -4 angezeigt verbesserte hemmende Wirkung auf LPS-induzierten Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in adulten Ratten Glia Rückenmark im Vergleich zu neugeborenen Gehirn Glia 4. Des Weiteren sind die Profile der Chemokin - Produktion nach Stimulierung durch ein Neuropeptid, Calcitonin - Gen-verwandtes Peptid (CGRP), unarguably unterschiedlich zwischen neonatalen Mausgehirn Glia (Methods in Ref. 5 beschrieben) und adulten Rückenmark der Maus Glia (Abbildung 1). Etablierte Zelllinien sind leicht zu bedienen und zu warten, und eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeitperiode liefern kann. Im allgemeinen sind immortalisierte Zelllinien erzeugt entweder einen Virus-vermittelte Immortalisierung System (wie beispielsweise die weit verbreiteten Mikroglia - Zelllinie , BV2) 6 unter Verwendung von , 7 oder folgenden the Identifizierung von spontanen Transformation (wie beispielsweise die Astrozyten Zelllinie C8-D1A und Mikroglia - Zelllinie C8-B4) 8, 9 Zellinien sind ausgezeichnet in den molekularen Eigenschaften von Astrozyten und Mikroglia individuell studieren. aber die erhaltenen Ergebnisse aus Zelllinien erfordern immer eine weitere Validierung in primären Zellen oder in in vivo - Bedingungen. Es sollte auch angemerkt werden, dass es keinen Bericht einer glialen Zelllinie wurde, die aus einem Nagetier Rückenmark Gliazellen abgeleitet ist. Um die Rolle des Rückenmarks Gliazellen in der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen untersucht, einem Kultursystem , das aus adulten Rückenmark der Maus abgeleitet ist , wurde durch Anpassung einer zuvor berichteten Verfahren entwickelt worden verwendet erwachsenen Ratte gemischten Gliakulturen 4 erzeugen, 5 . Das Rückenmark glial Kultur Maus wurde weitere kürzlich 10 verfeinert und wird ausführlicher in diesem Artikel beschrieben. Erwachsener Rückenmark gemischt Gliakulturen ceine mit einer Maus aus ausgewählten Stämmen hergestellt werden, die den Bedürfnissen der speziellen Studie passen, und die Zellen können für bis zu 21 d nach Beginn der Kultur in Kultur gehalten werden. Dieses Verfahren kann bei neuropathischen Schmerzstudien verwendet werden, sowie in Untersuchungen von verschiedenen neurologischen Erkrankungen, die pathologischen Veränderungen innerhalb des Rückenmarks, wie amyotropher Lateralsklerose (ALS), human immunodeficiency virus (HIV) -assoziierten sensorische Neuropathie beinhalten, und multiple Sklerose (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modification of Eagle&amp;rsquo;s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 &amp;micro;g/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td></tr><tr><td>Papain dissociation system</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Individual components of this kit can be purchased separately.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td></tr><tr><td>Lab-line incubator/shaker&amp;nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&amp;nbsp;</td><td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides, &lt;em&gt;Salmonella Minnesota&lt;/em&gt; Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 DuoSet ELISA&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY406</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY410</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY466</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse chemokine Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>Accuri C6 flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&amp;nbsp;</td><td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td></tr></tbody></table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

Es wurde gut angenommen, dass das Rückenmark glial Reaktionen wesentlich zur Entwicklung von neuropathischen Schmerzen bei. Enorme Informationen über Gliazellen Aktivitäten auf zellulärer und molekularer Ebene wurde durch in - vitro - Zellkultursystemen erhalten. Die in - vitro - Systemen verwendet werden , umfassen vor allem primäre Gliazellen abgeleitet von Neugeborenen Gehirn Rindengewebe und immortalisierten Zelllinien. Jedoch beziehen sich diese Systeme können nicht die Merkmale des Rückenmarks Gliazellen in vivo. Um die Rollen der Rückenmark Gliazellen in der Entwicklung peripherer Nervenverletzung induzierter neuropathischer Schmerz unter Verwendung eines Kultursystems weiter zu untersuchen , die besser auf die in - vivo - Zustand wiedergibt , hat unserem Labor , ein Verfahren zu etablieren primären Rückenmark gemischten Gliakulturen entwickelt von erwachsene Mäuse. Kurz gesagt, werden Rückenmark von erwachsenen Mäusen und verarbeitet durch Papainverdau durch Myelinentfernung mit einem dens gesammelt, gefolgtkeit-Gradientenmedium. Einzelzellsuspensionen werden kultiviert in vollständigen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (cDMEM) , ergänzt mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) bei 35,9 o C. Diese Kulturbedingungen wurden speziell für das Wachstum von gemischten Gliazellen optimiert. Unter diesen Bedingungen bereit sind Zellen zwischen 12 für Experimente verwendet werden - 14 d (Zellen sind in der Regel in der log-Phase während dieser Zeit) nach der Einrichtung der Kultur (D 0) und 21 in Kulturbedingungen bis zu D gehalten werden. Dieses Kultursystem kann verwendet werden, um die Reaktionen des Rückenmarks Gliazellen bei Stimulierung mit verschiedenen Substanzen und Wirkstoffe zu untersuchen. Neben neuropathischen Schmerzen, kann dieses System verwendet werden, glial Reaktionen in andere Krankheiten zu studieren, die pathologischen Veränderungen des Rückenmarks Gliazellen beinhalten.

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um gemischte Gliazellen von beiden Mäusen und Ratten herzustellen. Die durchschnittliche Gesamtzellzahl pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte auf D 12 nach Beginn der Kultur sollte relativ stabil sein, mit etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung, wenn die Zellen aus Maus-Rückenmark abgeleitet sind. Gliazellen aus diesem Verfahren erhalten wird, kann in Versuchen verwendet werden, die für Erwachsene glial Rückenmark zu prüfen sollen Antworten auf d...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Aufrufe.  University of New England.  Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen. 

Serie: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neurowissenschaften

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Kokulturierung von AdMSCs und Gliazellen zur Reduzierung von Prionen-induzierten Entzündungen

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth factors. These cells show an ability to regulate neuroinflammation in the context of neurodegenerative diseases such as prion disease and other protein misfolding disorders. Prion diseases can be sporadic, acquired, or genetic; they can result from the misfolding and aggregation of the prion protein in the brain. These diseases are invariably fatal, with no available treatments.
One of the earliest signs of disease is the activation of astrocytes and microglia and associated inflammation, which occurs prior to detectable prion aggregation and neuronal loss; thus, the anti-inflammatory and regulatory properties of MSCs can be harvested to treat astrogliosis in prion disease. Recently, we showed that adipose-derived MSCs (AdMSCs) co-cultured with BV2 cells or primary mixed glia reduce prion-induced inflammation through paracrine signaling. This paper describes a reliable treatment using stimulated AdMSCs to decrease prion-induced inflammation.
A heterozygous population of AdMSCs can easily be isolated from murine adipose tissue and expanded in culture. Stimulating these cells with inflammatory cytokines enhances their ability to both migrate toward prion-infected brain homogenate and produce anti-inflammatory modulators in response. Together, these techniques can be used to investigate the therapeutic potential of MSCs on prion infection and can be adapted for other protein misfolding and neuroinflammatory diseases.

Autor im Rampenlicht: Einblick in die Fortschritte in der Forschung zu Prionenkrankheiten

Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AdMSCs) have potent immunomodulatory properties useful for treating diseases associated with inflammation. We demonstrate how to isolate and culture murine AdMSCs and primary mixed glia, stimulate AdMSCs to upregulate anti-inflammatory genes and growth factors, assess migration of AdMSCs, and co-culture AdMSCs with primary mixed prion-infected glia.

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Effiziente Extraktion von Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der adulten Maus

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autor im Rampenlicht: Isolierung von Gliazellen aus dem Rückenmark der adulten Maus 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien