Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

Das folgende Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von New England zugelassen. Das folgende Protokoll ist für Glia-Kulturen von 4 erwachsenen Maus Rückenmark vor. 1. Herstellung von Lösungen in einer Kultur Hood unter aseptischen Bedingungen <ol><li> Bereiten Kulturmedien: alle Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (cDMEM), enthaltend DMEM (mit 4,5 g / L Glucose), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin , 250 ng / ml Amphotericin B und 50 &amp; mgr; M 2-Mercaptoethanol (2-ME, siehe 1.1.1). Mischen Sie und filtern alle anderen Komponenten zu sterilisieren und dann FBS hinzufügen. Bewahren Sie die Kulturmedien bei 4 o C <ol><li> Bereiten Sie 50 mM 2-ME / Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) Stammlösung: 100 l konzentriert 2-ME (14,3 M) in 28,6 ml 1x PBS und Filter zu sterilisieren (die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden mehrere Monate). Use 1 ml 2-ME-Stammlösung für jede 1.000 ml Kulturmedien. </li></ol></li><li> Herstellung des Dichtegradientenmedien <ol><li> Bereiten Sie einen Vorrat isotonische Dichtegradientenmedien Lösung (zB 100% Percoll) von 1 Teil 10x regelmäßigen sterilem PBS und 9 Teile sterile Lager Dichtegradientenmedien (zB Percoll). </li><li> Verdünnen Sie die 100% Dichtegradientenmedien (hergestellt in Abschnitt 1.2.1) mit regelmäßigen 1x steriler PBS mit 20% Dichtegradientenmedien zu machen (zB 10 ml 100% Dichtegradientenmedien mit 40 ml 1x PBS) und speichern sie in 4 o C. Bringen Sie die 20% Dichtegradientenmedien auf Raumtemperatur (RT), bevor die Zellkultur vorbereitet. </li></ol></li><li> Herstellung von Lösungen aus dem Papain Dissoziation System ANMERKUNG: Das System Papain Dissoziation in der Werkstoff - Tabelle identifiziert werden. Andere ähnliche Dissoziation kits (einschließlich zusammengebaut in-house) können ebenfalls verwendet werden. Alle components müssen steril sein. <ol><li> In 32 ml Balanced Salt Solution Earle (EBSS) zum Ovomucoid Hemmittelgemisches (Pulver). </li><li> In 5 ml EBSS einem Papain Fläschchen (Pulver). Platzieren Sie die Papain Phiole in einem 37 ° C Wasserbad für 10 min oder bis das Papain aufgelöst wird. </li><li> In 500 ul EBSS einem DNase Fläschchen (Pulver). Vorsichtig mischen. </li><li> In 250 ul der DNase-Lösung (siehe oben) auf die Papain Fläschchen. </li><li> Berechne die Gesamtmenge der oben Papain / DNase-Gemisch benötigt wird (etwa 800 &amp; mgr; l Papain / DNase Mischung pro Rückenmark der Maus) und übertragen die benötigte Mischung in ein 50 ml-Röhrchen für die Gewebeverdauungs (Schritt 3.2). Bewahren Sie die Überbleibsel in der Originalflasche bei 4 ° C für mindestens zwei Wochen. </li><li> Halten Sie alle Komponenten aus den Kits auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Rückenmark Sammelröhrchen: ein steriles 15 ml-Röhrchen mit 5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; von der Papain Dissoziation System,0; für Rückenmark) und einem sterilen 15 ml-Röhrchen mit 1x PBS (zum Auffüllen der 5-ml-Spritze zu sammeln, siehe Schritt 2.4). Darüber hinaus bereiten eine sterile Petrischale (35 mm oder 60 mm) mit 5 ml HBSS und halten es in der Kultur Kapuze. </li></ol> 2. Spinal Cord-Sammlung HINWEIS: Alle Geräte müssen steril sein. Führen Sie die Sammlung in einem bestimmten Bereich durch die IACUC genehmigt. <ol><li> Beziehen Sie die folgenden Werkzeuge für die Ernte Maus Rückenmark: gerade scharf / stumpf 18 cm chirurgische Schere, ein 12-cm-Standard Skalpell (# 3 fest), Kohlenstoffstahl sterile Skalpellklingen # 10, ein kleines Tier Decapitator, 12-cm-Standard gebogen Zange und eine sterile Nadel 20G auf eine 5-ml-Spritze angebracht ist. </li><li> Euthanize das Tier mit CO 2 und desinfizieren Sie die Mauskopf und den hinteren Bereich mit 70% Ethanol (EtOH). </li><li> Enthaupten Tier mit dem Decapitator. Machen Sie einen mittleren Längsschnitt auf der unteren Rückseite der Muskelschicht zu belichten. Macheneine saubere Durchtrennung durch die wirbel Säule an der Hüfte Ebene (auch durch die Muskelschicht schneiden, die die wirbel Säule umfasst) mit den sterilen gerade chirurgische Scheren (18 cm). </li><li> Legen Sie das Tier auf einem Blatt frischen Einweg-Feger. Schieben Sie die 20 G-Nadel (an einer 5-ml-Spritze gefüllt mit sterilem 1x PBS (Schritt 1.4)) in die Wirbelsäule in Richtung der rostralen Seite. Halten Sie das Tier nach unten fest, und drücken Sie schnell die Spritze. Die gesamte Rückenmark sollten aus dem zervikalen Ende kommen. Sammeln Sie das Rückenmark in das 15 ml-Röhrchen mit HBSS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 für den Rest der Mäuse. Zwischen jedem Tier, Desinfektion aller verwendeten Instrumente mit 70% EtOH. HINWEIS: In der Regel eine einzige 12-Well-Platte für alle 4 Maus Rückenmark festgelegt werden (siehe 4.3). </li></ol> 3. Herstellung der Einzelzellsuspension Hinweis: Führen Sie die Schritte 3 und 4 in einer Kultur Haube alles steril zu halten. <ol><li> Übertragen Sie alle Rückenmark in die HBSS enthaltende Petrischale (Schritt 1.4). Schneiden Sie jede der Rückenmark in viele feine, kleine Stücke mit einer sterilen Schere und Pinzette. Übertragen das Rückenmarksgewebe zu dem 50 ml konischen Röhrchen die vorbereitete Papain / DNase Enzymmischung (Schritt 1.3.5) unter Verwendung einer sterilen Pinzette oder einem 10 ml-Pipette enthält (HBSS vermeiden zu der Enzymmischung hinzufügen, wie dies weiter verdünnt das hergestellte Enzymlösung und zu einer verringerten Leistung des Enzyms führen kann). </li><li> Mischen Sie den Schlauch vorsichtig zu mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator / Schüttler mit Orbital bei 150 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Vortex das Rohr wieder und kräftig verreiben der Enzymlösung mit dem Gewebe einer 5 ml Pipette weitere Dissoziation zu fördern. </li><li> Übertragen die Zellsuspension in eine 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Während der Zentrifugation mischen 2,7 ml EBSS mit 300 &amp; mgr; l der rekonstituierten Albumin-Ovomucoid Einwibitor Lösung (1.3.1) in ein steriles Röhrchen. In 150 ul der DNase-Lösung (Schritt 1.3.3). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand und Zellpellet mit der Lösung oben hergestellt (Schritt 3.5). Vortex gut das Zellpellet zu brechen. </li><li> 3 ml rekonstituiert Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung (Schritt 1.4.1) zu der Zellsuspension. Zentrifugen Zellen bei 70 x g für 6 Minuten bei RT. Entfernen Sie den Überstand (die Membranfragmente enthält). </li></ol> 4. Weitere Entfernen von Myelin aus der Einzelzellsuspension <ol><li> 8 ml 20% Dichtegradientenmedien (hergestellt in Schritt 1.2.2) in das Rohr das Zellpellet enthält, vortex sanft das Pellet zu stören, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 · g für 30 min bei RT ohne Bremse. Entfernen Sie vorsichtig die oberste Schicht von Schutt (meist Myelin) und der Überstand, aber das Pellet halten. </li><li> So entfernen Sie Reste des Dichtegradienten, waschen Sie die Zellen durch resuspending des Zellpellets mit 8 ml einer verdünnten cDMEM (1 Teil cDMEM und 2 Teile HBSS). Zentrifugieren der Zellen bei 400 xg für 10 min bei 4 o C. Entfernen Sie den Überstand und wasche die Zellen erneut mit dem verdünnten cDMEM (oben) in der gleichen Weise. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis sie Aussaat. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in Kulturmedien (cDMEM geliefert mit 2-ME (hergestellt in Schritt 1.1)). Für eine 12-Well-Platte, verwenden Sie 3 ml x 4 (Anzahl der verwendeten Mäuse) + 2 ml = 14 ml Medien. Dadurch wird sichergestellt, dass eine ausreichende Zellsuspension für die gesamte Platte (12 Vertiefungen) und wird für zusätzliche Vertiefungen schaffen, die verwendet werden können, die durchschnittliche Zellzahl pro Vertiefung und die Mikroglia-Gehalt der Kultur zu bestimmen. Wenn andere Arten von Kulturgefäßen verwendet werden, die Berechnung der Gesamtmenge der benötigten Kulturmedien proportional. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 35,9 o C mit 5% CO 2. </li><lÄndern i&gt; die Medien (entfernen alte Medien über Aspiration) auf D 1 und dann alle 3 - 4 d danach (in der Regel die Medien ändern auf D: 1, 4, 8 und 11, und verwenden Sie dann die Zellen am Tag 12). HINWEIS: Am Tag 1 kann das Kultur erhebliche Mengen an Ablagerungen enthalten aufgrund der Rückstand Myelin aus dem Rückenmarksgewebe; also, die Änderung der Medien am Tag 1 wird empfohlen (bitte die Diskussion für weitere Informationen). Kulturen sind bereit für die Behandlung zwischen D 12 - 14. Die Zellen sind in der Regel 80% konfluenten 12 D und kann durch D 14. Typischerweise in der Nähe von 100% konfluent sein, auf D 12, gibt es etwa 100.000 Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte . </li></ol><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Fig . 2: Repräsentative Bilder von gemischten Gliazellen zu verschiedenen Zeiten nach der Errichtung des gemischten Gliazellen Kultur Primärrückenmark wurden gemischt Glia hergestellt aus adulten C57BL / 6 - Mäusen. Repräsentative Bilderzeigen den Fortschritt der Glia-Kultur nach der Plattierung. Am Tag 1 werden einige Zellen auf der Kulturplatte angebracht, aber sie sind immer noch meist rund. Es gibt auch viele Floating-Zellen und erhebliche Rückstände. Am Tag 4 werden die meisten der Zellen auf der Kulturplatte befestigt. Zellen scheinen mit sichtbaren Prozesse verästelte. Die Zellen werden sporadisch verteilt und Kulturen sind etwa 20-30% konfluent zu diesem Zeitpunkt. Am Tag 8 Kulturen sind zwischen 50-60% konfluent. Einige Bereiche der Kulturen haben große Flecken von Zellen. Andere Bereiche der Kulturen sparse Wachstum von Zellen. Einige Zellen innerhalb der Patches nehmen auf einem &quot;Quadrat-like&quot; Aussehen. Am Tag 12 Kulturen werden bei oder über 80% konfluent (ca. 90% konfluent in dem Bild dargestellt). Die Zellen werden in der Log - Phase des Wachstums in dieser Zeit und zwischen den Tagen 12 bis 14 ist die optimale Zeit für die Gliazellen für Experimente verwenden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier anzuschauen</a>Größere Version der Figur. <ol start="7"><li> Untersuche die Mikroglia - Zellen Inhalt aus den zusätzlichen Vertiefungen (4.3 Schritt) über Standard - Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) Färbeprotokoll 11 unter Verwendung der Kombination von Anti-Maus-CD45 und anti-Maus - CD11b unter Verwendung monoklonaler Antikörper. CD45 + CD11b + Zellen werden als Mikrogliazellen identifiziert. </li></ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Es ist wichtig, alle Schritte-einschließlich der Medien zur Durchführung plan in einer konsistenten Art und Weise zu ändern, um zu reproduzierbaren Ergebnissen zwischen den Experimenten erhalten. Die folgenden Schritte sind besonders kritisch in ausgezeichneter Qualität erwachsenen gemischten Glia zu erhalten. Die enzymatische Verdauung ist ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls. Entscheidend ist, dass die Gewebestücke sind gut verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Allerdin...

Chronische Schmerzen sind ein ernstes gesundheitliches Problem , dass etwa 100 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten, mit einem geschätzten jährlichen Kosten von bis zu 635.000.000.000 $ 1 betrifft. Montage Beweise hat einen wesentlichen Beitrag des Rückenmarks Gliazellen bei der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen angegeben, einer der verheerendsten Arten von chronischen Schmerzen 2. Eine geeignete in vitro - Kultursystem würde dazu beitragen , deutlich weiter die Rolle von Gliazellen auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen. Derzeit umfassen die in - vitro - Glia - Kultursystemen von Forschern verwendet hauptsächlich Gliazellen aus Rindengewebe von neugeborenen Maus oder Ratte Gehirn abgeleiteten Zellen und verewigte Linien Gliazellen aus neonatalen Maus abgeleitet oder primäre Gliazellen Ratte. Neonatal Zellen enthalten eine signifikante Anzahl von undifferenzierten Zellen, die in Gliazellen unterschieden werden weiter können (vor allem Astrozyten und Mikroglia), so dass eine Bereitstellung vonbundant Zellen für die experimentelle Verwendung 3. Allerdings hat unsere früheren Studie gezeigt, dass die neonatale Gehirn Gliazellen Rückenmark Gliazellen auf Lipopolysaccharid (LPS) Stimulation signifikant unterschiedlich von Erwachsenen reagiert. Beispielsweise Interleukin (IL) -4 angezeigt verbesserte hemmende Wirkung auf LPS-induzierten Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in adulten Ratten Glia Rückenmark im Vergleich zu neugeborenen Gehirn Glia 4. Des Weiteren sind die Profile der Chemokin - Produktion nach Stimulierung durch ein Neuropeptid, Calcitonin - Gen-verwandtes Peptid (CGRP), unarguably unterschiedlich zwischen neonatalen Mausgehirn Glia (Methods in Ref. 5 beschrieben) und adulten Rückenmark der Maus Glia (Abbildung 1). Etablierte Zelllinien sind leicht zu bedienen und zu warten, und eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeitperiode liefern kann. Im allgemeinen sind immortalisierte Zelllinien erzeugt entweder einen Virus-vermittelte Immortalisierung System (wie beispielsweise die weit verbreiteten Mikroglia - Zelllinie , BV2) 6 unter Verwendung von , 7 oder folgenden the Identifizierung von spontanen Transformation (wie beispielsweise die Astrozyten Zelllinie C8-D1A und Mikroglia - Zelllinie C8-B4) 8, 9 Zellinien sind ausgezeichnet in den molekularen Eigenschaften von Astrozyten und Mikroglia individuell studieren. aber die erhaltenen Ergebnisse aus Zelllinien erfordern immer eine weitere Validierung in primären Zellen oder in in vivo - Bedingungen. Es sollte auch angemerkt werden, dass es keinen Bericht einer glialen Zelllinie wurde, die aus einem Nagetier Rückenmark Gliazellen abgeleitet ist. Um die Rolle des Rückenmarks Gliazellen in der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen untersucht, einem Kultursystem , das aus adulten Rückenmark der Maus abgeleitet ist , wurde durch Anpassung einer zuvor berichteten Verfahren entwickelt worden verwendet erwachsenen Ratte gemischten Gliakulturen 4 erzeugen, 5 . Das Rückenmark glial Kultur Maus wurde weitere kürzlich 10 verfeinert und wird ausführlicher in diesem Artikel beschrieben. Erwachsener Rückenmark gemischt Gliakulturen ceine mit einer Maus aus ausgewählten Stämmen hergestellt werden, die den Bedürfnissen der speziellen Studie passen, und die Zellen können für bis zu 21 d nach Beginn der Kultur in Kultur gehalten werden. Dieses Verfahren kann bei neuropathischen Schmerzstudien verwendet werden, sowie in Untersuchungen von verschiedenen neurologischen Erkrankungen, die pathologischen Veränderungen innerhalb des Rückenmarks, wie amyotropher Lateralsklerose (ALS), human immunodeficiency virus (HIV) -assoziierten sensorische Neuropathie beinhalten, und multiple Sklerose (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

Es wurde gut angenommen, dass das Rückenmark glial Reaktionen wesentlich zur Entwicklung von neuropathischen Schmerzen bei. Enorme Informationen über Gliazellen Aktivitäten auf zellulärer und molekularer Ebene wurde durch in - vitro - Zellkultursystemen erhalten. Die in - vitro - Systemen verwendet werden , umfassen vor allem primäre Gliazellen abgeleitet von Neugeborenen Gehirn Rindengewebe und immortalisierten Zelllinien. Jedoch beziehen sich diese Systeme können nicht die Merkmale des Rückenmarks Gliazellen in vivo. Um die Rollen der Rückenmark Gliazellen in der Entwicklung peripherer Nervenverletzung induzierter neuropathischer Schmerz unter Verwendung eines Kultursystems weiter zu untersuchen , die besser auf die in - vivo - Zustand wiedergibt , hat unserem Labor , ein Verfahren zu etablieren primären Rückenmark gemischten Gliakulturen entwickelt von erwachsene Mäuse. Kurz gesagt, werden Rückenmark von erwachsenen Mäusen und verarbeitet durch Papainverdau durch Myelinentfernung mit einem dens gesammelt, gefolgtkeit-Gradientenmedium. Einzelzellsuspensionen werden kultiviert in vollständigen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (cDMEM) , ergänzt mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) bei 35,9 o C. Diese Kulturbedingungen wurden speziell für das Wachstum von gemischten Gliazellen optimiert. Unter diesen Bedingungen bereit sind Zellen zwischen 12 für Experimente verwendet werden - 14 d (Zellen sind in der Regel in der log-Phase während dieser Zeit) nach der Einrichtung der Kultur (D 0) und 21 in Kulturbedingungen bis zu D gehalten werden. Dieses Kultursystem kann verwendet werden, um die Reaktionen des Rückenmarks Gliazellen bei Stimulierung mit verschiedenen Substanzen und Wirkstoffe zu untersuchen. Neben neuropathischen Schmerzen, kann dieses System verwendet werden, glial Reaktionen in andere Krankheiten zu studieren, die pathologischen Veränderungen des Rückenmarks Gliazellen beinhalten.

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um gemischte Gliazellen von beiden Mäusen und Ratten herzustellen. Die durchschnittliche Gesamtzellzahl pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte auf D 12 nach Beginn der Kultur sollte relativ stabil sein, mit etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung, wenn die Zellen aus Maus-Rückenmark abgeleitet sind. Gliazellen aus diesem Verfahren erhalten wird, kann in Versuchen verwendet werden, die für Erwachsene glial Rückenmark zu prüfen sollen Antworten auf d...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Aufrufe.  University of New England.  Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen. 

Serie: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Elektromagnetisch gesteuertes Closed-Head-Modell für leichtes Schädel-Hirn-Trauma bei Mäusen

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...