Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem Singapur Bildungsministerium (MOE, Grant-Nummer 2013-T2-2-126) und das National Institute of Health, USA finanziert (NIH gewähren Nummer 1R21AT008452-01A1). TY erhielt ein Diplom-Stipendium der NUS Department of Biological Sciences. Wir danken der konfokalen Einheit der NUS Zentrum für Bioimaging Sciences (CBIS) für ihre ständige Unterstützung.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokolle der National University of Singapore (R14-293) durchgeführt. 1. Fischhaltung und die Sammlung von Embryonen <ol><li> Heben Sie WT, cSt: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 und osx: mCherry 21 ein- oder Verbindung transgenen Medaka Fisch bei 26 ° C unter einem gesteuerten Lichtzyklus (14 h Licht, 10 h Dunkelheit) zu induzieren Laichen. </li><li> Täglich Laich findet während der ersten 30 Minuten, nachdem das Licht eingeschaltet wird. Die Eier halten zusammen durch Filamente und zu den weiblichen Bauch für mehrere Stunden befestigen. Verwenden Sie ein feinmaschiges Netz mit einer weiblichen Erwachsenen trägt ein Ei-Cluster zu fangen. Lassen Sie die Fische kurz im Netz ruhen und dann sanft massieren den Bauch der Fische vorsichtig die befruchtete Eizelle Cluster aus dem Bauch des Weibchens abzustreifen. HINWEIS: Eine gesunde Medaka weiblichfür ca. 5 Monate 20 Eier pro Tag - können 10 produzieren. </li><li> Legen Sie die Eier in eine 60 mm Petrischale aus Kunststoff. Verwenden einer Plastikpipette die Embryonen mit 5 auszuspülen - 10 ml 0,3x Danieau-Lösung (Fischmedium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCl, 0,13 mM MgSO 4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 und 1,7 mM HEPES, pH 7.0). 1 ml einer 0,25% (w / v) Methylenblau-Stammlösung auf 2,5 L Fischmedium Pilzwachstum zu verhindern. </li><li> Sanft Ei Cluster rollen einen Knoten der Befestigung Filamente zu bilden. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Befestigungsfäden aus der befruchteten Eizelle Cluster entfernen , um einzelne Embryonen (1A) erhalten. </li><li> Bühne , um die Embryonen nach Iwamatsu 2004 13. </li><li> Kultur 20 bis 30 Embryonen pro 60 mm Kunststoff-Petrischale in einem 28 ° C Inkubator. Ändern, um die mittlere tägliche normale Entwicklung des Embryos zu gewährleisten. HINWEIS: Die Zeit um die Schraffur Stufe (8 - 9 d postfertilization,DPF) ist besonders kritisch für das Überleben. Entfernen Chorion frei schwebenden das Medium sauber zu halten und um eine gute Larvenüberlebensraten. </li></ol> 2. Transgene Embryo Screening <ol><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer Quecksilberlampe ausgestattet für Fluoreszenz-Imaging und GFP, RFP und GFP Filter transgenen Embryonen für Fluoreszenzreporter-Expression mit 40-facher Vergrößerung zu screenen. </li><li> Identifizieren Visuell osx: mCherry Embryonen durch mCherry Reporter Ausdruck in der frühen Bildung Schädelknochen, wie die Cleithrum, auf beiden Seiten des hinteren Kopf (Abbildung 1B, Pfeil), und der Parasphenoid, an einer zentralen Stelle im ventralen Schädel ( 1B, Pfeilspitze). HINWEIS: Reporter Ausdruck beginnt ab 5 DPF ab 21. </li><li> Identifizieren cSt: nlGFP Embryonen , die durch starke nlGFP Ausdruck im Kopf (1C, Pfeil) und Schwanz (1C, Pfeilspitze), ausgehend von6 DPF. HINWEIS: Endogene Osteoklasten erst nach 21 DPF bilden. nlGFP-exprimierenden Zellen in diesem frühen Stadium (6 DPF) nicht Osteoklasten aber auch andere, bisher nicht charakterisierten, CTSK -positiven Zellen 24. </li><li> Identifizieren RANKL: HSE: GFP transgenen Embryonen , die durch allgegenwärtige GFP - Expression nach einer kurzen Hitzeschockbehandlung für 20 min bei 39 ° C, bei 2 DPF durchgeführt oder später für Screening - Zwecken. HINWEIS: Die RANKL und CFP Transgene stehen unter der Kontrolle des gleichen bidirektionalen Heat Shock Element (HSE). GFP - Expression zeigt die erfolgreiche RANKL Induktion 24. </li><li> Durchführen einer 1,5-2 h Hitzeschockbehandlung bei 9 DPF oder später eine große Anzahl von ektopischen Osteoklasten im Rumpfbereich zu induzieren, die folglich in einem Osteoporose-ähnlichen Phänotyp führt 24. HINWEIS: Die transgene Expression RANKL induziert bei 9 DPF führt zu einer ektopischen Aktivierung ruhender Osteoklasten-Vorläuferzellen, die endogen nicht ausgelöst wirdvor 21 DPF. Verwenden Sie ein Wasserbad stabil 39 ° C Bedingungen zu erhalten. Lassen Sie die Petrischale mit Medaka Embryonen auf der Wasseroberfläche schwimmen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Petrischale ist trocken die Versenkung der Schale zu verhindern. </li><li> Bildschirm Embryonen aus Verbindung Linien, wie RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP doppelt transgenen und osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP triple-transgenen nach dem Expressionsmuster jedes einzelnen Transgen. HINWEIS: Hemizygote und homozygote wurden transgene Embryonen, die durch unterschiedliche Fluoreszenzwerte des Reporter-Transgen aus. Homozygote Embryonen hatten eine Fluoreszenzintensität, die ungefähr doppelt so im Vergleich zu der hemizygous transgenics. Compound Linien , die für beide RANKL homozygot waren: HSE: CFP und cSt: nlGFP wurden durch wiederholte erhalten mehrere Generationen Einkreuzung über. Für Triple-transgenen osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP Fisch,<html> homozygot RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP Fische wurden mit homozygot osx gekreuzt: mCherry Träger. Die resultierende heterozygote triple-transgenen Nachkommen wurden angehoben und incrossed Embryonen für RANKL homozygot zu erhalten: HSE: GFP. Die RANKL: HSE: GFP - Transgen muss, um homozygot sein , um die effiziente Induktion der ektopischen Osteoklasten zu erhalten. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Abbildung 1: WT und transgener Medaka Embryonen bei 7 D Postfertilization (DPF). A. WT Embryonen mit Hellfeldbeleuchtung beobachtet. B. Transgene Embryonen zeigt osx: mCherry Ausdruck um den Cleithrum (Pfeil) und Parasphenoid (Pfeilspitze). C. Transgene Embryonen zeigt cSt: nlGFP Ausdruck im Kopf (Pfeil) und Schwanz (Pfeilspitze). Maßstabsbalken: 500 &amp; mgr; m.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 3. Bisphosphonat Behandlung von Medaka Larvae <ol><li> Herstellung von Lösungen, die verschiedene Konzentrationen an Bisphosphonaten (BPs) zur Dosis-Wirkungs-Studien. HINWEIS: Die beispielhafte BP in diesem Protokoll verwendet ist Alendronat. <ol><li> Löse Alendronat in Fisch Medium in einer Konzentration von 100 ug / ml einer Stammlösung herzustellen. </li><li> Mit einem Wirbelmischer eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Bewahren Sie die Stammlösung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten verschiedene Arbeitslösungen durch Verdünnen der Stammlösung mit Fisch Medium zu einer Reihe von Konzentrationen (dh, 25, 37,5, 50, 62,5 und 75 &amp; mgr; g / ml). HINWEIS: Verschiedene Medikamente können unterschiedliche Absorption, Verteilung, Metabolismus haben und Ausscheidung (ADME) Parameter, die während des Tests mit dieser Medaka Larven System berücksichtigt werden müssen. Auch Arzneistofflöslichkeit und Stabilität kann variieren, wennals wässrige Lösung aufgetragen. Weniger wasserlösliche Verbindungen können müssen zunächst in organischen Lösungsmitteln, wie DMSO, gelöst werden. In diesem Fall wird eine Stammlösung in DMSO hergestellt, die weiter wird dann in Fischmedium verdünnt. Beachten Sie, dass die Arbeitslösungen in Wasser (Fisch mittel) kann im Kühlschrank für mehrere wk gespeichert werden. Jedoch DMSO enthaltende Lösungen müssen bei RT gelagert werden, um Kristallisation zu verhindern. </li></ol></li><li> Transfer Medaka Larven in Sechs-Well-Platten (sechs Larven / Vertiefung) für nachfolgende BP (Alendronat) Behandlung. </li><li> Entfernen Sie den Fisch Medium vorsichtig mit einem sauberen Plastikpipette und fügen Sie ein kleines Volumen (ca.. 0,5 ml) von Alendronat-Lösung in jede Vertiefung. </li><li> Vermeiden Sie übrig gebliebenen Fischmedium, wie der zusätzliche BP Lösung könnte verdünnt werden, was besonders wichtig ist für weniger konzentriert Alendronat-Lösungen. </li><li> Entfernen Sie ein kleines Volumen von Alendronat-Lösung (bis zu 0,5 ml) von jeder Vertiefung mit einem sauberen Plastikpipette und ersetzen Sie es mit einem größeren Volume (4 ml) von Alendronat-Lösung. </li><li> Ändern Medium täglich normalen Embryonen Entwicklung zu gewährleisten. </li></ol> 4. Live-Färbung von mineralisierte Knochenmatrix <ol><li> Man löst 0,5 g Alizarin-Komplexon (ALC, Alizarin-3-Methyliminodiessigsäure) oder 0,05 g von Calcein in 50 ml Fischmedium 1% und 0,1% ige Stammlösungen herzustellen, respectively. Mit einem Wirbelmischer eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. HINWEIS: Fisch Medium ohne Zusatz von Methylenblau wird in diesem und in den nachfolgenden Schritten verwendet Autofluoreszenz in den Larven zu reduzieren. </li><li> Verwenden Sie eine Spritze und Einwegfilter (0,2 &amp; mgr; m), um die Farblösung zu filtern. Bewahren Sie die gefilterten Lösung im Dunkeln bei RT. HINWEIS: Die Farbe des gefilterten, klare ALC-Färbelösung ist dunkelgelb bis orange. Die Farbe des gefilterten, klar Calcein Lösung ist leuchtend gelb. Lösungen können für mehrere Monate verwendet werden. </li><li> Verdünnen Sie die gefilterten ALC oder Calcein Stammlösung 1:10 in Fisch Mediumund brüten die Medaka Larven für 1,5 bis 2 h (0,1% ALC-Lösung) oder 2-2,5 h (0,01% Calcein-Lösung) in einem 28 ° C Inkubator, wenn Larven zwischen 9 und 17 DPF verwendet werden. Halten Sie die Proben im Dunkeln. </li><li> Übertragen Sie die Larven zu frischem Fisch Medium, das eine saubere Plastikpipette. </li><li> Entfernen Sie den Fisch Medium mit einem sauberen Plastikpipette und fügen Sie frischen Fisch Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 bis 4-mal, bis keine rot- oder gelb-gefärbte Lösung (ALC oder Calcein, beziehungsweise) übrig bleiben. Lassen Sie die Larven in Fisch Medium für 30 - 60 Minuten vor dem sie für die Bildgebung zu vermeiden Epifluoreszenz aus dem Medium Montage. HINWEIS: 0,1% ALC-Färbelösung ist schädlich für die Medaka Larven für längere Belichtungszeiten. Inkubationszeiten von mehr als 2 h beeinflussen das Überleben der Larven. Konzentration und Färbezeit müssen daher für verschiedene Stufen optimiert werden, um eine optimale Embryo Überleben und Färbung Ergebnisse zu erzielen. </li></ol> 5. Live-Fluoreszenz-Imaging </<html> p&gt; <ol><li> Anesthetize die Medaka Larven mit 0,01% Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat methansulfonat) in Fisch Medium. HINWEIS: Narkotisierte Larven immobilisiert werden nach 5 - 10 min in Tricaine Lösung und sind in der Regel liegen entweder auf ihren Seiten oder den Rücken. </li><li> Verwenden Sie einen Kunststoff Micro die Larven zu orientieren nach der Region von Interesse. Die Orientierung der Larven in diesem Protokoll verwendet ist lateral. </li><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit Fluoreszenzbeleuchtung für die Bildgebung. Verwenden hoher Vergrößerung, wenn die Aufnahme von Bildern, auf verschiedenen Teilen der Larven Fokussierung (Kopf, vordere Rumpf, hintere Rumpf und Schwanz). Sticheinzelbilder zusammen an überlappenden Bereichen unter Verwendung eines geeigneten Bildverarbeitungssoftware (Einfügungen in Figur 3G). HINWEIS: Dies hilft, die Bildqualität aller relevanten Körperteile in der richtigen Brennebene zu verbessern. </li><li> Bringen Sie die Larven zum Fisch Medium für die Erholung nach der Abbildung. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Live-konfokale Imaging <ol><li> Anesthetize die Larven mit 0,01% Tricaine in Fisch Medium 5 - 10 min, bis sie immobilisiertem werden. </li><li> Auflösen niedrigschmelzenden Agarose zu 1,5% in Fischmedium durch sie in einem Mikrowellenofen erhitzt wird. Kühle die Lösung auf etwa 30 ° C. </li><li> In 0,5-1 ml Flüssigkeit 1,5% niedrig schmelzenden Agarose in Fischmedium zu einem Glasboden-Petrischale. Übertragen Sie die betäubten Larven in die Lösung eine saubere Plastikpipette. HINWEIS: Besondere Vorsichtsmaßnahme, dass die Temperatur der Flüssigkeit mit niedrigem Schmelz Agarose niedrig genug ist, nicht die Larven zu schaden. </li><li> Bevor die Agarose erstarrt, mit einem Kunststoff Micro die Larven auf den Boden der Petrischale zu schieben und zu orientieren, die Larven nach der Region von Interesse. Die Orientierung der Larven in diesem Protokoll verwendet ist lateral. HINWEIS: Die Proben sind bereit für die konfokale Live-Bildgebung, nachdem die Agarose vollständig erstarrt. </li><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop zu ACQuire Bilder. </li><li> Verwenden Sie einen 543-nm-Laserlinie für mCherry und ALC-Färbung analysiert. Verwenden Sie einen 488-nm-Laserlinie für nlGFP und Calcein-Färbung analysiert. </li><li> Nach der Bebilderung Fischmedium auf die Petrischale hinzufügen und ein Paar von feinen Injektionsnadeln (27 G x 1 ½ &quot;) verwenden, um sorgfältig die Larven aus der Agarose zu entfernen. Übertragen Sie die Larven mit residually Agarose gebunden in eine Petrischale mit Fisch Medium zu erholen . </li><li> Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware 27 verwendet wird . </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine oder finanzielle Interessen haben.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Es ist wichtig, dass die Bedingungen für die Hitzeschockbehandlung sind konsistent und stabil, wenn verschiedene Proben zu vergleichen. Stabile Temperaturbedingungen garantieren ähnliche Niveaus von RANKL - Induktion in transgenen Larven und damit vergleichbar Osteoklastenbildung, die durch Screenen auf cSt bestätigt werden kann: nlGFP Ausdruck. Letztendlich führt dies zu einem ähnlichen Grad an induzierter ectopic Knochenresorption und ...

Die wirbel Skelett sorgt für eine strukturelle Unterstützung und Schutz von Organen ermöglicht Mobilität und dient als Quelle für Calcium. Im Laufe des Lebens wird die extrazelluläre Knochenmatrix kontinuierlich gedreht über die Knochenstabilität und Steifigkeit zu erhalten. Dieser Prozess erfordert die eng koordinierte Aktivität und das Zusammenspiel von Knochen bildenden Osteoblasten und Knochen-Osteoklasten. Osteoblasten sind von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen abgeleitet und produzieren Kollagen die osteoid zu bilden, die proteinartiges Teil der Knochenmatrix 10. Osteoblasten mit Osteoklasten zusammenwirken , eine ausgewogene Aktivität beider Zelltypen zu erreichen, die Knochenhomöostase 7 zu steuern , erforderlich ist. Aufgrund dieser komplizierten regulatorischen Wechselwirkungen, Antworten auf eine medikamentöse Therapie und Knochenhomöostase nicht voll werden kann unter Verwendung von in vitro - Studien untersucht. Daher gibt es eine starke Nachfrage nach Tiermodellen. Im Vergleich zu den Zellkultur - Einstellungen können in - vivo - Modellen liefernwertvolle Einblicke in die vielzelligen Netzwerke innerhalb des Knochenumgebung. Zahlreiche Mausmodelle existieren für eine Vielzahl von menschlichen Knochenerkrankungen einschließlich Osteoporose 16. Allerdings stellen die Größe und die Zugänglichkeit von Maus-Embryonen erhebliche Einschränkungen für die Live-Darstellung von Skelett Prozesse. Kleinknochenfischen, andererseits dienen als attraktive Alternative für die in vivo Bildgebung. Zebrabärbling (Danio rerio) und Medaka (Oryzias latipes) haben für Skelett-Forschung in den letzten zwei Jahrzehnten beliebte Tiermodelle werden 17, 19, 22, 24. Knochen in Knochenfischen und in Säugetieren ist sehr ähnlich, sowohl auf struktureller und auf physiologischer Ebene und viele der wichtigsten regulatorischen Gene und Signalwege sind 3 konserviert. Wie bei Säugetieren, Knochenfische regulieren sorgfältig die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten 26 Knochenbildung und Resorption zu balancieren. Am wichtigsten ist, die optische Klarheit der fish Larven ermöglicht die Verwendung von Fluoreszenz - Reportern , Knochenzellen und die verkalkten Skelettmatrix 8, 9, 12, 21, 23, die die Beobachtung von zellulären Prozessen in lebenden Tier erleichtert zu etikettieren. Darüber hinaus hat eine Reihe von genetischen Werkzeugen erzeugt worden biomedizinisch relevante Forschung in den Fischen zu erleichtern. Für Medaka insbesondere Verfahren zur gezielten Genveränderung von CRISPR / Cas9 2, Zell-Linie Tracing 6 und ortsspezifische Transgene 14 haben nun weit verbreitet in Gebrauch 15 vor kurzem gegründet und sind sind. Kleine Teleost Larven wurden für chemische Bildschirme, die zur Entdeckung von mehreren pharmakologisch relevanten Wirkstoffe 1, 18 eingesetzt. Fischlarven sind tolerant gegenüber niedrigen Konzentrationen von DMSO und können Verbindungen aus ihren Gewässern zu absorbieren, entweder durch die Haut oder durch den Gastrointestinaltrakt 1, 5. Unser Labor zuvor reported transgenen Medaka Linien, die fluoreszierende Reporter in Knochenzellen unter der Kontrolle von verschiedenen Osteoblasten und Osteoklasten spezifischen Promotoren exprimieren. Dazu gehören vorzeitige Osteoblasten (Kollagen 10a1, Col10a1; osterix, osx) 20, 21, reifen Osteoblasten (Osteocalcin, osc) 27, und Osteoklasten (Cathepsin K, cSt) 24. Wir erzielten auch eine transgene Linie, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator von 24 Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotor exprimiert. Induktion von RANKL in diesem System ergibt die ektopische Bildung von aktiven Osteoklasten. Dies führt zu erhöhten Knochenresorption und eine schwere Osteoporose-ähnlichen Phänotyp, mit drastisch reduziert Mineralisierung in den Wirbelkörpern. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Aktivität der Osteoklasten in diesem Modell kann durch die Bisphosphonate Etidronat und Alendronat blockiert werden, two Medikamente häufig in menschlichen Osteoporose - Therapie, so Medaka als ein geeignetes Modellsystem für Osteoporose 27 zu validieren. Aufgrund ihrer großen Brutgröße, schnelle Entwicklung, und die geringe Größe von Embryonen, sind transgene Medaka Larven in einzigartiger Weise geeignet für die groß angelegte Screening von Osteoporose Medikamente und für die in - vivo - Analyse von Knochenzellverhalten. so können Studien in Medaka effizient Experimente in Zellkulturen und bei Mäusen zu ergänzen, die auf die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und neuartige Therapien für menschliche Knochenerkrankungen abzielen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll Medaka Knochen-Reporter Larven mit dem gemeinsamen Osteoporose-Medikament, Alendronat zu behandeln. Wir beschreiben auch im Detail, wie behandelten Larven montiert sind und für die Live-Darstellung von Knochenmatrix und Knochenzellen hergestellt. Diese Protokolle können leicht auf andere kleine chemische Verbindungen, die entweder Arbeit als Knochen anabole oder antiresorptiv Medikamente angepasst werden. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Knochenbildenden Osteoblasten interagieren mit dem Knochen-Osteoklasten, den Umsatz der Knochenmatrix zu koordinieren und zu Skelett Homöostase Kontrolle zu bringen. Medaka und Zebrafisch-Larven sind weit verbreitet zu analysieren das Verhalten von Knochenzellen während der Knochenbildung, Degeneration und Reparatur verwendet werden. Ihre optische Klarheit ermöglicht die Visualisierung von fluoreszierend markierten Knochenzellen und Fluoreszenz auf die mineralisierte Skelett-Matrix gebunden Farbstoffe. Unser Labor hat transgene Medaka Fisch erzeugt, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotors exprimieren. Ektopische Expression von RANKL ergibt die überschüssige Bildung von aktivierten Osteoklasten, die in reporter Linien mit nlGFP Expression unter der Kontrolle des Cathepsin K (cSt) -Promotor sichtbar gemacht werden kann. RANKL Induktion und ektopische Osteoklastenbildung führt zu schweren Osteoporose-ähnlichen Phänotypen. Verbindung transgenen Medaka lines , die ausdrücken cSt: nlGFP in Osteoklasten sowie mCherry unter der Kontrolle des osterix (OSX) -Promotor in vorzeitigem Osteoblasten, verwendet werden , um die Interaktion beider Zelltypen zu untersuchen. Dies erleichtert die in vivo Beobachtung von Zellverhalten unter den Bedingungen der Knochenabbau und Reparatur. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Systems ein Medikament häufig in menschlichen Osteoporose-Therapie verwendet zu testen und ein Protokoll für Echtzeit-Bildgebung beschrieben. Das Medaka - Modell ergänzt Studien in Zellkultur und Mäuse und bietet ein neuartiges System für die in vivo Analyse der Arzneimittelwirkung im Skelettsystem.

Reichlich Ei Zahlen, sowie die geringe Größe der Larven, machen Medaka ein hervorragendes Modell für Wirkstoff-Screening. Eine einzige Sechs-Well-Platte wurde bis zu 36 Larven zur Kultur verwendet, die statistisch signifikante Daten zu liefern ausreichend war. Ein weiterer großer Vorteil der Verwendung von Fisch für Skelett-Analyse ist die Möglichkeit der Live-Bildgebung zu tun. Die Transparenz von Fischlarven ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen Knochenzellen zu kennzeichnen, sowie die Verwen...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.1K Aufrufe.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Serie: Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Trophoblast-Riesenzellen oder<em&gt; In Vitro</em&gt; Kurzfristige Kulturen von Ectoplacental Cone Explantate

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

C. Elegans Excretory Kanal als Modell für die intrazelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis in einer einzelnen Zelle: Kennzeichnung von GFP-Fusionen, RNAi Interaktion Bildschirm und Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Medikamentöse Behandlung und

Zusammenfassung

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