Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem Singapur Bildungsministerium (MOE, Grant-Nummer 2013-T2-2-126) und das National Institute of Health, USA finanziert (NIH gewähren Nummer 1R21AT008452-01A1). TY erhielt ein Diplom-Stipendium der NUS Department of Biological Sciences. Wir danken der konfokalen Einheit der NUS Zentrum für Bioimaging Sciences (CBIS) für ihre ständige Unterstützung.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokolle der National University of Singapore (R14-293) durchgeführt. 1. Fischhaltung und die Sammlung von Embryonen <ol><li> Heben Sie WT, cSt: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 und osx: mCherry 21 ein- oder Verbindung transgenen Medaka Fisch bei 26 ° C unter einem gesteuerten Lichtzyklus (14 h Licht, 10 h Dunkelheit) zu induzieren Laichen. </li><li> Täglich Laich findet während der ersten 30 Minuten, nachdem das Licht eingeschaltet wird. Die Eier halten zusammen durch Filamente und zu den weiblichen Bauch für mehrere Stunden befestigen. Verwenden Sie ein feinmaschiges Netz mit einer weiblichen Erwachsenen trägt ein Ei-Cluster zu fangen. Lassen Sie die Fische kurz im Netz ruhen und dann sanft massieren den Bauch der Fische vorsichtig die befruchtete Eizelle Cluster aus dem Bauch des Weibchens abzustreifen. HINWEIS: Eine gesunde Medaka weiblichfür ca. 5 Monate 20 Eier pro Tag - können 10 produzieren. </li><li> Legen Sie die Eier in eine 60 mm Petrischale aus Kunststoff. Verwenden einer Plastikpipette die Embryonen mit 5 auszuspülen - 10 ml 0,3x Danieau-Lösung (Fischmedium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCl, 0,13 mM MgSO 4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 und 1,7 mM HEPES, pH 7.0). 1 ml einer 0,25% (w / v) Methylenblau-Stammlösung auf 2,5 L Fischmedium Pilzwachstum zu verhindern. </li><li> Sanft Ei Cluster rollen einen Knoten der Befestigung Filamente zu bilden. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Befestigungsfäden aus der befruchteten Eizelle Cluster entfernen , um einzelne Embryonen (1A) erhalten. </li><li> Bühne , um die Embryonen nach Iwamatsu 2004 13. </li><li> Kultur 20 bis 30 Embryonen pro 60 mm Kunststoff-Petrischale in einem 28 ° C Inkubator. Ändern, um die mittlere tägliche normale Entwicklung des Embryos zu gewährleisten. HINWEIS: Die Zeit um die Schraffur Stufe (8 - 9 d postfertilization,DPF) ist besonders kritisch für das Überleben. Entfernen Chorion frei schwebenden das Medium sauber zu halten und um eine gute Larvenüberlebensraten. </li></ol> 2. Transgene Embryo Screening <ol><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer Quecksilberlampe ausgestattet für Fluoreszenz-Imaging und GFP, RFP und GFP Filter transgenen Embryonen für Fluoreszenzreporter-Expression mit 40-facher Vergrößerung zu screenen. </li><li> Identifizieren Visuell osx: mCherry Embryonen durch mCherry Reporter Ausdruck in der frühen Bildung Schädelknochen, wie die Cleithrum, auf beiden Seiten des hinteren Kopf (Abbildung 1B, Pfeil), und der Parasphenoid, an einer zentralen Stelle im ventralen Schädel ( 1B, Pfeilspitze). HINWEIS: Reporter Ausdruck beginnt ab 5 DPF ab 21. </li><li> Identifizieren cSt: nlGFP Embryonen , die durch starke nlGFP Ausdruck im Kopf (1C, Pfeil) und Schwanz (1C, Pfeilspitze), ausgehend von6 DPF. HINWEIS: Endogene Osteoklasten erst nach 21 DPF bilden. nlGFP-exprimierenden Zellen in diesem frühen Stadium (6 DPF) nicht Osteoklasten aber auch andere, bisher nicht charakterisierten, CTSK -positiven Zellen 24. </li><li> Identifizieren RANKL: HSE: GFP transgenen Embryonen , die durch allgegenwärtige GFP - Expression nach einer kurzen Hitzeschockbehandlung für 20 min bei 39 ° C, bei 2 DPF durchgeführt oder später für Screening - Zwecken. HINWEIS: Die RANKL und CFP Transgene stehen unter der Kontrolle des gleichen bidirektionalen Heat Shock Element (HSE). GFP - Expression zeigt die erfolgreiche RANKL Induktion 24. </li><li> Durchführen einer 1,5-2 h Hitzeschockbehandlung bei 9 DPF oder später eine große Anzahl von ektopischen Osteoklasten im Rumpfbereich zu induzieren, die folglich in einem Osteoporose-ähnlichen Phänotyp führt 24. HINWEIS: Die transgene Expression RANKL induziert bei 9 DPF führt zu einer ektopischen Aktivierung ruhender Osteoklasten-Vorläuferzellen, die endogen nicht ausgelöst wirdvor 21 DPF. Verwenden Sie ein Wasserbad stabil 39 ° C Bedingungen zu erhalten. Lassen Sie die Petrischale mit Medaka Embryonen auf der Wasseroberfläche schwimmen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Petrischale ist trocken die Versenkung der Schale zu verhindern. </li><li> Bildschirm Embryonen aus Verbindung Linien, wie RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP doppelt transgenen und osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP triple-transgenen nach dem Expressionsmuster jedes einzelnen Transgen. HINWEIS: Hemizygote und homozygote wurden transgene Embryonen, die durch unterschiedliche Fluoreszenzwerte des Reporter-Transgen aus. Homozygote Embryonen hatten eine Fluoreszenzintensität, die ungefähr doppelt so im Vergleich zu der hemizygous transgenics. Compound Linien , die für beide RANKL homozygot waren: HSE: CFP und cSt: nlGFP wurden durch wiederholte erhalten mehrere Generationen Einkreuzung über. Für Triple-transgenen osx: mCherry / RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP Fisch,<html> homozygot RANKL: HSE: CFP / cSt: nlGFP Fische wurden mit homozygot osx gekreuzt: mCherry Träger. Die resultierende heterozygote triple-transgenen Nachkommen wurden angehoben und incrossed Embryonen für RANKL homozygot zu erhalten: HSE: GFP. Die RANKL: HSE: GFP - Transgen muss, um homozygot sein , um die effiziente Induktion der ektopischen Osteoklasten zu erhalten. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Abbildung 1: WT und transgener Medaka Embryonen bei 7 D Postfertilization (DPF). A. WT Embryonen mit Hellfeldbeleuchtung beobachtet. B. Transgene Embryonen zeigt osx: mCherry Ausdruck um den Cleithrum (Pfeil) und Parasphenoid (Pfeilspitze). C. Transgene Embryonen zeigt cSt: nlGFP Ausdruck im Kopf (Pfeil) und Schwanz (Pfeilspitze). Maßstabsbalken: 500 &amp; mgr; m.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 3. Bisphosphonat Behandlung von Medaka Larvae <ol><li> Herstellung von Lösungen, die verschiedene Konzentrationen an Bisphosphonaten (BPs) zur Dosis-Wirkungs-Studien. HINWEIS: Die beispielhafte BP in diesem Protokoll verwendet ist Alendronat. <ol><li> Löse Alendronat in Fisch Medium in einer Konzentration von 100 ug / ml einer Stammlösung herzustellen. </li><li> Mit einem Wirbelmischer eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Bewahren Sie die Stammlösung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten verschiedene Arbeitslösungen durch Verdünnen der Stammlösung mit Fisch Medium zu einer Reihe von Konzentrationen (dh, 25, 37,5, 50, 62,5 und 75 &amp; mgr; g / ml). HINWEIS: Verschiedene Medikamente können unterschiedliche Absorption, Verteilung, Metabolismus haben und Ausscheidung (ADME) Parameter, die während des Tests mit dieser Medaka Larven System berücksichtigt werden müssen. Auch Arzneistofflöslichkeit und Stabilität kann variieren, wennals wässrige Lösung aufgetragen. Weniger wasserlösliche Verbindungen können müssen zunächst in organischen Lösungsmitteln, wie DMSO, gelöst werden. In diesem Fall wird eine Stammlösung in DMSO hergestellt, die weiter wird dann in Fischmedium verdünnt. Beachten Sie, dass die Arbeitslösungen in Wasser (Fisch mittel) kann im Kühlschrank für mehrere wk gespeichert werden. Jedoch DMSO enthaltende Lösungen müssen bei RT gelagert werden, um Kristallisation zu verhindern. </li></ol></li><li> Transfer Medaka Larven in Sechs-Well-Platten (sechs Larven / Vertiefung) für nachfolgende BP (Alendronat) Behandlung. </li><li> Entfernen Sie den Fisch Medium vorsichtig mit einem sauberen Plastikpipette und fügen Sie ein kleines Volumen (ca.. 0,5 ml) von Alendronat-Lösung in jede Vertiefung. </li><li> Vermeiden Sie übrig gebliebenen Fischmedium, wie der zusätzliche BP Lösung könnte verdünnt werden, was besonders wichtig ist für weniger konzentriert Alendronat-Lösungen. </li><li> Entfernen Sie ein kleines Volumen von Alendronat-Lösung (bis zu 0,5 ml) von jeder Vertiefung mit einem sauberen Plastikpipette und ersetzen Sie es mit einem größeren Volume (4 ml) von Alendronat-Lösung. </li><li> Ändern Medium täglich normalen Embryonen Entwicklung zu gewährleisten. </li></ol> 4. Live-Färbung von mineralisierte Knochenmatrix <ol><li> Man löst 0,5 g Alizarin-Komplexon (ALC, Alizarin-3-Methyliminodiessigsäure) oder 0,05 g von Calcein in 50 ml Fischmedium 1% und 0,1% ige Stammlösungen herzustellen, respectively. Mit einem Wirbelmischer eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. HINWEIS: Fisch Medium ohne Zusatz von Methylenblau wird in diesem und in den nachfolgenden Schritten verwendet Autofluoreszenz in den Larven zu reduzieren. </li><li> Verwenden Sie eine Spritze und Einwegfilter (0,2 &amp; mgr; m), um die Farblösung zu filtern. Bewahren Sie die gefilterten Lösung im Dunkeln bei RT. HINWEIS: Die Farbe des gefilterten, klare ALC-Färbelösung ist dunkelgelb bis orange. Die Farbe des gefilterten, klar Calcein Lösung ist leuchtend gelb. Lösungen können für mehrere Monate verwendet werden. </li><li> Verdünnen Sie die gefilterten ALC oder Calcein Stammlösung 1:10 in Fisch Mediumund brüten die Medaka Larven für 1,5 bis 2 h (0,1% ALC-Lösung) oder 2-2,5 h (0,01% Calcein-Lösung) in einem 28 ° C Inkubator, wenn Larven zwischen 9 und 17 DPF verwendet werden. Halten Sie die Proben im Dunkeln. </li><li> Übertragen Sie die Larven zu frischem Fisch Medium, das eine saubere Plastikpipette. </li><li> Entfernen Sie den Fisch Medium mit einem sauberen Plastikpipette und fügen Sie frischen Fisch Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 bis 4-mal, bis keine rot- oder gelb-gefärbte Lösung (ALC oder Calcein, beziehungsweise) übrig bleiben. Lassen Sie die Larven in Fisch Medium für 30 - 60 Minuten vor dem sie für die Bildgebung zu vermeiden Epifluoreszenz aus dem Medium Montage. HINWEIS: 0,1% ALC-Färbelösung ist schädlich für die Medaka Larven für längere Belichtungszeiten. Inkubationszeiten von mehr als 2 h beeinflussen das Überleben der Larven. Konzentration und Färbezeit müssen daher für verschiedene Stufen optimiert werden, um eine optimale Embryo Überleben und Färbung Ergebnisse zu erzielen. </li></ol> 5. Live-Fluoreszenz-Imaging </<html> p&gt; <ol><li> Anesthetize die Medaka Larven mit 0,01% Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat methansulfonat) in Fisch Medium. HINWEIS: Narkotisierte Larven immobilisiert werden nach 5 - 10 min in Tricaine Lösung und sind in der Regel liegen entweder auf ihren Seiten oder den Rücken. </li><li> Verwenden Sie einen Kunststoff Micro die Larven zu orientieren nach der Region von Interesse. Die Orientierung der Larven in diesem Protokoll verwendet ist lateral. </li><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit Fluoreszenzbeleuchtung für die Bildgebung. Verwenden hoher Vergrößerung, wenn die Aufnahme von Bildern, auf verschiedenen Teilen der Larven Fokussierung (Kopf, vordere Rumpf, hintere Rumpf und Schwanz). Sticheinzelbilder zusammen an überlappenden Bereichen unter Verwendung eines geeigneten Bildverarbeitungssoftware (Einfügungen in Figur 3G). HINWEIS: Dies hilft, die Bildqualität aller relevanten Körperteile in der richtigen Brennebene zu verbessern. </li><li> Bringen Sie die Larven zum Fisch Medium für die Erholung nach der Abbildung. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Live-konfokale Imaging <ol><li> Anesthetize die Larven mit 0,01% Tricaine in Fisch Medium 5 - 10 min, bis sie immobilisiertem werden. </li><li> Auflösen niedrigschmelzenden Agarose zu 1,5% in Fischmedium durch sie in einem Mikrowellenofen erhitzt wird. Kühle die Lösung auf etwa 30 ° C. </li><li> In 0,5-1 ml Flüssigkeit 1,5% niedrig schmelzenden Agarose in Fischmedium zu einem Glasboden-Petrischale. Übertragen Sie die betäubten Larven in die Lösung eine saubere Plastikpipette. HINWEIS: Besondere Vorsichtsmaßnahme, dass die Temperatur der Flüssigkeit mit niedrigem Schmelz Agarose niedrig genug ist, nicht die Larven zu schaden. </li><li> Bevor die Agarose erstarrt, mit einem Kunststoff Micro die Larven auf den Boden der Petrischale zu schieben und zu orientieren, die Larven nach der Region von Interesse. Die Orientierung der Larven in diesem Protokoll verwendet ist lateral. HINWEIS: Die Proben sind bereit für die konfokale Live-Bildgebung, nachdem die Agarose vollständig erstarrt. </li><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop zu ACQuire Bilder. </li><li> Verwenden Sie einen 543-nm-Laserlinie für mCherry und ALC-Färbung analysiert. Verwenden Sie einen 488-nm-Laserlinie für nlGFP und Calcein-Färbung analysiert. </li><li> Nach der Bebilderung Fischmedium auf die Petrischale hinzufügen und ein Paar von feinen Injektionsnadeln (27 G x 1 ½ &quot;) verwenden, um sorgfältig die Larven aus der Agarose zu entfernen. Übertragen Sie die Larven mit residually Agarose gebunden in eine Petrischale mit Fisch Medium zu erholen . </li><li> Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware 27 verwendet wird . </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine oder finanzielle Interessen haben.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Es ist wichtig, dass die Bedingungen für die Hitzeschockbehandlung sind konsistent und stabil, wenn verschiedene Proben zu vergleichen. Stabile Temperaturbedingungen garantieren ähnliche Niveaus von RANKL - Induktion in transgenen Larven und damit vergleichbar Osteoklastenbildung, die durch Screenen auf cSt bestätigt werden kann: nlGFP Ausdruck. Letztendlich führt dies zu einem ähnlichen Grad an induzierter ectopic Knochenresorption und ...

Die wirbel Skelett sorgt für eine strukturelle Unterstützung und Schutz von Organen ermöglicht Mobilität und dient als Quelle für Calcium. Im Laufe des Lebens wird die extrazelluläre Knochenmatrix kontinuierlich gedreht über die Knochenstabilität und Steifigkeit zu erhalten. Dieser Prozess erfordert die eng koordinierte Aktivität und das Zusammenspiel von Knochen bildenden Osteoblasten und Knochen-Osteoklasten. Osteoblasten sind von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen abgeleitet und produzieren Kollagen die osteoid zu bilden, die proteinartiges Teil der Knochenmatrix 10. Osteoblasten mit Osteoklasten zusammenwirken , eine ausgewogene Aktivität beider Zelltypen zu erreichen, die Knochenhomöostase 7 zu steuern , erforderlich ist. Aufgrund dieser komplizierten regulatorischen Wechselwirkungen, Antworten auf eine medikamentöse Therapie und Knochenhomöostase nicht voll werden kann unter Verwendung von in vitro - Studien untersucht. Daher gibt es eine starke Nachfrage nach Tiermodellen. Im Vergleich zu den Zellkultur - Einstellungen können in - vivo - Modellen liefernwertvolle Einblicke in die vielzelligen Netzwerke innerhalb des Knochenumgebung. Zahlreiche Mausmodelle existieren für eine Vielzahl von menschlichen Knochenerkrankungen einschließlich Osteoporose 16. Allerdings stellen die Größe und die Zugänglichkeit von Maus-Embryonen erhebliche Einschränkungen für die Live-Darstellung von Skelett Prozesse. Kleinknochenfischen, andererseits dienen als attraktive Alternative für die in vivo Bildgebung. Zebrabärbling (Danio rerio) und Medaka (Oryzias latipes) haben für Skelett-Forschung in den letzten zwei Jahrzehnten beliebte Tiermodelle werden 17, 19, 22, 24. Knochen in Knochenfischen und in Säugetieren ist sehr ähnlich, sowohl auf struktureller und auf physiologischer Ebene und viele der wichtigsten regulatorischen Gene und Signalwege sind 3 konserviert. Wie bei Säugetieren, Knochenfische regulieren sorgfältig die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten 26 Knochenbildung und Resorption zu balancieren. Am wichtigsten ist, die optische Klarheit der fish Larven ermöglicht die Verwendung von Fluoreszenz - Reportern , Knochenzellen und die verkalkten Skelettmatrix 8, 9, 12, 21, 23, die die Beobachtung von zellulären Prozessen in lebenden Tier erleichtert zu etikettieren. Darüber hinaus hat eine Reihe von genetischen Werkzeugen erzeugt worden biomedizinisch relevante Forschung in den Fischen zu erleichtern. Für Medaka insbesondere Verfahren zur gezielten Genveränderung von CRISPR / Cas9 2, Zell-Linie Tracing 6 und ortsspezifische Transgene 14 haben nun weit verbreitet in Gebrauch 15 vor kurzem gegründet und sind sind. Kleine Teleost Larven wurden für chemische Bildschirme, die zur Entdeckung von mehreren pharmakologisch relevanten Wirkstoffe 1, 18 eingesetzt. Fischlarven sind tolerant gegenüber niedrigen Konzentrationen von DMSO und können Verbindungen aus ihren Gewässern zu absorbieren, entweder durch die Haut oder durch den Gastrointestinaltrakt 1, 5. Unser Labor zuvor reported transgenen Medaka Linien, die fluoreszierende Reporter in Knochenzellen unter der Kontrolle von verschiedenen Osteoblasten und Osteoklasten spezifischen Promotoren exprimieren. Dazu gehören vorzeitige Osteoblasten (Kollagen 10a1, Col10a1; osterix, osx) 20, 21, reifen Osteoblasten (Osteocalcin, osc) 27, und Osteoklasten (Cathepsin K, cSt) 24. Wir erzielten auch eine transgene Linie, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator von 24 Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotor exprimiert. Induktion von RANKL in diesem System ergibt die ektopische Bildung von aktiven Osteoklasten. Dies führt zu erhöhten Knochenresorption und eine schwere Osteoporose-ähnlichen Phänotyp, mit drastisch reduziert Mineralisierung in den Wirbelkörpern. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Aktivität der Osteoklasten in diesem Modell kann durch die Bisphosphonate Etidronat und Alendronat blockiert werden, two Medikamente häufig in menschlichen Osteoporose - Therapie, so Medaka als ein geeignetes Modellsystem für Osteoporose 27 zu validieren. Aufgrund ihrer großen Brutgröße, schnelle Entwicklung, und die geringe Größe von Embryonen, sind transgene Medaka Larven in einzigartiger Weise geeignet für die groß angelegte Screening von Osteoporose Medikamente und für die in - vivo - Analyse von Knochenzellverhalten. so können Studien in Medaka effizient Experimente in Zellkulturen und bei Mäusen zu ergänzen, die auf die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und neuartige Therapien für menschliche Knochenerkrankungen abzielen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll Medaka Knochen-Reporter Larven mit dem gemeinsamen Osteoporose-Medikament, Alendronat zu behandeln. Wir beschreiben auch im Detail, wie behandelten Larven montiert sind und für die Live-Darstellung von Knochenmatrix und Knochenzellen hergestellt. Diese Protokolle können leicht auf andere kleine chemische Verbindungen, die entweder Arbeit als Knochen anabole oder antiresorptiv Medikamente angepasst werden. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Alendronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4978</td><td></td></tr><tr><td>alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td><td>Sigma</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (1.4.3.67)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta confocal&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser (4.2.0.121)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td></tr><tr><td>Micro-loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 3.0 software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Knochenbildenden Osteoblasten interagieren mit dem Knochen-Osteoklasten, den Umsatz der Knochenmatrix zu koordinieren und zu Skelett Homöostase Kontrolle zu bringen. Medaka und Zebrafisch-Larven sind weit verbreitet zu analysieren das Verhalten von Knochenzellen während der Knochenbildung, Degeneration und Reparatur verwendet werden. Ihre optische Klarheit ermöglicht die Visualisierung von fluoreszierend markierten Knochenzellen und Fluoreszenz auf die mineralisierte Skelett-Matrix gebunden Farbstoffe. Unser Labor hat transgene Medaka Fisch erzeugt, die die Osteoklasten-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-Faktor kappaB Ligand (RANKL) unter der Kontrolle eines Hitzeschock-induzierbaren Promotors exprimieren. Ektopische Expression von RANKL ergibt die überschüssige Bildung von aktivierten Osteoklasten, die in reporter Linien mit nlGFP Expression unter der Kontrolle des Cathepsin K (cSt) -Promotor sichtbar gemacht werden kann. RANKL Induktion und ektopische Osteoklastenbildung führt zu schweren Osteoporose-ähnlichen Phänotypen. Verbindung transgenen Medaka lines , die ausdrücken cSt: nlGFP in Osteoklasten sowie mCherry unter der Kontrolle des osterix (OSX) -Promotor in vorzeitigem Osteoblasten, verwendet werden , um die Interaktion beider Zelltypen zu untersuchen. Dies erleichtert die in vivo Beobachtung von Zellverhalten unter den Bedingungen der Knochenabbau und Reparatur. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Systems ein Medikament häufig in menschlichen Osteoporose-Therapie verwendet zu testen und ein Protokoll für Echtzeit-Bildgebung beschrieben. Das Medaka - Modell ergänzt Studien in Zellkultur und Mäuse und bietet ein neuartiges System für die in vivo Analyse der Arzneimittelwirkung im Skelettsystem.

Reichlich Ei Zahlen, sowie die geringe Größe der Larven, machen Medaka ein hervorragendes Modell für Wirkstoff-Screening. Eine einzige Sechs-Well-Platte wurde bis zu 36 Larven zur Kultur verwendet, die statistisch signifikante Daten zu liefern ausreichend war. Ein weiterer großer Vorteil der Verwendung von Fisch für Skelett-Analyse ist die Möglichkeit der Live-Bildgebung zu tun. Die Transparenz von Fischlarven ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen Knochenzellen zu kennzeichnen, sowie die Verwen...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.2K Aufrufe.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Serie: Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Forschung

Krebsforschung

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Entwicklungsbiologie

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medizin

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Biotechnik

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gentransfer-Technik und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Laserablationsmethode zur Untersuchung der Knochenregeneration bei Zebrafischlarven

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using different methods such as fin amputation, scale plucking, skull trepanation, and microscopic approaches. Using a confocal laser scanning setup equipped with a two-photon laser, a laser ablation method was developed as a lesion paradigm to ablate bone-forming cells (osteoblasts) in the developing opercle of zebrafish larvae. The method described here allows the ablation of cells in a precise manner, as the area, shape, and depth can be finely adjusted. In addition, this method allows imaging of the area before and just after the ablation, so that short-term effects of the injury can be analyzed. In this experimental setup, the immune response after ablation of osteoblasts in the injured area was studied. An increase in the recruitment of macrophages was observed after ablation, indicating the relevance of their presence during bone regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Immunvermittelte Knochenregeneration – Die entscheidende Rolle von Makrophagen und kontrollierter Immunmodulation in restaurativen Prozessen<

This protocol describes a two-photon laser ablation approach carried out in zebrafish larvae, which serves as a model to study bone regeneration and the effects of the immune response to ablation.

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

Medikamentöse Behandlung und

Zusammenfassung

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Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Sequentiell

Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

A Novel

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven