Diese Methode kann helfen, die Knochentoxizität zu erkennen, die durch Chemikalien im Zebrafisch induziert wird. Alizarin Red Die Färbung von festem Gewebe erzeugt eine permanente Aufzeichnung von Skelettveränderungen, die den Vergleich mehrerer Proben erleichtern kann. Diese Technik könnte hilfreich sein, um Osteoporose im Zebrafischmodell zu untersuchen, da eines der Merkmale der Osteoporose die Abnahme der Knochenmasse ist.
Entfernen Sie neun Tage nach der Befruchtung zufällig 10 Zebrafischlarven aus jeder Gruppe und fixieren Sie den Fisch in einem Milliliter 2% paraformem Aldehyd und 1X PBS für zwei Stunden. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Zebrafischlarve mit 100 Millimolar Tris HCL mit einem pH-Wert von 7,5 oder 10 Millimolar Magnesiumchlorid. Zum Entfärben dekantieren Sie die Lösung und inkubieren Sie die Larve fünf Minuten lang in einer Reihe von Lösungen, wie im Manuskript beschrieben.
Nach der letzten Inkubation die Lösung dekantieren und das Pigment durch Bleichen mit einer Lösung aus 3% Wasserstoffperoxid und 0,5% Kaliumhydroxid entfernen. Einmal alle 10 Minuten beobachten, bis das Pigment vollständig entfernt ist. Spülen Sie die Zebrafischlarve mehrmals mit 25% Glycerin, 0,1% Kaliumhydroxid für jeweils 10 Minuten, bis keine Blasen mehr vorhanden sind.
Färbung in der Larve durch Einweichen in einem Milliliter von 0,01% Alizarin. Dekantieren Sie die Lösung und fügen Sie einen Milliliter 50% Glycerin oder 0,1% Kaliumhydroxid hinzu, um den Hintergrund zu entfernen. Lagern Sie den Fisch in frischem 50% Glycerin oder 0,1% Kaliumhydroxid für die anschließende Beobachtung.
Übertragen Sie eine Larve nach der anderen auf den Glasobjektträger, wobei die Larve in der Mitte des Flüssigkeitstropfens bleibt. Beobachten Sie die Larve unter einem Stereomikroskop. Schalten Sie die Kamera ein.
Öffnen Sie die Software und behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Klicken Sie auf AE und wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit, um das beste Bild zu erhalten. Nehmen Sie alle Bilder unter den gleichen Einstellungen auf.
Speichern Sie die Bilder zur späteren Analyse im Dot-tiff-Format. Doppelklicken Sie auf das imageJ-Symbol. Um die gespeicherten Bilder zu analysieren, klicken Sie auf Datei, dann öffnen, dann auf Bild, dann eingeben und wählen Sie Acht-Bit.
Klicken Sie auf Bearbeiten und kehren Sie um. Klicken Sie auf Analysieren, dann auf Kalibrieren. Wählen Sie in der Popup-Oberfläche Unkalibrierte OD aus.
Überprüfen Sie die globale Kalibrierung unten links auf der unteren Benutzeroberfläche und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Analysieren, Skalierung festlegen und dann Skalierung entfernen. Aktivieren Sie unten Global und klicken Sie auf OK.
Klicken Sie auf Analysieren und legen Sie dann Messungen fest. Wählen Sie den Elementbereich in der Popup-Oberfläche aus. Aktivieren Sie den Grenzwert auf den Schwellenwert unten, um nur den ausgewählten Bereich zu messen, und klicken Sie auf OK.
Klicken Sie auf das Bild, passen Sie den Schwellenwert an und schieben Sie den Schieberegler in die Mitte der Popup-Oberfläche. Um den entsprechenden Schwellenwert auszuwählen, damit alle zu testenden Ziele in einem Bild ausgewählt werden. Und klicken Sie auf Festlegen.
Klicken Sie auf Analysieren, dann messen, speichern Sie die Daten. Alizarin Red Staining ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Veränderungen der Knochenmineralisierung in Zebrafischlarven. Neun Tage nach der Befruchtung sind viele Knochen des Kopfskeletts wie Parasphenoid, operkulär, ceratobranchial und Notochord mineralisiert und daher rot gefärbt.
Im Gegensatz dazu erscheinen nicht-knöcherne Strukturen wie Otolithen braunschwarz. Die digitale Analyse, die zur Quantifizierung der gesamten gefärbten Fläche durchgeführt wurde, zeigte eine signifikante Abnahme der gefärbten Fläche für die 10 und 20 Milligramm pro Liter Bleiacetat-Behandlungsgruppen. Die Veränderungen der Knochenmineralisierung zeigten eine Dosisabhängigkeit.
Für eine bessere Färbungswirkung und Beobachtung ist es wichtig, das ursprüngliche Pigment der Zebrafischlarven zu entfernen und die Blasen nach dem Bleichen zu entfernen.
