The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Hebräischen Universität in Jerusalem, Israel (Antrag Nr MD-12-13524-4), ein AAALAC genehmigt Möglichkeiten und durch die Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Antrag Nr 3770). Die Tiere wurden in die strikte Einhaltung von NIH-Richtlinien behandelt. 1. Herstellung von Knochen Allografts <ol><li> Euthanize 7- bis 8 Wochen alte Balb / C-Mäuse, oder keine Belastung vom Empfänger unter Verwendung der Standardmethode von CO 2 Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 50 &amp; mgr; l Phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bestätigen Sie die Abwesenheit von einem Herzschlag und führen Genickbruch. Alternativ ernten die Allotransplantate von Schlachtkörpern in -20 ° C gehalten und aufgetaut vor der Ernte wurden. </li><li> Rasieren Sie die Schädelregion mit einer Haarschneidemaschine, ihre Anwendung gegen die Haarwuchsrichtung. Desinfizieren Sie die Karkasse Kopf durch die Anwendung 70% isopropanol. Schneiden Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell Nr 11 und entfernen Sie die Knochenhaut. </li><li> Mit Hilfe eines Dentalbohrer und eine 4,5-mm-Innendurchmesser trephine, lösen eine kreisförmige Fragment der Schädelknochen. Übertragen Sie das Knochenfragment an ein 100-mm-Kunststoffschale mit steriler Kochsalzlösung. An diesem Punkt zu beachten Blut und Weichgewebe an das Knochenfragment (1A) befestigt ist. Erhalten Knochenfragmente auf diese Weise von 22 Spendern. </li><li> Halten Sie eine Knochenfragment in einer Zeit mit gebogenen Pinzette. Tupfer gründlich mit Wattestäbchen und entfernen Sie das Hirngewebe, Weichgewebe und Blut (1B). Nicht aufgeKnochenChips, die das Transplantat mit einer feinen Schere verbunden bleiben, so dass das Transplantat eine perfekte runde Form haben sanft geschnitten. </li><li> Tauchen jedem Transplantat einmal in einer 15-ml-Röhrchen, das 70% Ethanol und zweimal in 15 ml Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das Ethanol zu waschen. </li><li> Frieren Sie die Allotransplantaten in einem -80 ° C Kühlschrank in Kryoröhrchen beimindestens 1 Woche. Zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die allogene Transplantate transparent (1C) angezeigt. </li></ol> 2. Schädeldachdefektchirurgie <ol><li> Für Empfänger verwenden transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Osteocalcinpromotor 6 auszudrücken. </li><li> Sterilisieren Sie die Spitzen der chirurgische Instrumente unter Verwendung eines Glasperlen Heizung für 30 Sek. Bringen Sie die Werkzeuge, um ein Glas mit 70% Isopropanol, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie sterile Handschuhe. </li><li> Betäuben einen 7- bis 8 Wochen alten weiblichen Maus durch intraperitoneale Injektion einer ketamine- Medetomidin Mischung (75 mg / kg und 1 mg / kg). Drücken Sie den Tierische Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief anästhesiert. Lassen Sie nicht ein Tier unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. </li><li> Rasieren Schädelbereich mit einer Haarschneidemaschine durch Anlegen gegen die Richtung des Haarwachstums. Bewerben Haarentfernungscreme, alle Pelzreste zu entfernen und wischen Sie es after nicht länger als 2 min mit trockenem Mull, gefolgt von Kochsalzlösung getränkter Gaze. Es sollte darauf geachtet werden, zu vermeiden, ist es in den Augen. Alternativ kann der Tierarzt, Augensalbe vor der Haarentfernung als zusätzlichen Schutz für die Augen aufgetragen werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Spuren der Enthaarungscreme, um mögliche Irritationen vor übermäßiger Belastung durch die chemischen Mittel zu vermeiden, entfernt werden. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch die Anwendung von 5% Chlorhexidin (1D). </li><li> Injizieren subkutan 5 mg / kg Carprofen in 200 ul Kochsalzlösung verdünnt. Bewerben vet Augensalbe, um Trockenheit zu verhindern und halten das Tier auf einem Thermal-Pad zu jeder Zeit. Positionieren Sie das Tier unter dem Betriebsfernglas. </li><li> Machen Sie einen 1 cm langen ovalen Schnitt in der Kopfhaut mit einer feinen Schere und Pinzette (1E). Halten Sie die Knochenhaut mit gebogenen Pinzette und schneiden Sie mit einer feinen Schere. </li><li> Bohren Sie das Schädeldefekt 2 mm anterior der Lambdanaht mit Hilfe eines Zahnbohrers einnd 5 mm Außendurchmesser-Trepan (1F und G). Um das Eindringen der Dura mater zu vermeiden, bohren drei Viertel des Weges in den Knochen lösen, dann das Knochenfragment mit einem Spatel. </li><li> Um ein Autograft implantiert werden, rufen Sie die Knochenfragment und waschen Sie ihn in einem 10 mm Kunststoffplatte, die 10 ml steriler Kochsalzlösung, um Schmutz zu entfernen. Die Weichteile nicht entfernen. Um eine Allograft, Tauwetter im Voraus zu implantieren eine Allograft und normalisieren es auf RT und dann waschen Sie. </li><li> Legen Sie das Knochentransplantat in dem Defekt mit gebogenen Pinzette, so wird es nicht berühren die Defektränder (Abbildung 1H). Kleben Sie das Transplantat an den Wirtsknochen mit Fibrin-Gel (5 ul von 46 mg / ml Fibrinogen mit 5 &amp; mgr; l von 25 U / ml Thrombin gemischt). </li><li> Naht der Haut mit 4-0 Vicryl Nahtmaterial (1I). Bewerben PVP-Jod auf die chirurgische Schnitt. Vorsicht ist geboten, um die Kontamination des Fadens von Pelz zu verhindern. Markieren Sie die Mausohr und injizieren 0,25 mg / kg Antisedan to kehren die betäubende Wirkung von Medetomidin. </li><li> Wenn das Tier nicht aufwachen in 10 min, sicherzustellen, dass es auf einem erwärmt Pad entfernt. Injizieren 200 ul steriler Kochsalzlösung, und wenn inject 0,1 mg / kg Antisedan notwendig. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. </li><li> Halten Sie die Tiere in getrennten Käfigen für eine Woche, um sie das Öffnen der Nähte verhindern. Zeigen Mäusefutter in Wasser in einer Petrischale auf dem Käfigboden für ein paar Tage nach der Operation eingeweicht. Injizieren subkutan 200 ul 1 mg / ml-Lösung täglich Carprofen in steriler Salzlösung verdünnt, einmal für 3 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen, zu behandeln. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schädeldecken Allograft Vorbereitung und Schädeldecken Defect Chirurgie. Das Knochenfragment wird aus dem Schädelbereich (A) isoliert. Weichgewebe, Knochenmark und Blut abgetupft (B) und das Transplantat wird in 70% Ethanol, gefolgt von zwei Waschungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (C, AG = Allotransplantat) gespült. Der Empfänger der Maus ist für die Chirurgie nach der Rasur und Desinfektion der Haut im Schädelbereich (D) hergestellt. Ein ovaler Schnitt wird in der Kopfhaut erstellt, und die Knochenhaut entfernt wird (E). Als nächstes wird der Schädeldefekt unter Verwendung einer 5 mm Durchmesser Trepan (F) gebohrt. Das Knochenfragment wird mit einem löffelförmigen Spatel abgelöst, so dass der Sinus sagittalis superior intakt (G). Allotransplantats wird dann in den Defekt eingebracht und unter Verwendung von Fibrin-Gel (H) befestigt ist. Schließlich wird die Haut vernäht (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Mikro-Computertomographie für die Charakterisierung vonGefäßbaumes <ol><li> Bereiten heparinisierter Kochsalzlösung. Gewicht 2.000 U Heparin-Natrium und legen Sie sie in 50 ml Kunststoffröhrchen. In 20 ml Kochsalzlösung und gut schütteln den Schlauch. Füllen Sie einen 20-ml-Luer-Lock-Spritze mit 15 ml erwärmt heparinisierter Kochsalzlösung, und schließen Sie die Spritze mit einer 23-G Kopfhaut Vene gesetzt. Befestigen Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe, und setzen Sie ihn auf 10 ml mit 1 ml / min zu pumpen. </li><li> Sedieren eine Maus unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von 50 ul Phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Klemmen Sie das Tier Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief sediert. Sichern Sie die Maus auf dem Rücken zu einer Fixationsplatte mit einer absorbierenden Oberfläche Liner (2A) gewickelt. Setzen Sie die Fest Maus in einem Abzug des Personals der Exposition gegenüber Rauch zu verhindern. </li><li> Schneiden Sie die Haut aus dem Bauch bis zum Hals mit einer feinen Schere und Pinzette (2B). Schneiden Sie die Bauchwand bis zum Schwertfortsatz (Abbildung 2C). Schneiden Sie den Brustkorb entlang der lateralen Seite. Nicht zu verletzen, die Lunge eined Herz, und stellen Sie sicher, das Herz voll ausgesetzt ist. Verwenden Sie eine Gefäßklemme, um das Brustbein (2D) zurückzuziehen. </li><li> Legen Sie die Butterfly-Nadel 3 mm in den linken Ventrikel (2E). Kleben Sie die Nadel, um das Herz und die Brustwand unter Verwendung von 3-sec Kleber (2F). </li><li> Aktivieren Sie die Pumpe sofort. Nach einer Minute zu sezieren die untere Hohlvene, um das Gefäßsystem (2G) drucklos. Kippen Sie die Platine, so dass Flüssigkeiten vom Kopf weg fließen. Erfolgreiche Perfusion wird bei der Klärung der Leber und der Blutgefäße führen. </li><li> Wenn die heparinisierter Kochsalzlösung Perfusion beendet ist, zu perfundieren 10 ml von 4% Formaldehyd. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen in das Gefäßsystem und die Belastung durch Formaldehyd-Dämpfe zu vermeiden. Erfolgreiche Formaldehyd-Perfusion in Versteifung des Schwanzes führen. Spülen Sie die Formaldehyd mit 10 ml heparinisierter Kochsalzlösung. </li><li> Bereiten Sie die röntgendichten Kontrastmittel nach manufacturer Anweisungen. Typischerweise wird es Mischen der Verbindung, Verdünnungsmittel und einem Härter erforderlich. Verwenden serologischen Pipetten und mischen Sie die Lösung in einer 15 ml Kunststoffröhrchen. </li><li> Perfusion des Tieres mit der Kontrastmittel-Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min. Beachten Sie die koronare, Darm- und Leberblutgefäße und sicherzustellen, dass sie werden gelb nach Perfusion von 2 - 3 ml, was eine erfolgreiche Perfusion (2H). Nach Beendigung der Perfusion, schneiden der Butterfly-Nadel Schläuche, erhalten den Kadaver allein und wickeln Sie es mit Toilettenpapier, um ein Auslaufen der Lösung des Schädelbereich zu verhindern. Erlauben Polymerisation in 4 ° CO / N. </li><li> Präparieren Sie die Schädelregion (2I); Verwenden Sie zuerst ein Skalpell, um die Haut als seitliche wie möglich geschnitten, Vermeidung von Schäden an der Schädel Region von Interesse. Suchen Sie den Knochentransplantat und verwenden Sie dann feinen Schere, um die Schädelknochen 10 mm entfernt von der Pfropf geschnitten. </li><li> Scannen Sie den getrennt Calvarial Knochenprobe unter Verwendung eines μCT-Scanner; eingestellt Sehfeld von 20,5 mm, der Röntgenenergie von 55 kVp, Intensität von 145 &amp; mgr; A mit 1.000 Projektionen pro 360º und Integrationszeit von 200 ms. Passen μCT Parameter 7 bis Bild anderen Knochendefekt-Modelle. </li><li> Beachten Sie die 2D rekonstruierten Schichten, die von der μCT-Software generiert wurden. Stellen Sie sicher zu scannen die Region von Interesse ist richtig und suchen Sie den Schädeldefekt. Bewerten Sie die Qualität der Durchblutung. Nach erfolgreicher Identifizierung von Blutgefäßen (2J), fortzusetzen und zu entkalken die Probe mit 6% Trichloressigsäure (TCA) in doppelt destilliertem Wasser (DDW) verdünnt. </li><li> Rescan die Probe mit den in Abschnitt 3.10 genannten Parameter. Suchen Sie die Lambdanaht im rekonstruierten 2D-Schichten. Definieren einen zylindrischen interessierenden Volumen (VOI) in der Höhe von 2 mm und 8 mm Durchmesser ist, die tangential zu dem Nahtmaterial - dies ist die Lokalisation der Defekt. </li><li> Segment the Knochengewebe aus Weichteile mit Hilfe eines globalen Schwellenwertverfahren; stellen Sie die untere Schwelle auf 130, und wenden Sie einen eingeschränkten 3D-Gauss-Filter (sigma [σ] = 2,0 und Support = 2), um teilweise Rauschen zu unterdrücken in den Bänden. Generieren Sie eine 3D-Rekonstruktion und sicherzustellen, dass der VOI richtig positioniert ist (Abbildung 2K). </li><li> Generieren Sie eine Dickenkarte mit der IPL-Software und die Funktion &quot;dt_object_param&quot; (Abbildung 2 l). Hinweis: Diese Funktion beschreibt die Gefäßvolumen für jeden Gefäßdurchmesser. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig2.jpg" /> Abbildung 2. Perfusion mit einem röntgendichten Mittel über das Herz Ansatz. Die Maus wird mit dem Befestigungsplatte (A) befestigt ist, und die Haut wird entlang den Bauch bis zum Hals (B) geschnitten. Die Bauchdecke wird entlang der Mittellinie bis zum Schwertfortsatz proce geschnittenss (C) und der Brustkorb seitlich (D) schneiden. Ein Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel eingeführt, die Vermeidung Einführen in die rechte Herzkammer, die deutlich dunkler ist (E, wird der rechte Ventrikel durch die weiße gestrichelte Linie angedeutet), und die Nadel wird auf das Herz und Brustwand befestigt (F) . Heparinisierter Kochsalzlösung (2-3 ml) wird in das Herz gepumpt wird, und die untere Hohlvene seziert (G, weiße Pfeil zeigt die untere Hohlvene). Formaldehyd (4%) wird durchblutet und ausgewaschen; dies wird durch eine Perfusion von gelbgefärbten strahlenundurchlässigen Kontrastmittels folgt. Erfolgreiches Durchblutung wird durch Freigabe der Blutgefäße, die Farbe zu gelb (H) ändern verständlich sein. Nach der Polymerisation wird die Schädelregion isoliert (I, AG = Allograft) und abgebildet mit einem μCT-Scanner, um die ordnungsgemäße Durchblutung (J, interessierende Volumen wird mit orange markiert) zu bestätigen. dasProbe wird entkalkt und neu gescannt (K), gefolgt von der Erzeugung einer farbigen Dickenkarte (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Fluoreszenz-Imaging von Knochenmineralisierung und Durchblutung <ol><li> Rekonstituieren Sonden auf eine Konzentration von 2 nmol / 100 ul PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen (mit einem Bisphosphonat-konjugierten Fluoreszenzsonde zur Knochenmineralisierung und einer durch Blut übertragbaren Fluoreszenzmittel zu überwachen, um die Durchblutung zu messen). Pipette mehrmals vorsichtig, um eine homogene Auflösung der Sonde gewährleistet ist. </li><li> 24 Stunden vor dem vorgesehenen Imaging-Sitzung nehmen Sie ein Bild der Zeit von Null; betäuben 3 Mäuse mit 2 l / min Inhalation von Sauerstoff 100% medizinischem mit 3% Isofluran in einem Induktionskammer ergänzt. Nach entsprechender Anästhesie festgestellt wurde, senken Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,5% - 2%. </li><li> Bewerben vet Augensalbe bis zur Trockenheit zu verhindern und sicherzustellen, Thermal-Pad auf jederzeit umgeschaltet. Drücken Sie den Tierische Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief anästhesiert. Lassen Sie nicht ein Tier unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. </li><li> Rasieren Schädelbereich mit einer Haarschneidemaschine Auftragen gegen die Richtung des Haarwachstums. Fellreste mit Haarentfernungscreme zu entfernen. Alle Fellrest wird mit optischen Abbildungs ​​stören. Nähte mit einer feinen Schere und Pinzette entfernen. </li><li> Platzieren Sie drei Tiere auf dem IVIS Stufe erwärmt auf 37 ° C für jede Bildgebungssitzung. Stellen Sie die Belichtungszeit, um die automatische, Sichtfeld, um C und Filter anpassen. ZB für eine Bisphosphonat-konjugierten Fluoreszenzsonde mit maximaler Erregung gekennzeichnet, daß zuminLichtWellenLänge von 680 nm, verwenden Sie ein Anregungsfilter von 675 nm und einem Emissionsfilter von Cy5.5 . In ähnlicher Weise, wenn Sie eine durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel mit Spitzen Anregung bei Lichtwellenlänge 750 nmverwenden ein Anregungsfilter von 710 nm und einem Emissionsfilter von 780 nm. </li><li> Bild die Mäuse durch Wohnzimmer Bild-Software, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;Erfassen&quot;. Sicherstellen, dass die Schädelregion vollständig sichtbar ist (3B) Für eine umfassende Anleitung beraten Lim et al 2009 8. </li><li> Lassen Sie die Maus zu erwachen Einatmen 100% Sauerstoff. </li><li> Spritzen Sie die 2-nmol Fluoreszenzsonde über einen intravenösen Schwanz Injektion. An der bestimmten Bildgebungssitzung führen Bildgebung wie oben beschrieben. </li></ol> 5. Mikro-Computertomographie für die Knochenregeneration <ol><li> Zur Quantifizierung der Knochenbildung, zu betäuben die Maus durch Inhalation von 3% Isofluran, wie in Schritt 4.2 dargestellt - 4.3. Übertragen Sie die Maus an die μCT-Scanner-Bett, und legen Sie sie in den Scanner. </li><li> Gesetzt Röntgenröhre potentielle Energie der μCT Scanners bis 55 kVp und Intensität von 145 &amp; mgr; A mit mittlerer Auflösung. Mit einem Sichtfeld von 20,5 mm, führenein Scout (Einzel x-ray) zu scannen und eine Region von Interesse, die sich von den Augen der Maus auf die Rückseite seines Schädels zu definieren. Führen Sie einen CT-Scan mit 1000 Vorsprünge pro 360 ° und Integrationszeit von 200 ms. </li><li> Rekonstruktion der 2D-Schichten mit einem Nominal räumlichen Auflösung von 20 um. Richten Sie die Defektränder auf eine standardisierte Position mit μCT-Software 9. </li><li> Ähnlich wie in Schritt 3.20, definieren eine zylindrische Volumen von Interesse und Anwendung der eingeschränkten 3D-Gauss-Filter (σ = 0,8 und Support = 1), um teilweise Lärm in den Bänden unterdrücken. Segment das Knochengewebe aus Weichteile mit Hilfe eines globalen Schwellenwertverfahren. </li><li> Bestimmen das Volumen der mineralisierten Knochengewebe in dem interessierenden Volumen. </li></ol> 6. Biolumineszenz-Bildgebung von Stem Cell Rekrutierung und Differenzierung <ol><li> Bereiten Sie die Maus für die Bildgebung wie in den Abschnitten 4,2 bis 4,4 dargestellt und wach die Mäuse durch Inhalation von 100% Sauerstoff. </li><li> Verwalten 126 mg / kg Käfer Luciferin jeder Maus durch intraperitoneale Injektion, und gibt das Tier auf die Induktionskammer. Nach 2 min, betäuben die Tiere unter Verwendung von 3% Isofluran. Zeigen die Mäuse auf dem IVIS erwärmt Bühne. </li><li> Via Wohnzimmer Bild-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf &quot;auto&quot;, und das Sichtfeld zu C. Bild die Mäuse 5 min nach Luciferin Verwaltung. Bild die Tiere wie in Schritt 4.6 dargestellt, mit Hilfe der &quot;Biolumineszenz&quot; Modalität Regionen von Interesse zu definieren, da transgene Expression variiert zwischen Mäusen. Normalisieren die Schädel Signal an den Schwanz. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vessel+maturation.">Molecular regulation of vessel maturation.</a> Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).</li><li>Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+of+the+wild+vessel:+promoting+vessel+stabilization+for+safe+therapeutic+angiogenesis.">Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis.</a> Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).</li><li>Moutsatsos, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenously+regulated+stem+cell-mediated+gene+therapy+for+bone+regeneration.">Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration.</a> Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).</li><li>Deckers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+stimulate+angiogenesis+through+osteoblast-derived+vascular+endothelial+growth+factor.">Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor.</a> A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).</li><li>Cornejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+adipose+tissue-derived+osteogenic+and+endothelial+cells+on+bone+allograft+osteogenesis+and+vascularization+in+critical-sized+calvarial+defects.">Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects.</a> Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das Ziel der hier beschriebenen multimodale Bildgebung Ansätze ist es, sorgfältige Untersuchung der Angiogenese-Osteogenese Achse im Rahmen der Schädelknochentransplantation zu ermöglichen. Neovaskularisation wurde unter Verwendung eines μCT-Protokoll, das eine genaue hochauflösende 3D-Demonstration des Gefäßbaumes erlaubt Zuführen des gesamten Schädeldefekt abgebildet. μCT Daten können leicht analysiert werden mit Hilfe modernster Tools wie IPL-Software. Zum Beispiel kann die Dicke Analyse in</stron...

Kraniofazialen Knochenschwund aufgrund des Traumas, Tumorresektion decompressive Kraniotomie und Geburtsfehler selten heilt von selbst und stellt eine klare ungedeckten klinischen Bedarf. Autologen Knochentransplantaten und allogenen Knochentransplantate werden in großem Umfang verwendet werden, um diese Bedingungen zu 1 zu behandeln. Es ist weithin anerkannt, dass die Osteogenese ist eng mit Angiogenese 2,3 gekoppelt. Somit sollte die gesamte Studie einer vorgeschlagenen Therapie zur Knochenregeneration eine umfassende Untersuchung des Gefäßbaumes bilden über die gesamte Defektstelle zu schließen. Es gibt mehrere Methoden, um die Vaskularisierung verfügbar in Forschungsmodelle zu charakterisieren. Das Gefäßbaum kann durch eine histologische Analyse untersucht werden. Da Histologie beruht auf Schnittgewebe, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass das sich ergebende Bild wird verzerrt. Um dieses Problem anzugehen, kann Intravitalmikroskopie für Bild in intakten Blutgefäße 4 durchgeführt werden; Jedoch ist dieses Verfahrenauf ein Ebenentechnik beschränkt. μCT Abtastung von Proben aus einem Tier mit Kontrastmittel durchströmt erhalten ermöglicht 3D-Bildgebung des Gefäßnetz, die die Regeneration Website 5-Feeds. Dieser Ansatz ermöglicht eine sehr detaillierte Demonstration des Gefäßsystems eines Organs als Ganzes, sowie eine sorgfältige Analyse der Blutgefäßverteilung. Darüber hinaus ermöglicht die μCT Unterscheidung zwischen abwechslungsreichen Durchmesser der Blutgefäße, die die verschiedenen Untertypen von Blutgefäßen zu charakterisieren. Wir vermuten, dass die Implantation einer Schädelautograft größer Neovaskularisation als Implantation eines Allograft zu induzieren, und diese erhöhte Gefäßneubildung führen wird, die wiederum zu einer verbesserten Knochen formation.To diese Hypothese beschäftigten wir eine Vielzahl von Techniken zu verfolgen. Wir untersuchten Mustern des neugebildeten Gefäßbaum durch Ausführen einer μCT basierte Analyse. Wir messen die Durchblutung mit Hilfe eines Blutpool Fluoreszenzsonde. Als nächstes haben wir Ärschesed Knochengewebe Mineralisierung von FLI einer Hydroxyapatit-gerichteten Sonde und μCT Analyse. Schließlich überwacht wir Stammzellrekrutierung und Differenzierung, die Durchführung BLI in transgenen Mäusen, in denen Luciferase in Osteocalcin-positiven Zellen exprimiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/C&#160; Mice</td>
			<td style="width:112px;">Harlan laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FVB/n Mice</td>
			<td style="width:112px;">Harlan laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenobarbital</td>
			<td style="width:112px;">West waro</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0641-0477-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rodent hair clipper</td>
			<td style="width:112px;">Wahl animal</td>
			<td style="width:119px;">8786-451A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel 11</td>
			<td style="width:112px;">Miltex</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27111504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dental micro motor</td>
			<td style="width:112px;">marathon III</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5mm trephine</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">18004-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hair removing cream</td>
			<td style="width:112px;">Veet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KetaVed (Ketamine)</td>
			<td style="width:112px;">Vedco</td>
			<td style="width:119px;">NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Domitor</td>
			<td style="width:112px;">Zoetis</td>
			<td style="width:119px;">NADA 141-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">carprofen</td>
			<td style="width:112px;">Norbrook</td>
			<td style="width:119px;">02000/4229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:112px;">Puralube</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating binocular</td>
			<td style="width:112px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Curve tweezers</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spoon shaped spatula</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tisseel Fibin gel kit&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Baxter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">718971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">needle holder</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">vicryl suture 4-0</td>
			<td style="width:112px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">J392H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antisedan</td>
			<td style="width:112px;">Zoetis</td>
			<td style="width:119px;">NADA#141033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20ml luerlock&#160;</td>
			<td style="width:112px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">23G scalp vein set (butterfly needle)</td>
			<td style="width:112px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">367342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemostat</td>
			<td style="width:112px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:119px;">13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:112px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:119px;">PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3sec gel glue&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Scotch</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rodent dissection board</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">38DI02313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microfil MV-122</td>
			<td style="width:112px;">flow-tech</td>
			<td style="width:119px;">MV-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">uCT40 scanner</td>
			<td style="width:112px;">Scanco</td>
			<td style="width:119px;">uCT40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCA6%</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osteosense 680</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmar</td>
			<td style="width:119px;">NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Angiosense750</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmar</td>
			<td style="width:119px;">NEV10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxigen 100% medical grade</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane (furane)</td>
			<td style="width:112px;">Baxter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS kinetics</td>
			<td style="width:112px;">Xenogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beetle luciferin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E160A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computed tomography and optical imaging of osteogenesis-angiogenesis coupling to assess integration of cranial bone autografts and allografts

Ein wesentlicher Parameter für den Erfolg einer Knochentransplantation Verfahren ist Vaskularisierung der Umgebung des Transplantats. Wir vermuten, dass die Implantation eines Knochenautotransplantat würde größere Knochenregeneration durch reichliche Bildung von Blutgefäßen zu induzieren. Um die Wirkung des Implantats in Bezug auf Neovaskularisation an der Defektstelle zu untersuchen, einem Mikrocomputertomographie (μCT) Ansatz neu bildenden Blutgefäßen zu charakterisieren, die eine systemische Perfusion des Tieres mit einem polymerisierenden Kontrastmittel beinhaltet entwickelten wir. Diese Methode ermöglicht detaillierte Gefäßanalyse eines Organs in seiner Gesamtheit. Zusätzlich wurde die Durchblutung mit Fluoreszenz-Imaging (FLI) von durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel beurteilt. Knochenbildung wurde von FLI quantifiziert unter Verwendung einer Hydroxyapatit-bezogene Sonde und μCT Analyse. Stammzellrekrutierung durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Osteocalcin überwacht.Hier beschreiben und demonstrieren die Herstellung des Allotransplantats Schädeldefekt Operation μCT Scanprotokolle für die Neovaskularisation Studie und Knochenbildungsanalyse (einschließlich der in vivo-Perfusion von Kontrastmittel) und Protokoll für die Datenanalyse. Die hochauflösende 3D-Analyse der Vaskulatur, einen signifikant höheren Angiogenese bei Tieren mit implantierten Transplantaten, insbesondere im Hinblick auf die Bildung Arteriole. Dementsprechend war die Durchblutung in der Autograftgruppe signifikant höher nach dem 7. Tag nach der Operation. Wir beobachteten, überlegene Knochenmineralisierung und gemessen wird, größer Knochenbildung bei Tieren, die Autotransplantate erhalten. Autograft-Implantation induzierten ansässigen Stammzellrekrutierung, um das Transplantat-Wirt-Knochennaht, wobei die Zellen in knochenbildenden Zellen zwischen dem 7. und 10. postoperativen Tag differenziert. Dieses Ergebnis bedeutet, dass erhöhte Knochenbildung zugerechnet werden kanndas erweiterte Gefäß Fütterung, die Autograft-Implantation charakterisiert. Die Methoden dargestellt kann als optimales Werkzeug, um die Knochenregeneration in Bezug auf die dicht begrenzt Knochenbildung und Neovaskularisation studieren zu dienen.

Neovaskularisation wurde durch μCT Volumenanalyse und durch FLI unter Verwendung eines fluoreszierenden Blut übertragenen Mittel, um die Durchblutung zu quantifizieren bewertet. Sieben Tage nach der Operation zeigte μCT Scanning eine deutlich höhere Volumen der kleinen und mittleren Durchmessers der Blutgefäße bei Mäusen, die Autotransplantate als bei Mäusen, die Allotransplantate aus C57BL / 6 (3A) geerntet erhalten hatten. Interessant ist, dass in der Autograftgruppe die neu gebildete Gefäßb...

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Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Implantation von autologen und allogenen Knochentransplantaten bilden akzeptiert Ansätze zur Hauptgesichtsschädelknochenverlust zu behandeln. Doch die Wirkung der Transplantatzusammensetzung auf das Zusammenspiel zwischen den Neovaskularisation, Zelldifferenzierung und Knochenbildung, ist unklar. Wir präsentieren eine multimodale Bildgebungsprotokoll zum Ziel, die Angiogenese-Osteogenese Interdependenz im Transplantat Nähe aufzuklären.

Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

computed-tomography-optical-imaging-osteogenesis-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Aufrufe.  The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine.  Implantation von autologen und allogenen Knochentransplantaten bilden akzeptiert Ansätze zur Hauptgesichtsschädelknochenverlust zu behandeln. Doch die Wirkung der Transplantatzusammensetzung auf das Zusammenspiel zwischen den Neovaskularisation, Zelldifferenzierung und Knochenbildung, ist unklar. Wir präsentieren eine multimodale Bildgebungsprotokoll zum Ziel, die Angiogenese-Osteogenese Interdependenz im Transplantat Nähe aufzuklären. 

Serie: Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Anbringen biologischen Sonden zur Silica Optische Biosensoren Mit Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Integrierte Photoakustische Ophthalmoskopie und Spectral-Domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Optical Detector von Ultraschall für medizinische Imaging-Anwendungen

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a nano-scale. As such, traditional methods of describing implant surfaces -&#160;namely numerical determinants of surface roughness -&#160;are inadequate for predicting in vivo performance. Biomechanical testing provides an accurate and comparative platform to analyze the performance of biomaterial surfaces. An improved mechanical testing method to test the anchorage of bone to candidate implant surfaces is presented. The method is applicable to both early and later stages of healing and can be employed for any range of chemically or mechanically modified surfaces -&#160;but not smooth surfaces. Custom rectangular implants are placed bilaterally in the distal femora of male Wistar rats and collected with the surrounding bone. Test specimens are prepared and potted using a novel breakaway mold and the disruption test is conducted using a mechanical testing machine. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate and reproducible means for isolating an exact peri-implant region for testing.

An improved method to mechanically test bone anchorage to candidate implant surfaces is presented. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate means to direct the disruption forces to an exact peri-implant region.

Eine verbesserte mechanische Testverfahren zu Knochen-Implantat-Anchorage bewerten

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitative Bewertung der myokardialen Struktur, Funktion, Perfusion und Lebensfähigkeit Mit Herz Micro-Computertomographie

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

Multimodale Volumetrische Retinal Imaging von schrägen Scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) und optische Kohärenztomografie (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate structures&#160;while processing and histological observation provide limited information through cross-sectional imaging. Micro X-ray computed tomography (microCT) is an effective tool for obtaining three-dimensional information without damaging specimens. However, it shows limited efficiency in differentiating soft tissue parts. Use of contrast-enhancing agents, like phosphotungstic acid (PTA), can solve this problem by improving soft tissue contrast. We implemented microCT with PTA to investigate the human orbicularis retaining ligament (ORL), which is a delicate structure in the orbit area. In this method, harvested specimens are fixed in formalin, dehydrated in serial ethanol solutions, and stained with a PTA solution. After staining, microCT scanning, 3D reconstruction, and analysis are performed. Skin, ligaments, and muscles can be clearly visualized using this method. The specimen size and duration of staining are essential features of the method. The suitable specimen thickness was about 5&#8211;7 mm, above which the process was slowed, and the optimum duration was 5&#8211;7 days, below which an empty hole in the central area occasionally occurred. To maintain the location and direction of small pieces during cutting, sewing on the same region of each part is recommended. Furthermore, preliminary analyses of the anatomical structure are needed to correctly identify each piece. Parafilm can be used to prevent drying, but care should be taken to prevent specimen distortion. Our multidirectional observation showed that the ORL is composed of a multilayered meshwork of continuous plates, rather than thread-like fibers, as reported previously. These results suggest that microCT scanning with PTA is useful for examining specific compartments within complex structures of human tissue. It may be helpful in the analyses of cancer tissues, nerve tissues, and various organs, like the heart and liver.

Micro X-ray computed tomography is effective in obtaining three-dimensional information from undamaged human specimens but has limited success in observing soft tissues. The use of phosphotungstic acid contrast agent can resolve this issue. We implemented this contrast agent to examine human delicate fibromuscular tissues (the orbicularis retaining ligament).

Verwendung von Mikro-Röntgentomographie mit Phosphotungstic Acid Preparation zur Visualisierung von humanem fibromuskulärem Gewebe

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...