Name: analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts
Uploaded: 2016-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

Die Arbeit wurde von der British Heart Foundation&#39;and vom Nationalen Institut für Gesundheitsforschung Biomedical Research Centre an Great Ormond Street Hospital für Kinder NHS Foundation Trust und University College London unterstützt finanziert.

Alle Tierforschung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts unter der Lizenz von der britischen Home Office durchgeführt. 1. Dissection und Fixierung von Embryonic Herzen <ol><li> Euthanize eine zeitlich schwangeren Maus auf den gewünschten Tag eine ethisch genehmigt Culling - Technik, zum Beispiel CO 2 narcosis gefolgt von Zervikaldislokation verwenden, und entfernen Sie die embryonale Säcke 14, so dass sie in einer 10 cm Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung gefüllt platzieren (PBS) . </li><li> Mit einem Binokular und einer Pinzette vorsichtig die Gebärmutter-Säckchen öffnen und jeden Embryo zu entfernen, die Nabelschnur Abtrennen und den Dottersack zu entfernen. </li><li> Für die Genotypisierung Zwecke, entfernen Sie die embryonale Schwanz und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Lyse / DNA-Extraktion später. </li><li> Um das Herz, pin jeder Embryo aus auf dem Rücken in einem PBS-gefüllten Silikonelastomer beschichtete 35 mm Petrischale mit Edelstahl minutien Stifte zu entfernen. Mit einer feinen Pinzette, carefully die Truhe öffnen und trennen die großen Gefäße, anterioren zum Herzen. Dann erreichte mit der Zange hinter dem Herzen, fassen die Schiffe hinter dem Herzen und ziehen Sie das Herz zu entfernen; die Lungen weg kommen können auch gleichzeitig an. </li><li> Übertragen Sie das Herz in ein frisches 35 mm Petrischale mit PBS und verwenden feinen Pinzette das Lungengewebe zu wegschneiden, falls erforderlich. Dann übertragen, das Herz zu einer Vertiefung einer 48-Well-Platte mit kaltem PBS gefüllt. </li><li> Sie alle Herzen in der 48-Well-Platte absaugen PBS mit einem spitzen Plastik Pasteur-Pipette und ersetzen mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) Nach dem Sammeln. ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes allergen, krebserregend zu sein, und giftig. <ol><li> Fix E11,5 - 12,5 Herzen für 15 min, E13.5 Herzen für 20 min und E14,5 - 15,5 Herzen für 30 min in 4% PFA bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Saugen Sie das PFA mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette und spülen Sie die Herzen 2x in kaltem PBS. CAUTION: PFA ist gefährlich und müssen in Einklang mit den institutionellen Vorschriften entsorgt werden. </li><li> Wenn sie nicht sofort für ganze Berg Immunfärbung mit (siehe Abschnitt 2), dehydrieren die Herzen durch aufeinanderfolgende 5 min Waschen in den folgenden Lösungen Durchführung: 25% Methanol / 75% PBS, 50% Methanol / 50% PBS, 75% Methanol / 25 % PBS. VORSICHT: Methanol ist giftig, Handschuhe zu tragen. Lagern Sie die Herzen bei -20 ° C in 100% Methanol. </li></ol> 2. Ganze Berge Immunostaining embryonaler Herzen mit Anti-PECAM1 Antikörper HINWEIS: Anti-PECAM1 Antikörper eignen sich gut für die Herzkranzgefäße Färbung (siehe Schritt 2.4), aber jede pan-endothelialen Marker, der ein robustes Signal gibt wäre geeignet. <ol><li> Bei der Verwendung von Herzen, die in 100% Methanol gespeichert wurden, übertragen auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und rehydratisieren durch aufeinanderfolgende 5 min Waschen in den folgenden Lösungen Durchführung: 75% Methanol / 25% PBS, 50% Methanol / 50% PBS und 25% Methanol / 75% PBS. </li&gt; <li> Permeabilisierung die Herzen, indem man 3 x 10 min Waschen in 0,5 bis 1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), Drehen bei Raumtemperatur. </li><li> Blockieren Sie die Herzen durch Drehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 1,0 ml 10% Ziegenserum in PBST. </li><li> Entfernen Blockierungspuffer mit einem spitzen Kunststoff Pasteur-Pipette oder 1000 ul Pipettenspitze und ersetzen mit 400 bis 500 &amp; mgr; l frisch Block der Anti-PECAM1 primären Antikörper enthält 01.50 verdünnt. Drehen Sie die Rohre über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag absaugen Block / primären Antikörper mit einem feinen Spitze Pipette Plastik Pasteur oder 1000 ul Pipettenspitze und führen mindestens 6x 1 Stunde Waschungen in 1,0 ml PBST, die Röhrchen bei Raumtemperatur rotiert. </li><li> Ersetzen Sie die letzte Wäsche mit frischem Blockierungspuffer das Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper verdünnt 1, enthaltend: 500, und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, mit einer Drehung. Vor Licht durch die Rohre in Folie wickeln. </li><li> Am folgenden Tag absaugen Block / skundären Antikörper mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette und tragen mindestens 6x 1 Stunde Waschungen in 1,0 ml PBST aus, die Röhrchen bei Raumtemperatur rotiert. </li><li> Lagern Sie die Herzen bei 4 ° C (lichtgeschützt) bis benötigt. </li></ol> 3. Herstellung von Clearing-Lösungen und Mikroskopie Geschirr HINWEIS: Bei der Abbildung Herzen in BABB ist es wichtig, dass keine der BABB Lösung in Kontakt mit den Komponenten des Mikroskops kommt. Dazu wird das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Herstellung von Siliconelastomer versiegelten Geschirr geeignet für die Fluoreszenzmikroskopie, die gut vorbereitet werden kann. Das Silikon-Elastomer stellt eine Barriere die BABB enthalten und verhindern, dass es möglicherweise zwischen dem Glasboden sickert und die Polycarbonat-Seiten der Schale. <ol><li> Zur Herstellung der Silikonelastomer-beschichteten Schalen, nehmen optische Glasboden Kulturschalen und legen Sie eine Kappe aus einem 4 ml mit Schraubverschluss Fläschchen (ca. 1,5 cm im Durchmesser) In der Mitte jedes Gericht. Hinweis: Dadurch wird eine gut für die Probe bilden, wenn das Elastomer in die Schale aufgebracht wird. </li><li> Füllen des Geschirrs mit Silikonelastomer bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 cm, einen Applikator Patrone unter Verwendung der beiden Komponenten zu mischen, wie sie angewendet werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie für mindestens 24 Stunden aushärten, um sicherzustellen, dass die Verschlusskappe in der Mitte jeder Schale bleibt. HINWEIS: Eine Schutzbrille verwenden zufällige Berührung des Silikon-Elastomer mit den Augen zu vermeiden. </li><li> Nachdem das Elastomer Aushärten das Fläschchen Kappe aus jeder Schale zu entfernen, wird dies eine zentrale gut verlassen, wo die Probe in direktem Kontakt gebracht werden mit dem Glasboden der Schale abgebildet werden können. HINWEIS: wenn sie gehärtet ist das Elastomer sollte zur Note fest und trocken sein. </li><li> Bereiten Sie die BABB Lösung (1 Teil Benzylalkohol zu 2 Teilen Benzylbenzoat). Dies sollte von Licht in einer Glasflasche und geschützt aufbewahrt werden. ACHTUNG: BABB ist eine giftige, ätzende Lösung. Griff in einem Abzug, während geeignete Schutzkleidung tragen. </li><li> (- 5 ml 1) in einem Glasfläschchen Mix BABB und Methanol 50:50 Lösung herzustellen. Vor Licht schützen, zum Beispiel durch das Fläschchen in Folie gewickelt wird . </li></ol> 4. Dehydration, Clearing und Montage von Herzen für konfokale Mikroskopie HINWEIS: Größere Proben können in 4 ml Glasfläschchen, jedoch für kleine Proben (zB Herz bis E13.5) gelöscht werden , ist es besser, den Clearing - Prozess durchführen direkt in der Mikroskopie Gericht. Dies hilft zu verhindern, &#39;verlieren&#39;, um die Proben als die Herzen sehr transparent geworden einmal gelöscht. Für diese kleinen Proben ist Clearing sehr schnell, innerhalb weniger Minuten auftreten. Hinweis: Schützen Sie die Proben vor Licht während alle folgenden Schritte durch Umwickeln / Abdeckung Rohre und Gerichte mit Folie. <ol><li> Vor dem Löschen entwässern die immunhistochemisch-Herzen durch eine Methanol-Serie durch die Herzen bei Raum tempe rotierendenratur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in aufeinanderfolgenden Änderungen der folgenden Lösungen: 25% Methanol / 75% PBS, 50% Methanol / 50% PBS und 75% Methanol / 25% PBS (5 min in jedem). Schließlich drehen für 3 x 5 min in 100% Methanol. </li><li> Für bis zu Herzen E13.5, Platz in der Mitte der Mikroskopie Schale; unter dem Mikroskop sicherzustellen, wird das Herz mit seiner Rückenseite nach oben orientiert. Entfernen Sie das Methanol aus um das Herz mit einem feinen Spitze Kunststoff Pasteurpipette. </li><li> Mit einem sauberen fein kippte Kunststoff Pasteurpipette hinzufügen BABB: Methanol 50:50 Lösung in einem ausreichenden Volumen, das Herz zu tauchen (etwa 300 bis 400 &amp; mgr; l). Da die Herzen manchmal in der Lösung umdrehen kann, prüfen Sie erneut die Orientierung, während die Herzen immer noch undurchsichtig sind. Lassen Sie in der Lösung für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die 50:50 Lösung auf eine Glasabfallflasche in der Abzugshaube und ersetzen mit BABB, wieder mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette. HINWEIS: Ein großes Volumen ist nicht erforderlich; hinzufügen ausriziente so dass das Herz sitzt in einem Tropfen der Lösung. Das Herz sollte innerhalb von 5 min zu löschen. </li><li> Für größere Herzen, deaktivieren Sie die Proben in Glasfläschchen. HINWEIS: Ein E15.5 Herz innerhalb von 30 min-1 Stunde löschen soll, kann aber über Nacht bei Bedarf überlassen werden. </li><li> Nachdem die Probe klar ist, um die Lösung zu entfernen und mit einem minimalen Volumen BABB ersetzen. Optional umfassen die Probe mit einem Deckglas, um es an Ort und Stelle zu halten, was jedoch nicht unbedingt erforderlich ist. Verwenden Sie das Herz für die Bildgebung. </li></ol> 5. Imaging Gelöscht Herzen durch konfokale Mikroskopie HINWEIS: Die Bilder wurden auf einem invertierten konfokalen Mikroskop 10X oder 20X Trockenobjektive mit erfasst. Obwohl es möglich ist, die Gerichte auf einer aufrechten konfokalen zu verwenden, muss besonders vorsichtig Kontakt des Objektivs mit der BABB Lösung zu vermeiden. <ol><li> Sammeln Sie ein z-Scan des Herzens 15. Je nach Größe des Herzens, kann eine Kachel - Scan das ganze Herz 16 bis Bild erforderlich. <br/&gt; ACHTUNG: BABB ist eine ätzende Lösung, saubere Handschuhe tragen und sicherstellen , dass die Außenseite der Mikroskopie Schale frei von BABB ist. Behandeln Sie die Schale vorsichtig und halten Sie den Deckel auf die Schüssel das Risiko einer versehentlichen Verschütten auf das Mikroskop zu minimieren. </li><li> Wenn es das Ziel Arbeitsabstand ermöglicht, verwenden Sie eine höhere Vergrößerung höher auflösende Bilder von Regionen von Interesse zu erreichen. </li></ol> 6. Datenanalyse mit Fidschi Software <ol><li> Öffnen Sie die z Stapel von Bildern in Fidschi 17. </li><li> Um az Projektion des gesamten Stapels oder einen Teil davon zu machen, klicken Sie auf das Bild und wählen Sie Stapel, gefolgt von Z-Projekt. Geben Sie die Start- und Stopp - Slice - Nummern, und wählen Sie die Art der z - Projektion, zB mittlere Intensität, max Intensität. </li><li> So markieren Sie einzelne Schiffe innerhalb eines Stapels von Bildscheiben für den Blow-Werkzeug (aus dem Plug-Ins-Menü wählen Sie Segmentation und dann Schlag / Lasso-Werkzeug) und klicken Sie auf die Bereiche des Bildes werden in ea gefülltch in Scheiben schneiden. Verwenden Sie den Fill-Befehl (klicken Sie auf Bearbeiten, und wählen Sie dann Fill) die ausgewählten Bereiche mit der Vordergrundfarbe zu füllen (klicken Sie auf Bearbeiten, und wählen Sie Optionen, gefolgt von Farben und Vordergrund). </li><li> Z-Projekt nach wie vor das Bild stapeln. </li></ol> 7. 3D-Oberflächen Volume Rendering von Koronararterien generiert Imaris Verwendung <ol><li> Klicken Sie auf das Symbol Ansicht Surpass am oberen Rand des Bildschirms und ziehen Sie die Bilddatei in das Datenfenster. Klicken Sie auf das 3D-Ansicht-Symbol am oberen Rand des Bildschirms. </li><li> Wählen Sie das Oberflächen-Symbol (blaues Symbol) und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erstellen. Klicken Sie auf &quot;Weiter automatische Erstellung, manuell bearbeiten&quot; Dialogfeld und klicken Sie auf das Draw-Symbol (dünne Bleistiftsymbol). </li><li> Wählen Sie die Kontur Tab und dann auf die Registerkarte Modus. Im Modus, klicken Sie auf den Zauberstab oder isoline Symbole. Wählen Sie den Zeiger-Modus in der Pointer-Auswahl auf der rechten Seite des Bildschirms, indem Sie neben &quot;Select&quot;, und klicken Sie dann auf die &quot;Draw9; Box (in der linken unteren Ecke des Bildschirms). </li><li> Verwenden Sie die Isolinie oder Zauberstab-Werkzeug die Konturen der Arterien in den aufeinanderfolgenden Scheiben zu wählen. Navigieren Sie von Schicht zu Schicht der Scheibe Position Schieberegler. </li><li> Wenn alle Konturen ausgewählt haben, klicken Sie auf das Oberflächenfeld erstellen. Die umgebende Volumen kann unsichtbar gemacht werden, oder mehr oder weniger undurchsichtig unter Verwendung der Blend-Modus wiedergegeben; Klicken Sie auf Volume um es zu markieren und dann auf die Registerkarte Einstellungen wählen, die Registerkarte Modus gefolgt. Wählen Sie Blend und den Schieberegler verwenden, um die Opazität ändern. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern mit der Snapshot-Funktion. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Koronargefäße in ganzen embryonalen Herzen wurden von Wholemount Immunfärbung mit Anti-PECAM1 Antikörper, gefolgt von optischen Clearance und der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Die einfache Methode, die hier beschrieben wird, für die Freigabe der embryonalen Mäuseherzen mit BABB, erhöht die optische Durchdringung und ermöglicht die Erfassung von hochauflösenden Bildern von Blutgefäßen lokalisiert in der Aorta und Ventrikelwände. Glycerol-basierten Montage Reagenzien wie Vectashield (Brechungsindex 1,45) wurden auch für die Bildgebung der Koronargefäße 22 verwendet worden , aber die höheren Brechungsindex von BABB (1.56) noch weitere Lichtstreuung reduziert, tiefere Eindringen in das Gewebe ermöglicht. Gewebeclearance vermeidet die Notwendigkeit komplexer, teurer Formen der Mikroskopie, wie beispielsweise Multi und Lichtbogen-Mikroskopie, die weniger leicht Forschern zur Verfügung stehen. Das Clearing - Prozess ist extrem schnell im Vergleich zu anderen Methoden 6-9 und für kleine Proben ca sein kannmit kleinen Mengen an Reagenzien direkt auf der Mikroskopie Gericht rried aus. Robust Anfärbung der Vaskulatur ist erforderlich, um qualitativ hochwertige Bilder zu erzielen; anti-PECAM1 Antikörper wurde ausgewählt, da es alle Arten von koronaren ECs markiert und eine Reihe von kommerziellen Antikörper gefunden wurden, in geeigneter Weise ein hohes Maß an Färbung zu geben. Darüber hinaus scheint die Fluoreszenzfärbung in BABB äußerst stabil; Proben, die bei Raumtemperatur in BABB gespeichert (lichtgeschützt) erhalten für mehrere Monate ihre Fluoreszenzsignal. Die Tatsache, dass PECAM1 Antikörper wirksam die koronare Endokard Etiketten sowie die Vaskulatur gelegentlich problematisch war, insbesondere wenn Bilder des peritruncal plexus einzufangen. Stärkere Färbung der Aortalumens gegenüber dem peritruncal ECs ergab eine Gefahr der Übersättigung in einigen Bereichen der Bilder, was bedeutet, daß eine sorgfältige Einstellung der Abbildungsparameter erforderlich war. Idealerweise nur eine Antikörperfärbung vaskulären ECs verwendet werden würde; in der Praxis,jedoch der Suche nach geeigneten Antikörpern, die das erforderliche Maß an Färbung ergeben Wholemount kann schwierig sein. Vor kurzem Fettsäure - bindendes Protein 4 (FABP4) wurde 23 ein Marker für koronare Gefäß ECs gezeigt werden , und somit eine Alternative zu PECAM1 darstellen. Um die 3D-Morphologie der Aorta und Herzkammern die Proben nicht flach montiert zu halten waren, wurden aber stattdessen in dem Glasbodenschalen abgebildet. Die Tiefe der Proben abgebildet werden ausgeschlossen die Verwendung hoher Vergrößerung Ziele aufgrund ihrer kurzen Arbeitsabstände. Allerdings hochauflösende Bilder waren noch erreichbar ein 10X-Objektiv mit Pixel-Verweilzeit zu erhöhen und eine Pixelanordnung Größe von mindestens 1.024 x 1.024 für die Bilderfassung verwendet wird. Dies war ausreichend für die Analyse der Struktur und Verteilung der Herzkranzgefäße können jedoch feinere Analyse der Zellstruktur erfordern Flachmontage von Proben. Dissektion der einzelnen Teile des Herzens für die Montage,Beispiel Ventrikel Wänden oder Aorta kann auch erforderlich sein. Alternativ Überabtastung des Bildes durch Entfaltungs gefolgt kann ausgeführt werden, um Auflösung und Empfindlichkeit zu erhöhen; dies erfordert jedoch wesentlich längere Scanzeiten und erzeugt eine extrem große Bilddateien, die viel Rechenleistung benötigen zu verarbeiten. Herzen bis E15.5 wurden unter Verwendung dieses Verfahrens erfolgreich abgebildet wird, und es ist auch möglich, das Gefäßsystem von ganzen Embryonen zu analysieren (bis zu mindestens E11.5) dasselbe Protokoll verwenden. Andere Zelltypen, beispielsweise glatte Muskelzellen wurden auch in unserem Labor unter Verwendung dieser Technik abgebildet worden. Für dickere Gewebe, zum Beispiel Herz älter als E15.5, können Antikörper Penetration ein limitierender Faktor sein; längere Inkubationen und / oder erhöhte Reinigungsmittel erforderlich sein. Zusätzlich, wenn eine große z Stapel von Bildern Sammeln von Signalstärke reduziert werden kann, wie die Laser der weitesten Teile des Gewebes durchdringen; aber die confOcal Einstellungen können Laserleistung zu erhöhen, mit zunehmendem Abstand z eingestellt werden. Dieses Verfahren erleichtert die konfokale mikroskopische Analyse von sowohl den frühesten Stadien der koronaren Gefäßbildung und der Strukturierung der Koronararterien in späteren Entwicklungsstadien wirksam. Detaillierte Informationen über die Verteilung, Verzweigung und Struktur der Blutgefäße können in kurzer Zeit erfasst werden, ist dies ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der genetischen Mausmutanten mit spezifischen Defekten in Angiogenese Wege macht.

ein funktionierendes koronarer Netzwerk aufzubauen ist von entscheidender Bedeutung für die Herzfunktion und die embryonale Entwicklung und Analyse von genetischen Mausmutanten wertvolle Einblicke in die molekularen Signale liefern können diesen Entwicklungsprozess zugrunde liegen. Die Fähigkeit, die embryonale koronaren Plexus als Ganzes sichtbar zu machen, als vielmehr in einer Reihe von histologischen Schnitten dargestellt, ist wesentlich, um die Analyse von Gefäßmusterungs in genetische Mutanten zu erleichtern, und verhindert den möglichen Verlust von Informationen, die als Ergebnis der mechanischen auftreten kann Schneiden des Gewebes. Gefäße seligen Arterien und Kapillaren zu bilden , sind lokalisierte tief in den Wänden der beiden Kammern und der Aorta 1-3. Während jedoch die Fluoreszenzmarkierung von mit Laser-Scanning - konfokale Mikroskopie kombiniert Zellen können venöse / Lymphgefäße 4,5, hochauflösende Bilder von oberflächlichen Wholemount-markierten bieten die Tiefe der Bildgebung wird durch optische Durchdringung begrenzt. Hochauflösende Bildgebung der Kappeillaries und Arterien während der gesamten Tiefe des Herzens ist daher ohne irgendeine Form von Gewebe Clearing nicht möglich. Schlechte optische Eindringtiefe wird durch den hohen Brechungsindex der mehreren zellulären und extrazellulären (zB Kollagen und elastischen Fasern) -Komponenten von dicken Geweben verursacht. Diese streut das Abbildungslicht, was zu Unschärfen und verringert den Kontrast. Clearingstellen entsprechen typischerweise den hohen Brechungsindex von solchen Geweben, was bedeutet, dass das Licht durch die Probe bewegen kann ungehindert und dringen tiefer in das Gewebe. Vor dem Clearing, sind Gewebe im Allgemeinen dehydriert als Wasser mit einem relativ niedrigen Brechungsindex aufweist. Eine Fülle von neuen Clearing - Verfahren wurden je nach der verwendeten Technik vor kurzem jedoch entwickelt, kann das Clearing - Verfahren Tage oder Wochen dauern und kostspieliger Reagenzien 6-9 erfordern. BABB (a 1: 2-Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat) ist eine kostengünstige, häufig verwendete Clearingstelle, die das hatVorteil der Proben extrem schnell zu löschen. BABB basierte Clearing- und Abbildungstechniken wurden für neurologische Proben und verschiedene Organe 10-13 zuvor beschrieben. Hier beschreiben wir eine robuste und einfache Technik für die BABB Clearance von immunhistochemisch Proben mittels konfokaler Mikroskopie gefolgt, mit besonderem Bezug auf die Untersuchung von Blutgefäßen in murinen Herzen von E (embryonaler Tag) 11,5-15,5. Wie jedoch wurde auch gezeigt, kann die Technik genauso gut auf die Analyse von ganzen Embryos angewendet werden, wie auch andere Zelltypen, solange hochwertige Antikörper gegen die Marker von Interesse zur Verfügung stehen.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Sigma</td><td>P5112</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip pastettes&amp;nbsp;</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4061</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml pipette tips</td><td>Sorenson</td><td>34000</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGARD</td><td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td></tr><tr><td>Kwik-Gard refill</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGLUE</td><td>Refill cartridges and dispensing tips</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Make up in PBS and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td></td></tr><tr><td>Tween&amp;reg;20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA3105</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td></tr><tr><td>Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11007</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab173003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21208</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Phenolic screw cap</td><td>Wheaton</td><td>240408</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

Da das Herz entwickelt, wird das Myokard durch Endothelzellen (ECs) aus verschiedenen Quellen eingedrungen, und ein Gefäßplexus gebildet wird. Die Schiffe, die innerhalb des Ventrikelmyokards entwickeln wird weitergehen , die Kapillare und arterielle Netzwerke zu bilden 18 mit Sauerstoff angereichertem Blut zum Herzgewebe liefern. Zur gleichen Zeit (ungefähr E11.5) der koronaren beginnen Stiele unabhängig von einem separaten Kapillarnetz zu entwickeln (als peritruncal Plexus bekannt), die das Lumen der Aorta 14,19,20 umgibt. Peritruncal plexus ECs bilden zunächst mehrere Verbindungen mit dem Lumen der Aorta auf der Höhe der Ventil Sinus, jedoch letztlich nur ein Behälter auf jeder Seite der Aorta bestehen bleiben wird, geht auf die Wurzeln der linken und rechten Koronararterien 21 bilden. Aus der ganzen peritruncal E13.5 und ventrikuläre verbinden Herzkranzgefäße ein miteinander verbundenes Netzwerk bilden nach oben, den Blutfluss aus dem ein ermöglichtorta in die Herzkranzgefäße 14,22. Färbung von ECs mit anti-PECAM-1-Antikörper, mit BABB Clearance der intakten Herzen kombiniert wird, ermöglicht die Analyse der Entwicklung von koronarer Netzwerke von den frühesten möglichen Stufen. In späteren Entwicklungsstadien der Strukturierung der Reifung Koronararterien kann auch untersucht werden. Dieses Verfahren kann auch die Vaskulatur von ganzen Embryos zu färben verwendet werden (bis E11.5 mindestens) und mit verschiedenen Antikörpern, beispielsweise Anti-alpha smooth muscle actin (Sm22α) und Endomucin. Abbildung 1 zeigt maximale Intensität z-Projektionen eines E11,5 Herz erzeugt mit Fiji - Software. Die Tile-Funktion wurde verwendet, um mehrere Teilbilder des Herzens sammeln und nähen sie zusammen in ein vollständiges Bild; Dies ist sinnvoll, einen Überblick über die Färbung in der gesamten Probe zu geben. In diesem Stadium PECAM1 Antikörper hauptsächlich färbt die endokardialen Auskleidung des Herzens und Ausströmen vessels jedoch einige ECs können auch in der linken ventrikulären Wand (geschachtelt Bereich in 1A, vergrößert dargestellt in 1A) beobachtet werden. Darüber hinaus können die peritruncal plexus deutlich in der Wand des Ausflusstrakts (OT) (eingerahmt Region in 1B) beobachtet werden. Im letzteren Fall wird die Anzahl von Schichten in der z-Stapels verwendeten Reduktions die Projektion zu erzeugen , verbessert die Klarheit des Bildes, die Verbindungen mit dem Lumen der Aorta ermöglicht deutlicher (1B &#39;) zu visualisierenden. In 2 kann die erhöhte Gefßsystems proximal zu der Aorta in einer E12.5 Herz beobachtet werden. Abbildung 3 zeigt die peritruncal Plexus in einem E12.5 Herz. Die 12-slice z Projektion in 3A zeigt die gesamte Plexus jedoch , da einige Gefäße ventral in das Lumen der Aorta lokalisiert sind (die auch durch anti-PECAM1 Antikörper stark verschmutzt ist), Aufteilen des z-Stack into einer Anzahl Teilstapel (3B-D) stellt mehr visuelle Informationen. Zum Beispiel zeigt der Teilstapel projiziert in 3B einen peritruncal Gefäß zur ventralen Oberfläche der Aortalumen verbindet, die nicht sichtbar in der vollen Projektion ist. Figur 4 zeigt einen Teil einer E15.5 Herzens; die Koronararterien sind in diesem Stadium (4A, 30-Slice - Projektion) deutlich sichtbar. ; In der 5-Scheibe z Projektionen in den Figuren 4B und C durch PECAM1 Färbung der Aorten - und Pulmonalklappe können auch sichtbar gemacht werden gezeigt die Zweige und Verbindungen der koronaren Capillarnetz sind auch deutlicher in diesen kleineren Teilstapel Projektionen. Manuelle Segmentierung Techniken wurden verwendet , um die Koronararterien mit Fidschi (4D) oder Imaris (4D und E) zu markieren. Die 3D-Oberflächenvolumenrendering von Koronararterien / Aortenlumens erzeugt using Imaris kann mit oder ohne die umgebende Gefäßsystem (4E und F) betrachtet werden. Die Gefäße der ganzen Embryonen können auch PECAM1 Färbung / BABB Clearance untersucht werden. 4A und A &#39;, zeigen z Projektionen erzeugt von dem Teilstapel von der rechten Seite (z Scheiben 11 bis 65) und die linke Seite (z slices 66-110) des Embryos sind. Vergleich der beiden Bilder zeigt, dass die Intensität des Fluoreszenzsignals nicht signifikant mit tieferes Eindringen in das Gewebe zu verringern. In 4B PECAM1 (rotes Signal) und Endomucin (grünes Signal) wurden Antikörper kombiniert , um die intersomitic Arterien (ISA) und Adern jeweils zu beschriften, eines E11.5 Embryos. 4C zeigt SM22α (rotes Signal) und PECAM1 Färbung (grünes Signal) der ISA in einem E11,5 Embryo. In 6 E11.5 Embryonengefärbt mit PECAM 1 wurden unmittelbar nach BABB Clearance (4A) oder nach einem Intervall von etwa zwei Monate (4B) abgebildet. Das Fluoreszenzsignal war immer noch stark genug, um Bild erfolgreich nach längerer Lagerung der Probe in BABB. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> Abbildung 1. Immunostaining eines E11,5 Herz mit Anti-PECAM1 Antikörper (Erkannte mit Anti-Ratten - IgG konjugiert an Alexa 594). (A, B) ein 2 x 2 Fliesenbild wurde unter Verwendung des 10X - Objektiv eines invertierten konfokalen Mikroskop gesammelt. PECAM1 Antikörper färbt sowohl endokardialen und vaskuläre ECs. Vorsprünge (maximale Intensität) wurden aus 22 (A) oder 5 (B) z - Scheiben von jeweils 4 um Dicke erzeugt, Fiji - Software. A &#39;und B&#39; enlargements der boxed Bereiche in A und B ein . Die Pfeile in A &#39;zeigen , Blutgefäße in der Ventrikelwand; in B &#39;, zeigt die Konsole die peritruncal Plexus. OT, Ausflusstraktes; LV, linker Ventrikel, RV rechten Ventrikel. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken in A und B = 200 &amp; mgr; m; Maßstabsbalken in A &#39;und B&#39; = 100 &amp; mgr; m. Panel - 1B &#39;wurde von Ivins et al angepasst. 2015 19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Abbildung 2. Immunostaining eines E12,5 Herz mit Anti-PECAM1 Antikörper. Tafel A zeigt az Vorsprung (maximale Intensität) eines 2x2 mit Ziegeln gedeckt Scan. Die eingerahmten Region in A gezeigt VERGRÖßENed in A &#39;; Pfeile zeigen mehrere Blutgefäße proximal zur Aorta (Ao). LV, linker Ventrikel, RV rechten Ventrikel. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken in A = 200 &amp; mgr; m; Maßstabsbalken in A &#39;= 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> Abbildung 3. Abbildung des Peritruncal Plexus in einem E12,5 Herz. Konfokalbilder einer E12,5 Aorta (Ao) gefärbt mit anti-PECAM1 Antikörper wurden mit dem 10X-Objektiv gesammelt. Die z - Projektion (maximale Intensität) in A wurde aus 12 z Scheiben (4 &amp; mgr; m Dicke) erzeugt; Pfeile zeigen die peritruncal Plexus Gefäße. BD Die 12 z Scheiben wurden in drei Teilstapel wie angegeben und verwendet getrennte projecti zu erzeugenons; Pfeilspitzen zeigen Verbindungen durch den peritruncal plexus zum Lumen der Aorta gebildet. Peritruncal Gefäßen lokalisiert ventral in das Lumen der Aorta sind in B und C. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Abbildung 4. Koronararterien und Kapillarplexus in einem E15.5 Herz. Die konfokale Bilder eines E15.5 Herzen gefärbt mit anti-PECAM1 Antikörper wurden mit dem 10X-Objektiv gesammelt. Panel A zeigt ein Maximum von 30 z Scheiben erzeugt z Projektionsintensität (4 &amp; mgr; m Dicke); Pfeile zeigen die linken und rechten Koronararterien (LCA und RCA), die an der Aorta (AO) Anschluss zu sehen ist. Mit different 5 z Scheibe Unter stapelt die Aorten - und Pulmonalklappe (AoV und PV) in B bzw. C (blaue Klammern) zu sehen. Die ventrikuläre Kapillarplexus ist auch klarer in diesen kleineren Teilstapel Projektionen; Blutgefäße proximal der Pulmonalklappe (kleine Box) in der rechten unteren Ecke des Panel C (großer Kasten) vergrößert dargestellt. Fidschi wurde verwendet , um einzelne Blutgefäße zu markieren, zum Beispiel für Panel D den Schlag / Lasso - Werkzeug verwendet wurde , um die Koronararterien mit roter Farbe zu füllen manuell in jeder z Scheibe vor der Projektion. Imaris Software wurde verwendet , um 3D - Bilder der Arterien (rot) und Aorten - Lumen (grün) in E und F zu schaffen; dies wurde wieder manuell, mit dem Zauberstab-Werkzeug Objektkonturen in jeder z Scheibe zu erstellen. Die Trübung des umgebenden Volumen kann in Mischmodus geändert werden, wie in E. Alternativ kann das 3D - Bild extrahiert werden, wie in F gezeigt </strong&gt;. LV, linke Ventrikel. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken in A = 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Abbildung 5. Abbildung von Embryonic Gefäßsystem. Die Felder A und A &#39;zeigen konfokale Bilder eines E10.5 Wildtyp - Embryo mit anti-PECAM1 Antikörper, sammelte das 10X - Objektiv mit (Kachel - Scan). Mittlere Intensität z Projektionen wurden von z Scheiben 11-65 (A) und 66-110 (A &#39;) eines 120 z Scheibe Scan (4 um dicke Scheiben), erzeugt nur einen geringen Verlust der Fluoreszenzintensität über die Dicke des Embryos zeigt . Tafel B zeigt die intersomitic Gefäße eines E11.5 Embryos mit Antibod gefärbt<html> ies gegen PECAM1 (rotes Signal von 594-konjugierten sekundären Antikörper) und Endomucin (EMCN, grünes Signal von 488-konjugierten sekundären Antikörper), die die intersomitic Arterien Fleck (Pfeil) und Venen (Pfeilspitze) bzw. (mittlere Intensität z Projektion von einem gekachelten Scan). Tafel C zeigt intersomitic Arterien (ISA) von einem E11.5 Wildtyp - Embryo mit Antikörpern gegen PECAM1 (grünes Signal von 488-konjugierten sekundären Antikörper) und SM22α (rotes Signal von 594-konjugierten sekundären Antikörper) gefärbt. Die konfokale Bilder wurden unter Verwendung des 20X Trockenobjektiv gesammelt und verwendet, um maximale Intensität z Projektionen erzeugen. Alle Bilder sind sagittale Ansichten. Maßstabsbalken in A und B = 250 &amp; mgr; m, Maßstabsbalken in C = 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. immunogefärbten Proben in BABB Gelöscht Fluoreszenz - Signal beibehalten mindestens zwei Monate. E11.5 Embryonen wurden mit PECAM1 Antikörper und klären mit BABB gefärbt; Embryonen aus der gleichen Charge wurden sofort oder nach einem Zeitraum von zwei Monaten abgebildet. Panel A zeigt die intersomitic Arterien des Embryos abgebildet sofort und Tafel B zeigt der Embryo zwei Monate später abgebildet. Die konfokale Bilder wurden unter Verwendung des 10X Trockenobjektiv gesammelt und verwendet, um maximale Intensität z Projektionen erzeugen. dAO, dorsale Aorta. Bilder sagittale Ansichten. Maßstabsbalken in A und B = 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Aufrufe.  UCL Institute of Child Health.  Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten. 

Serie: Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Entwicklungsbiologie

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe CHD died before adulthood, with the maximum mortality during the first week of life. Remarkable advances in surgical techniques, diagnostic approaches, and medical management have led to marked improvements in outcomes. To address the critical research needs of understanding congenital heart defects, murine models have provided an ideal research platform, as they have very similar heart anatomy to humans and short gestation rates. The combination of genetic engineering with high-throughput phenotyping tools has allowed for the replication and diagnosis of structural heart defects to further elucidate the molecular pathways behind CHDs. The use of noninvasive fetal echocardiography to screen the cardiac phenotypes in mouse models coupled with the high fidelity of Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) histopathology with three-dimensional (3D) reconstructions enables a detailed view into the anatomy of various congenital heart defects. This protocol outlines a complete workflow of these methods to obtain an accurate diagnosis of murine congenital heart defects. Applying this phenotyping protocol to model organisms will allow for accurate CHD diagnosis, yielding insights into the mechanisms of CHD. Identifying the underlying mechanisms of CHD provide opportunities for potential therapies and interventions.

This article details murine congenital heart disease (CHD) diagnostic methods using fetal echocardiography, necropsy, and Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) followed by three-dimensional (3D) reconstruction.

Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

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