Die Autoren danken dem INRA MIMA2 Imaging Core Facility (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) und an die Mitarbeiter des IERP Einheit (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) für die Tierpflege und Einrichtungen. Wir möchten auch IH Mather, MC Neville und S. Tooze für die Bereitstellung sehr nützlich antibodie danken.

CD1-Mäusen wurden bei INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Frankreich) gezüchtet. Alle ethischen Aspekte der Tierpflege mit den einschlägigen Richtlinien und Zulassungsanforderungen, die von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft gelegt eingehalten werden. Die verwendeten Verfahren wurden von der Ethikkommission (Vereinbarung 12/097 vom Comethea Jouy-en-Josas / Agroparistech) zugelassen. 1. Milchdrüse Probenvorbereitung <ol><li> Maus-Brustdrüse Dissektion <ol><li> Euthanize Mäusen am Tag 10 der Laktation durch Genickbruch und stecken Sie das Tier zu mit seinen Unterleib nach oben zeigt. </li><li> Befeuchten Sie die Bauchbereich mit Ethanol und trocknen Sie es mit einem Papiertuch. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut zwischen den beiden Hinterbeinen und einen Einschnitt (nur durch die Haut) von etwa 1 cm mit einer scharfen Schere. Ausgehend von diesem ersten Schnitt, dann mit einer Schere, um die Haut bis zum Hals auf der Maus zu schneiden. Ziehen Sie die Haut von dem Bauchfell und pin auf der einen Seite der Haut zu einer Zeit, Stretching gelehrt. </li><li> Sammeln Sie die Bauch- und Leistenbrustdrüsen, indem Sie sie von der Haut mit einem Tupfer und schließlich Ziehen oder Schneiden sie weg von dem Bauchfell. Anmerkung: In diesem Schritt Carmine Färbung kann, um das Brustepithel innerhalb der gesamten Drüse 43 visualisieren geführt werden. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die globale Morphologie der Brustdrüse unter verschiedenen Bedingungen (physiologische Entwicklungsstadien, Krankheiten in vivo Behandlungen) analysieren. </li><li> Entfernen der Lymphknoten an der Verbindungsstelle der Bauch- und Inguinaldrüsen 44 angeordnet. </li></ol></li><li> Brustgewebefixierung <ol><li> Schneiden das Brustgewebe in 3 mm 3 Fragmente mit einem Skalpell und unmittelbar spülen diese Fragmente in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), pH 7,4, um so viel Milch wie möglich zu entfernen. </li><li> Schnell trocknen die Fragmente auf einem PapierHandtuch und legte sie in einem kalten PBS-Lösung, die 4% Paraformaldehyd (PFA, HCHO, 32% Formaldehydlösung, VORSICHT) für 10 bis 15 Minuten auf Eis. Hinweis: Dies ist genug Zeit, um die nachfolgende Analyse auf Brustgewebeschnitt durch IIF36 und / oder in situ Hybridisierung 45 zu ermöglichen. Jedoch, wie Aldehyd-Fixierungsmittel eindringen eher langsam in Gewebestücke (~ 1-3 mm pro Stunde), kann diese Zeit verlängert werden, um eine optimale Fixierung der Gewebeprobe zu gewährleisten. Alternativ zu beheben Geweben in vivo durch Perfusion eines betäubten Tier mit einem Fixierungslösung (nicht in der vorliegenden Studie beschrieben). </li></ol></li><li> Saccharose Infusions <ol><li> Schnell Spülen der Milch Fragmente in kaltem PBS und tauche sie in kalte PBS-Lösung, enthaltend 40% Sucrose (D-Saccharose, C12H22O11, Mr 342,3 g / mol) für 16 bis 48 h bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li></ol></li><li> Gewebeeinbettung Hinweis: Bei diesem Schritt Brust Fragmente können, um kleinere Fragmente (2-3 mm 3 zu machen erneut geschnitten werden) Oder ihre Form ändern. <ol><li> Richtig beschriften Sie die Kunststoffformen und füllen ein Drittel des Volumens der Form mit OCT-Verbindung, bei RT gehalten. Legen Sie ein Fragment (2-3 mm 3) von Brustgewebe pro Form und decken Sie es mit OCT-Verbindung. </li><li> Platzieren der Formen an der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs (auf einer Platte aus Aluminium oder mit einem metallischen Sieb) und damit das Produkt einfriert. Hinweis: Es muss fest und weiß vor dem Eintauchen der Form in flüssigem Stickstoff zu werden. </li></ol></li><li> Bewahren Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C, bis Gewebeschnitten durchgeführt. </li></ol> 2. Gefrorene Gewebe Sectioning Anmerkung: einen Kryostaten, der im wesentlichen ein Mikrotom in einer Kühltruhe, ist erforderlich, um gefrorene Gewebesektionen vorzunehmen. Eine niedrigere Temperatur wird oft für Fett oder lipidreiche Gewebe wie natives Brustdrüse erforderlich. <ol><li> Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -26 ° C und warten, bis es hat Stabisiert. Pflegen Sie die gefrorenen Gewebeblock bei -26 ° C über den gesamten Schneideverfahren. Absolut zu vermeiden Auftauen des Gewebes zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens. </li><li> Kühlen Sie die Rasierklinge, die Schneidunterlage, die Wankstützeinrichtung und die Bürste bis -26 ° C, indem sie in den Kryostaten für mindestens 10 min. Außerdem legen Sie eine Dia-Box im Inneren des Kryostaten, um in der Lage, Glasobjektträger zu speichern, wie die Schnitte gemacht werden können. </li><li> Richtig beschriften Sie die Glasobjektträger, die verwendet werden, um die Gewebeschnitte bei RT sammeln und diese beibehalten werden; sonst Gewebeschnitte werden nicht an sie halten. Entfernen Sie die Probe aus der Form im Inneren des Kryostaten. Hinweis: Die Verwendung positiv geladenen Objektträgern wird die Haftung der frische Gefrierschnitte stark begünstigt durch höhere elektrostatische Anziehung. </li><li> Decken Sie die Oberfläche eines Metallgewebescheibe mit OCT-Verbindung (bei RT gehalten) und drücken Sie die gefrorene Probe darauf. Platzieren Sie das nasse Halterung im Inneren des Kryostaten und lassen Sie es cool mindestens 15 min. </li><li> Setzen Sie den nassen Halterung in den Plattenhalter des Kryostaten. Stellen Sie die Schnittdicke von 5-6 &amp; mgr; m und, wenn möglich, verwenden Sie eine neue scharfe Klinge oder zumindest ändern Sie den Bereich auf der Klinge verwendet, um jede Probe, da einige Gewebe werden schnell langweilig schneiden. </li><li> Einstellen der Position der Wankstützeinrichtung über den Rasierklingen indem Schnitte der Befestigungsmedium, bis die Scheiben gleichmßig und korrekt gebildet wird. Idealerweise wird die Wankstützeinrichtung über der Rasierklinge um etwa 1 mm treten. </li><li> Wenn die Einstellungen korrekt sind, führen Gewebeschnitte durch Drehen des Rades in einem kontinuierlichen gleichförmigen Bewegung. Es sei denn, die Temperatur ist ideal, ein Gewebeschnitt wird, von der Natur, versuchen Sie, machen Sie es sich. <ol><li> Verwenden Sie eine Bürste, um zu packen und zu manövrieren im Abschnitt über die Bühne, um sie zu legen, wie auf dem Objektträger gewünscht. Verwenden Sie den Pinsel zu bereinigen die Reste gegebenenfalls auf der gefrorenen Gewebeblock und / oder der Rasierklinge vorhanden. </li></ol></li><li> ziehender Gewebeschnitt in Richtung des Benutzers und zur Vermeidung von Eindrücken auf den Kryostaten Bühne. Nicht auf die Gewebeabschnitt auf den Kryostaten Stadium, da es zu der Adhäsion der Gewebescheibe auf der Bühne und damit die Unfähigkeit, mit dem Glasträger wiederherzustellen führen. </li><li> Abrufen Gewebeschnitte einzeln durch abholen an der Oberfläche eines Glasobjektträger, indem Sie sie über dem Bereich und Angel es nach unten, um den Gewebeschnitt zu berühren. Hinweis: Die Gewebeschnitte schnell auf die warme Glas haften durch statische Anziehungskraft. Wenn mehrere Gewebeschnitte werden auf demselben Objektträger gelegt, darauf achten, sie nicht zu überlappen und um Platz zu ihnen genug, um einzeln schließen Sie sie in einem hydrophoben Kreis sein (siehe Abschnitt 3.1.1.). </li></ol> 3. Die indirekte Immunfluoreszenz <ol><li> Lokalisierung Abschnitten <ol><li> Verwenden Sie eine hydrophobe Sperrstift, um eine hydrophobe Kreis um Objektträger angebrachten Gewebe ziehen. Lassen Sie den Kreis trocken für ca. 1 min bei RT. Zeichnen Sie eine Linie um die tThema Abschnitte mit einem feinen schwarzen Filzstift als gut, aber auf der Seite der Glasobjektträger gegenüber der einen, wo die Gewebeschnitte sind. Hinweis: Dieser Kreis ist wasserabweisend und Aceton und Alkohol unlöslich. Es ist daher ein Hindernis für die während der IHC Verfahren verwendeten wässrigen Lösungen und verringert das Volumen der erforderlichen Reagenzien. </li><li> Rehydrieren Gewebeschnitte von ihnen bedeckt mit einem Tropfen von ~ 250 &amp; mgr; l PBS für ein paar Minuten bei RT. Fix Gewebeschnitte von ihnen Abdecken mit ~ 250 &amp; mgr; l einer frisch hergestellten 3% PFA-Lösung in PBS für 10 bis 15 min. Hinweis: Wahlweise in diesem Fall verwenden Sie einen Aldehyd Abschrecken Lösung (50 mM Ammoniumchlorid (NH 4 Cl, Herr 53,5 g / mol) in PBS oder 0,1 M Glycin (C 2 H 5 NO 2, Mr 75,07 g / mol) in PBS ), um die Fixierungsreaktion zu stoppen. Einfache und reichlich PBS waschen ist in der Regel ausreichend, um nicht umgesetzte Aldehyd zu entfernen. </li></ol></li><li> Antigen-Retrieval (optional) <br/&gt; Anmerkung: Während die meisten Antigene können ohne Antigen Retrieval (AR) nachgewiesen werden, andere werden nur dann beobachtet, wenn dieser Schritt durchgeführt werden. In einigen Fällen ermöglicht AR auch die Verbesserung des beobachteten Signals. <ol><li> Legen Sie das AR-Lösung (100 mM Tris (C 4 H 11 NO 3, Herr 121,14) 5% Harnstoff (NH 2 CONH 2, Mr 60,06) pH 9,6) in einem Becherglas. Das Volumen der AR-Lösung muss ausreichen, um die Glasobjektträger in einem Glashalter platziert vollständig zu decken. </li><li> Heizen Sie den AR-Lösung auf 95 ° C durch die Überwachung der Temperatur mit einem Thermometer und dann die Glasobjektträger auf einem geeigneten Gestell, tauchen Sie das Rack in der heißen Puffer, Abdeckung, um Verdunstung zu begrenzen und Inkubation für 10 min bei 95 ° C. </li><li> Das Becherglas aus dem Wasserbad und lassen Sie die Glasobjektträger weitere 10 Minuten im Puffer. </li></ol></li><li> Immundetektion <ol><li> Spülen Gewebeschnitte mit PBS (~ 250 &amp; mgr; l / Schnitt) und sättigen sie mit einer Lösungvon 3% Rinderserumalbumin (BSA, ~ 250 &amp; mgr; l / Schnitt) in PBS für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Gesetzt 30-50 ul des primären Antikörpers in PBS mit 2% BSA für jedes Gewebeschnitt verdünnt. Anmerkung: Dieser Band ist genug, um einen Tropfen, der den Gewebeschnitt vollständig bedeckt. </li><li> Stellen das gleiche Volumen des Verdünnungsmittels (2% BSA in PBS) alleine auf einem Gewebeschnitt, eine negative Kontrolle ohne primären Antikörper durchzuführen. <ol><li> Systematisch, um diesen Negativkontrolle in jedem IHC Experiment und führen für jeden sekundären Antikörper verwendet, um den Hintergrund des Experiments abzuschätzen (nicht-spezifische Markierung aufgrund des sekundären Antikörpers und / oder der Gewebeautofluoreszenz). Andere Arten von positiven oder negativen Kontrollen kann auch durchgeführt werden, um die Spezifität der Markierung zu gewährleisten (siehe Diskussion). </li></ol></li><li> Legen Sie die Glasobjektträger in einer feuchten Box O / N bei 4 ° C. Hinweis: Primäre Antikörper waren monoklonale Maus-Anti-Cytokeratin8 (CK8, Verdünnung 1:50), monoklonalen Maus-anti-Cytokeratin 14 (CK14, Verdünnung 1:50), polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Casein (# 7781, Verdünnung 1:50, großzügig von MC Neville, University of Colorado Health bereitgestellt Sciences Center, CO, USA), polyklonalen Kaninchen-anti-btn1 (1: 300 Verdünnung, großzügig von IH Mather, Abteilung Tier und Avian Sciences, University of Maryland, College Park, MD, USA), polyklonalen Kaninchen-anti-Stx6 (bereitgestellt Verdünnung 1:50, großzügig von S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, London, Großbritannien) und polyklonalen Kaninchen-anti-VAMP4 (1:50 Verdünnung) zur Verfügung gestellt. </li><li> Gründlich Gewebeschnitte mit PBS mindestens viermal für 10 min bei RT. </li><li> Verdünne den geeigneten sekundären Antikörper (Rhodamin-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), 1: 300 Verdünnung) in PBS, enthaltend 2% BSA, legen 30-50 ul dieser Lösung auf allen Gewebeschnitten, und Inkubation für 1,5 h bei RT. <ol><li> Seit Fluorochrome sind lichtempfindliche Moleküle, nichtaussetzen Gewebeschnitte, um Licht bis zu ihrer Analyse. Für IIF an Gewebeschnitten, begünstigen Sekundärantikörper auf einem roten Fluorophor gekoppelt seit Zellmembranen sind in der Regel eine grüne Autofluoreszenz, die mit geringer Kennzeichnungs stören können generieren. Außerdem die Wahl eines roten Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte sekundäre Antikörper ermöglicht die gleichzeitige Markierung von neutralen Lipiden (siehe unten). </li></ol></li><li> Gründlich die Gewebeschnitte mit PBS mindestens viermal waschen für 10 min bei RT. </li></ol></li><li> Postfixierung (optional) <ol><li> Für einige Experimente durchzuführen Postfixierung durch Inkubation der Proben mit 2% PFA in PBS für 10 min bei RT, verdünnt, um die Antigen / Antikörper-Gerüste zu stabilisieren. Allerdings kann dieser Schritt in den meisten Fällen verzichtet werden. </li></ol></li><li> Neutralen Lipiden und DNA-Gegenfärbung <ol><li> Um CLDs und MFG, Farbe neutralen Lipiden durch Inkubation von Gewebeschnitten in 30-50 ul einer PBS-Lösung, enthaltend 3 ug / ml des Bodipy 493 visualisieren/ 503 10 min bei RT. Schnell Gewebeschnitte zweimal mit PBS spülen. </li><li> Gegenfärbemittel nuklearen DNA mit 30-50 ul einer PBS-Lösung, die 3 uM DAPI (4-6-Diamidino-2-phenylindol, 5 mg / ml Stammlösung) 10 min bei RT. Die Gewebeschnitte vor der Montage der Folien für die Beobachtung zweimal mit PBS waschen. </li></ol></li><li> Abschnitt Montage <ol><li> Entfernen PBS und setzen Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf jedem Gewebeschnitt. </li><li> Legen Sie eine Seite des Deckglases in einem Winkel gegen den Schieber, den Kontakt mit der Außenkante der Flüssigkeitstropfen und senken Sie dann langsam den Deckel, Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Flüssigkeit zwischen dem Objektträger und Deckglas für ein paar Minuten zu verbreiten und dann entfernen Sie das überschüssige Eindeckmedium mit einem Papiertuch. </li><li> Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack und speichern Gewebeschnitte bei 4 ° C auf ihre Belichtung bis Beobachtungs verhindern. </li></ol></li></ol>4. Fluoreszenzbeobachtung und Image Acquisition Hinweis: Ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Kamera durch eine Bildaufnahme-Software gesteuert wird, erforderlich, um die Ergebnisse zu beobachten IHC ausgestattet. <ol><li> Vor der Erfassung von Bildern, überprüfen Sie die Intensität der Kennzeichnung und Bewertung der Hintergrund des Experiments, indem man die negativen Kontrollen. Erwerben Sie Bilder von jedem Fluoreszenzmarkierung (Farbkanal) einzeln. </li><li> Erwerben Sie alle Bilder, auch die der entsprechenden Kontrollen bei den gleichen Bedingungen (Belichtung und allgemeine Einstellungen) für jeden Farbkanal. </li><li> Konventionelle Mikroskopie <ol><li> Führen Epifluoreszenzmikroskopie mit einem Mikroskop mit Standard-Filter für Fluoresceinisothiocyanat (FITC, grün), Rhodamin (rot) und DAPI (blau) Emissionen ausgestattet, × 20-63 (Öl-Immersion, NA 1.3) Ziele und eine DP50 Bildkamera ×. </li></ol></li><li> Konfokale Mikroskopie </li><li> Führen konfokale Mikroskopie mit microsBewältigung der ZEN-Software ausgestattet, mit × 20-63 (Öl-Immersion, NA 1.4) Ziele und die 488- und 568-nm-Anregungswellenlängen des Laser ×. </li></ol> 5. Bild Behandlung Hinweis: Alle Bild Nachbehandlungen werden mit dem ImageJ freie Software (http://imagej.nih.gov/ij/) durchgeführt. <ol><li> Bild überlagern (Merge) <ol><li> Öffnen Sie die in jedem Kanal, die kombiniert werden (Datei / Öffnen) erfassten Bilder. Wenn die Arbeit mit 8-Bit-Graustufenbilder, Attribut künstliche Farbe, die jedem Kanal unter Verwendung der Nachschlagtabelle (Bild / Lookup Tables). </li><li> Generieren Sie das zusammengesetzte Bild von Graustufen- oder Farbbilder mit dem Befehl &quot;Zusammenführen Kanäle&quot; (Bild / Farbe / Merge-Kanäle) und dann Zuordnung einer Farbe zu jedem Kanal. </li><li> Führen Sie Bildstapeln Überlagerung auf die gleiche Weise durch Öffnen Stapel in jedem Kanal, die kombiniert werden sollen (Datei / Öffnen) erworben und mit dem Befehl &quot;Zusammenführen Kanäle &amp;# 8221; (Foto / Farbe / Merge-Kanäle), um eine Farbe für jeden Kanal zuzuordnen. Speichern Sie die Verbundstapel als Bildsequenz oder als Film (siehe Abschnitt 5.4). </li></ol></li><li> Bildstapel Z Projektions <ol><li> Verwenden Sie die Z-Projektionsfunktion (Bild / Stapeln / Zproject, Max Intensity), um eine zweidimensionale Darstellung aller Bilder eines Bildstapels durch Projektion entlang der Achse senkrecht zur Bildebene (z-Achse) zu liefern. Die Option &quot;Maximum Intensity&quot; erstellt ein Bild, in dem jedes Pixel den Maximalwert über alle Bilder im Stapel enthält. Dies erzeugt ein Einzelbild ermöglicht die Visualisierung des gesamten durch den ganzen Stapel für einen bestimmten Kanal oder nach der Überlagerung von mehreren Kanälen beobachtet Färbung. </li></ol></li><li> Bildstapel 3D-Projektion <ol><li> Verwenden Sie die 3D-Projektion-Befehl (Bild / Stapeln / 3D-Projekt, hellste Punkt, y-Achse), eine Folge von Projektionen eines rotierenden Volumen auf eine Ebene zu erzeugen. Die visuelle Darstellung der surfaces und internen Strukturen hängt sowohl von der Projektionsverfahren (nächste Punkt, hellste Punkt (verwendet) oder Mittelwert) und die Visualisierungsparameter ausgewählt. Jeder Rahmen des Animationssequenz ist das Ergebnis von einem anderen Betrachtungswinkel vorsteht. </li><li> Drehen Sie das erstellte 3D-Bild um jede der drei orthogonalen Achsen (hier wurde die y-Achse gewählt). Speichern Sie das als ein einzelnes Bild oder eine Filmsequenz hergestellt. </li></ol></li><li> Bildstapel, um Film Umwandlung <ol><li> Öffnen Sie ein Bild Stapel (Datei / Öffnen) und speichern Sie es als Film im AVI-Format mit dem Befehl &quot;AVI&quot; (Datei / Speichern unter / AVI). </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

IHC ist eine relativ einfache und direkte experimentelle Methode an Antigen in Gewebeschnitten, die in erster Linie auf spezifische Epitop-Antikörper-Wechselwirkungen abhängt lokalisieren. Obwohl eine große Anzahl von Protokollen verwendet werden, um ein Protein von IIF zu lokalisieren, ist der Kern dieser Verfahren fast immer gleich. Es gibt jedoch einige wichtige Aspekte, die einen starken Einfluss auf das Ergebnis und müssen daher für jede einzelne IHC Studie optimiert werden. Der schwierigste Aspekt dieses Ansa...

Die Brustdrüse ist ein atypisches Säugetier exokrinen Organ, dessen Hauptfunktion ist die Milch für Neugeborene zu ernähren. Die Entwicklung der Brustgewebe tritt vor allem nach der Geburt und wird durch ein einzigartiges Verfahren, in dem das Epithel dringt in die umgebenden Stroma ist. Dieses Gewebe viele Veränderungen (Wachstum, Differenzierung und Regression), insbesondere während des Erwachsenenlebens gleichzeitig mit Variationen in der Fortpflanzungszustand (Figur 1). Zusätzlich zu der Gesamtmorphologie des Gewebes, wobei die Anteile der verschiedenen Zelltypen sowie deren Anordnung innerhalb des Brustdrüsen dramatisch während der Entwicklung 1-5 ändern. Während des embryonalen Lebens leitet das Brustepithel von Brustmilchleitungen, die durch eine geringfügige Verdickung und Schichtung des Ektoderms definiert ist, zwischen den Vorder- und Hinterbeinen an jeder Seite der Mittellinie herum Embryonaltag 10,5 (E10,5) (1A ).Auf E11.5 bricht der Milchleitung in einzelne Plakoden, die symmetrisch entlang der Brustmilchleitung an reproduzierbaren Stellen positioniert werden, und die umgebende Mesenchym beginnt zu kondensieren. Die Plakoden beginnen, tiefer in die Dermis Waschbecken und die Brust Mesenchym organisiert in konzentrischen Schichten rund um die Brustknospe (E12.5-E14.5). Ab E15.5 die Brustepithel, beginnt sich zu vermehren und zu verlängern, um die primäre sprießen, die durch den Brust Mesenchym gegen die Fettpolster drückt bilden. Der primäre Spross entwickelt ein hohles Lumen mit einer Öffnung an der Haut, durch die Ausbildung des Nippels Hülle gekennzeichnet. Auf E18.5 hat die Verlängerung Kanal in die Fettpolster gewachsen und hat sich zu einem kleinen arborized Gangsystem in das Fettpolster umgeben verzweigt. Im Wesentlichen wird festgenommen und die rudimentäre Brustdrüsen bleibt morphogenetisch Ruhe bis zur Pubertät. Beim männlichen Embryo, die Aktivierung des Androgen-Rezeptoren führt zur Degeneration der Knospen, die verschwindenvon E15.5. Ab E18, hört bis zur Pubertät 6-9 Brustentwicklung. Bei der Geburt birgt die Brustdrüse ein rudimentäres Gangsystem, der und verlängert Niederlassungen langsam (isometrische Wachstum). Am Beginn der Pubertät, kugelförmige Gebilde an den Spitzen der Leitungen namens die terminalen Ende Knospen (TEBs), sind aus einer äußeren Schicht der Kappe Zellen und einer mehrschichtigen inneren Kern von Zellen (Körperzellen) gebildet. Diese Strukturen sind hoch proliferative und infiltrieren das umliegende Stroma-Gewebe als Reaktion auf hormonelle Signale. Proliferation innerhalb der TEBS Ergebnisse in duktalen Dehnung, mit Verzweigung Morphogenese gekoppelt. Dieser Prozess führt zur Einrichtung eines Grund epithelialen arborized Netzwerk von dem Nippel (1B Pubertät) ausgeht. Bei ~ 10-12 Wochen nach der Geburt, wenn das Epithel hat die ganze Fettpolster eingefallen, Haltestellen und die Expansion der TEBS verschwinden. Duktale Entwicklung durchläuft dann dynamischen Veränderungen, dh successive Proliferation und Regression von Epithelzellen nach Ovarialzyklen 10 (1B, Erwachsenen). Vom Beginn der Schwangerschaft durchläuft das Brustgewebe wichtigen Wachstums und morphologische Änderungen für die Stillzeit vorzubereiten. Das Brustepithel ausgiebig proliferieren und differenzieren, was zu einem hochverzweigten tubulo-alveolären Netzwerk. Begleitend Brustepithelzellen (MEC) polarisiert und in der Lage, synthetisieren und sezernieren Milchprodukte. MEC organisieren in zahlreiche alveolären Strukturen (Acini), die von kontraktilen Myoepithelzellen umgeben sind und in einem Stroma der Binde- und Fettgewebe, Blutgefäße und Nervenenden (1B, Schwangerschaft) zusammengesetzt eingebaut. Weiterhin wird die basale Seite des MEC in engem Kontakt mit der Basalmembran (extrazelluläre Matrix) und Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Einheiten eng regulieren sowohl die Morphogenese und sekretorische Funktion der Mammary Epithel 11-13. Alle diese Verfahren beruhen auf der Wirkung verschiedener Umweltsignale, von denen die wichtigsten sind hormones14, parakrine Faktoren und der extrazellulären Matrix. Zum Beispiel, Progesteron induziert umfangreiche Seitenverzweigung 15 und alveologenesis, dass in Kombination mit Prolaktin (PRL) 16,17 fördert und pflegt die Differenzierung der Lungenbläschen. Zusätzlich zu Steroiden und PRL18, Zytokine und Signalwege mit Entwicklung verbunden (Wnt und Notch Signalwege) sind ebenfalls in Brustlinie Engagement und Entwicklung 19-21 beteiligt. Am Ende der Schwangerschaft, beginnen die luminale MEC um eine proteinreiche Milch Kolostrum im Lumen der Alveolen bekannt herzustellen. Außerdem fungiert Progesteron auf den epithelialen Permeabilität und da die Tight Junctions sind noch offen ist Kolostrum auch in den mütterlichen Blutstrom gefunden. Nach der Geburt, die Mammary Epithel nimmt fast die gesamte Brustdrüsenvolumens und ist hoch organisierten (Abbildung 2, Brustepithel). Milch erzeugenden Einheiten, nämlich Alveolen (Abbildung 2, Alveole) werden von einer Monoschicht von polarisiertem Brustepithelzellen sekretorischen Zellen (MESCs) gebildet ist, mit ihren apikalen Plasmamembran, die das Lumen begrenzende. Alveolen ordnen sich in die Läppchen, die in Lappen, um Kanäle, die Milch an die Außenmilieu (Abbildung 2, Lappen) Drain gruppiert sind. Laktation auftritt, dh., MESCs beginnen reichliche Mengen von Milch, vor allem durch den Rückgang der Plazentahormone (hauptsächlich Progesteron) (1B, Laktation) ausgelöst absondern. Milchprotein-Gene sind in einer definierten zeitlichen zeitlichen Verlauf von Schwangerschaft Laktation 9,22,23 hauptsächlich in Reaktion auf Hypophysen PRL bei der Säugezeit Freigabe aktiviert. Begleitend Kontakte zwischen MESCs und der extrazellulären Matrix sowohl stimulieren Milchprotein synthesis durch Signale, die über die Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrinen und Laminin 24,25 vermittelt werden, und die Apoptose in MESCs 26,27 zu unterdrücken. Diese Signalwege führen zu der Aktivierung von Milchprotein-Genpromotoren 28 durch die Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren 29. Zell-Zell-Kontakte sind ebenfalls wichtig für einige Aspekte der Differenzierung einschließlich der Einrichtung apikalen Polarität und vektoriellen Sekretion von Milchprodukten. Tight Junctions stark nahe nach dem Beginn der Laktation und MESCs fein orchestriert die Aufnahme von Molekülen aus dem Blut sowie die Synthese, den Transport und die Sekretion von Milchbestandteilen, in Reaktion auf die Ernährungsbedürfnisse von Neugeborenen. Zum Zeitpunkt der Säugezeit erfolgt die Kontraktion der Myoepithelzellen umgibt die Alveolen als Reaktion auf Oxytocin und führt zu Milchejektion durch die Kanäle und in die Nippel. Milch ist ein komplexes Fluid, das Proteine ​​enthält (hauptsächlichCaseine), Zucker (hauptsächlich Lactose), Lipiden und Mineralien sowie bioaktiven Molekülen, wie Immunglobulinen A (IgA), Wachstumsfaktoren und Hormone. Caseine synthetisiert, in supramolekularen Strukturen zusammengesetzt, nämlich Caseinmicellen entlang des sekretorischen Wegs transportiert werden und dann durch Exozytose frei, also die Verschmelzung von caseinhaltigen sekretorischen Vesikel (SV) mit der apikalen Plasmamembran der MESC (Abbildung 2). Intrazelluläre Verkehr stützt sich auf Material des Austauschs zwischen membranFächern und beinhaltet Lösliche N-Ethylmaleimid-Sensitive Fusion (NSF) Befestigung Protein (SNAP) Rezeptor (SNARE) 30,31. Die SNARE-Proteine ​​der Familie ist in vesikulären SNAREs (v-SNAREs), in der Vesikelmembran Gegenwart und Ziel SNAREs (t-SNAREs), auf die Zielmembranen lokalisiert unterteilt. Durch Komprimieren durch ihre Coiled-Coil-Domänen, V- und T-SNARE versammeln, um eine hochstabile Vierhelixbündel-Komplex zu bilden, bezeichnet als the SNARE-Komplex. Dieser Komplex fördert die Fusion von zwei gegenüberliegenden Lipiddoppelschichten durch die schrittweise bringen sie in die Nähe 30,32. Danach werden SNARE-Komplexen durch die NSF Adenosintriphosphatase dissoziiert und seine Adapter Protein SNAP und SNARE-Proteine ​​sind zurück in ihre Herkunftsfach 33 zurückgeführt. Interessanterweise liegt überwiegend jeweils SNARE-Protein in verschiedenen zellulären Kompartimenten und SNARE Paarung kann die Spezifität der intrazellulären Fusionsereignisse 34 beizutragen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass zumindest Synaptosomale-Associated Protein 23 (SNAP23) und Vesikel-assoziiertes Membranprotein 8 (VAMP8) und Syntaxinen (STX) -7 und -12 eine Rolle bei Casein Exozytose 35,36. Diese Proteine ​​wurden ebenfalls in Verbindung mit der Lipidfraktion von Milch, das heißt Milchfettkügelchen (MFG) 37 gefunden. Die aktuelle vorherrschende Modell postuliert, dass zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (CLDs) sind durch die Akkumulation von neutralen l gebildetipids (hauptsächlich Triglyceride und Sterolester) und Cholesterin aus der Ernährung der Mutter zwischen den beiden Blättchen des endoplasmatischen Retikulums (ER) -Membran 38-41 abgeleitet ist. Große CLDs ausgebildet sind, zumindest teilweise durch die Fusion von kleineren CLDs während es an die apikalen Seite MESCs wo sie als MFG freigegeben werden (1-10 &amp; mgr; m im Durchmesser) durch Knospung transportiert, wobei durch den MESC apikalen Plasmamembran umhüllt 40-42. Stillzeit aufhört, nachdem Welpen entwöhnt und die MESCs schrittweise sterben durch Apoptose, was zur Rückbildung des Brustgewebe wieder zu einem pubertären Zustand (1B, Rückbildung). Immunfluoreszenz (IF) ist ein in fast allen Bereichen der Biologie verwendet gemeinsamen analytischen Labormethode, sowohl in der Forschung und in der klinischen Diagnostik. IF-Techniken können auf Gewebeschnitten durchgeführt werden (Immunhistochemie, IHC) oder Zelle (Immunzytochemie, ICC) Proben. Diese leistungsstarke Ansatz beruht auf der Verwendung von Leuchtstoff-markierte Antikörper, die spezifisch an die (direkt oder indirekt) mit dem Antigen von Interesse, wodurch die Visualisierung der Verteilung im Gewebe durch Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenzsignale meist hängen von der Qualität und der Konzentration der Antikörper und sachgemäße Handhabung der Probe. Eine einfache indirekte Immunfluoreszenz (IIF) -Protokoll wird präsentiert, um Milcherzeugnisse (Kaseine und MFG) und Proteinen in Milchprodukt Sekretion beteiligt erkennen (butyrophilin (btn1), SNARE-Proteine) an Gefrierschnitten von Mausbrustgewebe (Abbildung 3). Während dieses Protokoll bietet eine komplette Übersicht IHC reichen von Gewebesammlung für Bild Nachbehandlung, kritische und optionale Schritte sowie einige technische Empfehlungen werden ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
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			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

Indirekte Immunfluoreszenz dient zum Erfassen und Lokalisieren von interessierenden Proteinen in einem Gewebe. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein vollständiges und einfaches Verfahren für die Immunerkennung von Proteinen, wobei die Maus laktierenden Milchdrüse als ein Beispiel genommen. Ein Protokoll für die Herstellung von Gewebeproben, insbesondere in Bezug auf die Präparation von Maus-Brustdrüsen, Gewebefixierung und gefrorenem Gewebe Schnitte, sind detailliert. Ein Standardprotokoll, um die indirekte Immunfluoreszenz durchführen, einschließlich eines optionalen Antigen-Retrieval-Schritt wird ebenfalls vorgestellt. Die Beobachtung der markierten Gewebeschnitte als auch die Bildaufnahme und Nachbehandlungen sind ebenfalls angegeben. Dieses Verfahren ergibt eine vollständige Übersicht, aus der Sammlung von Tiergewebe auf die zelluläre Lokalisation eines Proteins. Obwohl diese allgemeine Methode kann auf andere Gewebeproben angewendet werden, sollte es zu jedem Gewebe / primären Antikörper paar studierte angepasst werden.

Die Brustdrüse ist eine subkutane Drüse entlang der ventralen Struktur sowohl des Thorax und des Abdomens bei Nagern entfernt. Die Lage der fünf Paare von Drüsen der Maus während der Schwangerschaft ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Morphologie der Brustdrüse drastisch ändert sich während seiner Entwicklung, was auf funktionelle Änderungen erforderlich, um für die vollständige Stillzeit (Abbildung 1B) vorzubereiten. In Jungfrau oder nulliparous Tieren, die Brus...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

36.7K Aufrufe.  INRA.  Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren. 

Serie: Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Brustepithelzellen Transplantation

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Änderungen der Brustdrüsen Morphologie und Breast Cancer Risk in Ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...