Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Akademie Finnlands [315948, 314387 bis N.K.] unterstützt; Sigrid Jusélius Stiftung [nach N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [to J.-A.M., T.L.]; Turku Doktoratsstudium molekulare Medizin [S.C.-M., O.O.].

Die Wartung von Labormäusen und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der Universität Turku durchgeführt.
1. Herstellung von seminiferen Tubuli für die Mikrodissektion
<ol><li>Opfern Sie eine erwachsene männliche Maus (≥8 Wochen alt, Hoden 80–120 mg je nach Stamm und Alter) durch CO 2-Erstickung gefolgt von zervikaler Dislokation. HINWEIS: Die Maus sollte geschlechtsreif und vorzugsweise mindestens 8 Wochen alt sein. Transilluminationsmuster von jugendlichen Mäusen unterscheidet sich von Erwachsenen, weil die Welle des seminiferösen Epithels noch nicht vollständig etabliert ist, und das Timing der ersten Welle der Spermatogenese ist deutlich21,22. Der Mangel an länglichen Spermaatiden bei <4 Wochen alten männlichen Mäusen schließt ihre Verwendung für transilluminationsunterstützte Mikrodissektion aus. Alle Mausstämme, die eine normale Spermatogenese haben, können verwendet werden.</li>
	<li>Sprühen Sie den ventralen Bauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die abdominobeckende Kavität mit einer sterilen Schere, wodurch eine V-förmige Öffnung entsteht.</li>
	<li>Ziehen Sie das epididymale Fettpolster mit sterilen Zangen, lokalisieren Sie die Hoden, sezieren Sie sie mit einer Schere und legen Sie sie auf eine sterile 100-mm-Petrischale, die PBS enthält. HINWEIS: Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass alle Laborwaren und chirurgischen Werkzeuge steril sind.</li>
	<li>Mit einer feingekippten Schere entkapseln Sie die Hoden, indem Sie einen Schlitz in der Tunika albugineaschneiden, dem dicken Faserblech, das die Hoden einkapselt. Dann reißen Sie die Tunika mit einem Paar Zange auf. Zwingen Sie die Tubuli durch Drücken mit Zangen und entsorgen Sie die Tunika. HINWEIS: Beim Wegwerfen der Tunika könnte es für einige nachgelagerte Anwendungen von Vorteil sein, dass arteria hoicularis zusammen mit der Tunika entfernt wird. Vermeiden Sie eine Beschädigung der seminiferous tubulies.</li>
	<li>Bewegen Sie die seminiferous Tubuli zu einer neuen Petrischale und gießen Sie genug sterile PBS, um den Boden der Petrischale zu bedecken. Als nächstes ziehen Sie die Tubuli vorsichtig auseinander, vermeiden aber, die Tubuli zu beschädigen. HINWEIS: Zu viel mechanische Beanspruchung wirkt sich auf das Transilluminationsmuster aus und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit des Gewebes und seiner zellulären Architektur. Die Tubuli können ab diesem Zeitpunkt auch für ganzmontierte Immunostainierungen ohne Inszenierung (3B) verarbeitet werden. Manchmal reicht es aus, das Stadium nachträglich zu definieren, indem Antikörper gegen Proteine, die in differenzierender Spermatogonie exprimiert werden, wie SALL4, c-KIT und DNMT3A18,23,eingeschlossen werden. Die Dichte der Spermatogonie ist ein relativ zuverlässiger Indikator für die Stufe (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Transilluminationsunterstützte Mikrodissektion
<ol><li>Legen Sie die Petrischale unter ein Seziermikroskop fest, indem Sie sie auf die Bühne kleben. HINWEIS: Es ist wichtig, die Petrischale gut zu kleben, um ihre Bewegung zu verhindern, die eine Vermischung der gesammelten inszenierten seminiferen Tubulensegmente verursachen könnte.</li>
	<li>Um das Lichtabsorptionsmuster von seminiferen Tubuli unter Fokus zu enthüllen, stellen Sie sicher, dass die Probe von unten beleuchtet wird und das Licht durch die Probe geht, d.h.es wird transbeleuchtet. ANMERKUNG: Die Menge des absorbierten/gestreuten Lichts ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad in länglichen Spermaatiden und ihrer Bündelung im Seminifer-Tubuli: Je kondensierter, desto mehr Licht absorbiert wird, d. h., erscheint dunkler.</li>
	<li>Machen Sie sich mit dem Lichtabsorptionsmuster verschiedener Stufen vertraut, wie in Abbildung 2, Abbildung 5A und Abbildung S1 beschrieben, indem Sie Tubulenbündel mit feinen Zangen vorsichtig bewegen. HINWEIS: Die Stadien folgen einander immer in einer logischen Reihenfolge und bilden die Welle des seminiferösen Epithels. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass die Richtung der spermatogenen Welle gelegentlich umkehrt und dann wieder zurückkehrt (auch bekannt als Modulationen4,9), was manchmal das Verfahren erschwert. Auch die Länge der einzelnen Stufen, in Bezug auf wie viele mm Tubuli, variiert erheblich.</li>
	<li>Heben Sie den Interessent vorsichtig mit Zangen mit einer Hakenspitze an, und schneiden Sie dann ein Segment von geeigneter Länge mit einer Mikrodissektionsschere (siehe Ergänzendes Video 1). Ein Haken an der Spitze der Zange erleichtert das Heben und Halten eines Tubuli und hilft, ein Drücken zu vermeiden. HINWEIS: Die Länge der zu schneidenden Segmente hängt von nachgelagerten Anwendungen ab. Für die Sammlung von gepoolten Tubulenstücken eines bestimmten Stadiums für die Protein- oder RNA-Analyse12,13 (II–V, VII–VIII und IX–XI, Abbildung 5B) beträgt die Länge typischerweise 2–5 mm. Bei Verwendung der Standard-Phenol-Chlorform-Extraktion können aus 1 mm Tubuli rund 200 ng RNA abgeleitet werden. Bei der Vollmontage der Färbung von inszenierten Tubulesegmenten sollte die Länge der Segmente >5 mm betragen. Bei Squash-Präparaten sollte die Länge der Segmente 1–2 mm nicht überschreiten, da die Zellen in der Mitte des Segments möglicherweise nicht verlassen werden, wenn sie zu lang sind. Verwenden Sie eine mm-Skala unter der Petrischale für eine genaue Messung der Tubuslänge.</li>
</ol>3. Immunostainierung verschiedener Präparate
<ol><li>Squash-Vorbereitung: Stufenverifizierung und Immunfärbung HINWEIS: Bühnenspezifische Tubulenstücke können auf einem Mikroskopschlitten mit einem Deckglas zerquetscht werden, um morphologische Analysen lebender Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie und anschließende Immunfärbung durchzuführen. Ein Anfänger wird empfohlen, diesen Ansatz zu verwenden, um die Stadien zu überprüfen, wenn er mit der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode vertraut wird.<ol>
<li>Sammeln Sie das Segment in einem Volumen von 10 l mit einer Pipette und bewegen Sie es auf ein Mikroskopschlitten.</li>
		<li>Squash die Tubule durch Legen eines Deckglases (20 mm x 20 mm) vorsichtig auf den Tubuli. Als Ergebnis fließen Zellen aus dem Tubuli und bilden eine Live-Zell-Monoschicht. Legen Sie ein Filterpapier auf den Rand des Deckglases, um die Ausbreitung der Zellen zu erleichtern. Vermeiden Sie es, die Zellen zu sehr zu zerquetschen, um sie am Leben zu erhalten.</li>
		<li>Überwachen Sie die Zellausbreitung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit 40-fachem Ziel, um die Phasenerkennung zu überprüfen, indem Sie die vorhandenen Zelltypen untersuchen (Abbildung 2, Abbildung S2).</li>
		<li>Sobald sich die Zellen zu einer runden Monoschicht von beiden Enden des Tubuli ausgebreitet haben, tauchen Sie den Schlitten in einen Behälter, der flüssigen Stickstoff enthält, während Sie ihn mit Zange halten. Halten Sie es 10 s unter Wasser. Alternativ legen Sie die Rutsche zum Einfrieren auf eine Trockeneisplatte.</li>
		<li>Entfernen Sie das Deckglas, indem Sie es mit einem Skalpell abdrehen.</li>
		<li>Fahren Sie ohne Verzögerung mit der Fixierung fort und legen Sie die Rutsche schnell in einen Behälter mit 90% Ethanol für 2–5 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Squash-Zubereitung nicht auftaut, bevor Sie sie auf 90% Ethanol legen. Andere Fixative können auch verwendet werden, wie Aceton, für 10 min.</li>
		<li>Lufttrocken und lagern bei Raumtemperatur (RT) (bis zu einigen Tagen) oder bei -80 °C (langfristig).</li>
		<li>Zur Immunfärbung die Proben in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT nachfixieren.</li>
		<li>In PBS abspülen und mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min permeabilisieren.</li>
		<li>In PBS abspülen und einen Fettring um jede Squashprobe ziehen.</li>
		<li>Fügen Sie 50–100 l von 10% BSA (Rinderserumalbumin) in 0,1% Tween in PBS (PBST) in den Fettring und Blockproben für 30 min bei RT hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie die BSA-Lösung und inkubieren Sie mit einem primären Antikörper, der in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT verdünnt wird.</li>
		<li>Waschen Sie 3x für 5 min mit PBST.</li>
		<li>Inkubieren Sie mit einem sekundären Antikörper, der in 10% BSA in PBST verdünnt wird. HINWEIS: Um die Akrosomen zu färben, können die Proben mit Rhodamine-beschriftetem Erdnuss-Agglutinin-Antikörper (PNA, 1:1000) in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT(Abbildung S3) anstelle spezifischer Primär- und Sekundärantikörper inkubiert werden.</li>
		<li>Waschen Sie 3x für je 5 min mit PBST, spülen Sie mit PBS und montieren Sie mit einem Mountant, das DAPI enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Ganzer Immunfärbung von seminiferösen Tubuli HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Vollmontagefärbung für inszenierte (ab Schritt 2.4) Tubulesegmente. Wenn ein Forscher eine vollwertige Färbung ohne Inszenierung durchführen möchte (ab Schritt 1.5), achten Sie auf Noten in 3.2.1 und 3.2.7.<ol>
<li>Mit einer Pipette die Tubulesegmente (ab Schritt 2.4) in eiskaltem PBS in ein 15 ml kegelförmiges Rohr übertragen und auf Eis sedimentieren lassen. HINWEIS: Wenn Sie nicht inszenierte Tubuli von 1.5. verwenden, trennen Sie die Tubuli in einer Petrischale, indem Sie mehrmals auf eine gekippte Schale pfeifen und zurückpfeifen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette mit einer geschnittenen Spitze. Dieser Schritt soll die Struktur des Gewebes öffnen. Vermeiden Sie jedoch zu viel Pipettierung, da es die Tubuli beschädigen könnte. Die Sedimentation von Tubuli wird einige Dutzend Sekunden dauern. Kleine Tubulenfragmente, interstitielle Zellen und Zellablagerungen bleiben im Überstand.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand (SN) vorsichtig durch Pipettieren oder mit einem Aspirator. 10 ml eiskaltes PBS hinzufügen und durch Inversion mischen.</li>
		<li>Lassen Sie Sediment eimt und dann entfernen SN wie zuvor.</li>
		<li>5 ml 4% PFA hinzufügen und für 5 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei +4 °C fixieren. HINWEIS: Die Fixationszeit hängt von den Proteinen von Interesse und ihrer subzellulären Lokalisierung ab. Für kern- und zytoplasmatische Proteine ist eine 2-h-Fixierung in der Regel ausreichend, jedoch Membranmarker, wie z. B. GFR1 (GDNF-Familienrezeptor alpha 1; Abbildung 6A,B), profitieren von einer längeren Fixierung, bis zu 6 h.</li>
		<li>Sedimentieren zulassen, SN (PFA) wie bisher entfernen und kurz abspülen, indem 10 ml PBS hinzugefügt und das Rohr invertieren.</li>
		<li>Sedimentieren, SN wie bisher entfernen und den PBS-Waschschritt dreimal für jeweils mindestens 10 min auf einem rotierenden Tisch bei +4 °C wiederholen und bei +4 °C färben oder lagern. HINWEIS: Wenn die Arbeitsbedingungen steril sind und die Proben gereinigt werden können, können sie mindestens einige Wochen gelagert und verwendet werden. Alternativ können Sie Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w/v) aus einer 2%igen Stofflösung hinzufügen, um die Tubuli vor der Lagerung bei +4 °C zu erhalten.</li>
		<li>Mit einer 1-ml-Pipette 10–20 feste Tubulisegmente in ein 2-ml-Rundbodenrohr verschieben. SN sedimentieren und entfernen lassen. HINWEIS: Wenn Sie mit langen Tubuli arbeiten, die nicht inszeniert wurden, gießen Sie die Tubuli auf eine Petrischale und schneiden Sie mit Mikrodissektionsschere und Zangen Segmente von etwa 5–20 mm. Zu lange Segmente verwickeln sich während des Färbevorgangs, während zu kurze Segmente leicht verloren gehen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml von 2% BSA + 10% FBS (fetales Rinderserum) in 0,3% Triton X-100 in PBS (PBSX) hinzu. Block für mindestens 1 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) bei RT.</li>
		<li>Spülen Sie mit 1 ml PBSX, entfernen Sie SN durch Pipettieren und fügen Sie 250 L primären Antikörper in 1% BSA in PBSX verdünnt (1:100–1:2000 Verdünnung) hinzu. 2 h bei RT oder über Nacht bei +4 °C auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Pipettieren und spülen Sie die Tubuli mit 1 ml PBSX wie oben beschrieben. Dreimal für 1 h in PBSX auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT waschen. HINWEIS: Nach diesem ersten Waschen kann die Probe bei Bedarf bei +4 °C über Nacht gelassen werden.</li>
		<li>Entfernen Sie SN, und fügen Sie 250 L sekundären Antikörpers hinzu, der in 1% BSA in PBSX verdünnt wird (typischerweise 1:500 Verdünnung eines fluoreszierenden Antikörpers). In Folie abdecken und auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie 3.2.10.</li>
		<li>Entfernen Sie schließlich SN und gießen Sie die Tubuli auf ein Mikroskopschlitten. Mit Gel-Ladespitzen können Sie Tubuli in Linearstreifen sanft trennen und anordnen. Überschüssigen Puffer abtropfen lassen und Montagemedium und Einen Deckelschlupf hinzufügen. HINWEIS: Vermeiden Sie das Trocknen der Tubuli, während Sie sie arrangieren. Eine Gegenfärbung der Kerne mit DAPI ist in den meisten Fällen nicht notwendig. Versiegeln Sie die Kante des Deckels mit Nagellack, um Probentrocknung und Verschlechterung zu verhindern. Dias können vor der Bildgebung 1–2 Wochen lang bei +4 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die oben beschriebene transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht einen stufenorientierten Ansatz zur Untersuchung der Spermatogenese. Die Spermatogenese ist ein hochsynchronisierter Prozess, und alle wichtigen Schritte während der spermatogenen Differenzierung werden stufenabhängig reguliert und ausgeführt, wie Z.B. Differenzierungsverpflichtung (in den Stadien VII-VIII), Beginn der Meiose (VII-VIII), meiotische Teilungen (XII), Beginn der Spermadehnung (VIII) und Spermiation (VIII)1,26,27. Die phasenorientierte Analyse bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um diese besonderen Ereignisse zu untersuchen, die auf bestimmte Schritte der Spermatogenese beschränkt sind und daher nur in definierten Stadien des seminiferen Epithelzyklus gefunden werden. Die Beherrschung der Methode erfordert einige Praxis und die Verwendung eines hochwertigen Seziermikroskops und richtige Beleuchtungsbedingungen sind der Schlüssel zum Erfolg. Die Implementierung dieser Methode als Teil des täglichen Toolkits hat die Fähigkeit, die Wirkung und biologische Relevanz der Forschung über männliche Fortpflanzungsfunktionen erheblich zu verbessern, indem eine genauere Zerlegung molekularer Ereignisse während der Spermatogenese ermöglicht wird.
Alle von uns untersuchten WT-Mausstämme zeigen ein ähnliches Transilluminationsmuster und zeigen konservierte Zellassoziationen in Stadien des seminiferen Epithelzyklus. Unter der Voraussetzung, dass sich die spermiogene Differenzierung von Keimzellen nicht wesentlich von WT-Mäusen unterscheidet, gilt das gleiche auch für alle von uns untersuchten Knock-out-Mausmodelle. Darüber hinaus kann es auf andere Arten angewendet werden, die längsförmige segmentale Anordnung von Stadien des seminiferen Epithelzyklus7aufweisen. Arten mit nicht-segmentalen Stadien (z. B. menschliche Stadien) können jedoch nicht verwendet werden. Angesichts der wesentlichen Rolle der Chromatinkondensation bei der Festlegung des Transilluminationsmusters bei der Definition des Transilluminationsmusters ist klar, dass jede Fehlregulation dieses Prozesses unweigerlich die Umsetzung dieser Methode beeinträchtigen wird. Bei jugendlichen Mäusen und jungen Erwachsenen (5-6 Wochen) ist das Transilluminationsmuster noch nicht vollständig etabliert, daher sollten nur Mäuse verwendet werden, die älter als 8 Wochen sind. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass das Drücken und Ziehen der Tubuli unweigerlich auf das Transilluminationsmuster einwirkt, da es die zelluläre Architektur innerhalb des seminiferen Epithels verzerrt.
Die isolierten seminiferen Tubulensegmente können auch kultiviert werden, was die Ex-vivo-Beobachtung und Manipulation von Spermatogenese-gekoppelten Prozessen, einschließlich Meiose, ermöglicht. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten und den Abbau von RNA und Protein zu verhindern, sollten die Proben nicht mehr als 2 Stunden nach dem Opfern der Maus gesammelt und verarbeitet werden. Für ex vivo Kultur der seminiferous tubulies, sollte die Zeit vom Opfer bis zum Beginn der Kultur nicht mehr als 1 Stunde. Die Integrität von Tubule-Fragmenten kann in der Regel bis zu 72 Stunden in vitro aufrechterhalten werden, wenn sie richtig geerntet werden.
Das Stadium des seminiferen Epithelzyklus kann mit einer Phasenkontrastmikroskopie von Squashpräparaten16überprüft und noch genauer definiert werden. Die Mikroskopie wird an lebenden Zellen durchgeführt, was eine zusätzliche Dimension in die Analyse einführt und die Beobachtung von Organellen- oder Zellbewegungen in bestimmten Stadien der Spermatogenese28,29,30ermöglicht. Die Phasenkontrastmikroskopie liefert eine exakte Inszenierung für die nachfolgende Immunfärbung, die eine sehr detaillierte Analyse der Proteinexpression und Lokalisierungsdynamik während der Spermatogenese ermöglicht, einschließlich stufenspezifischer Veränderungen.
Während Zellen in Squashpräparaten aus dem epitheliaalen Kontext freigesetzt werden, ermöglichen ganzmontierte Immunostainierungen von Tubulisegmenten die Untersuchung von spermaatogenen Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Daher können Vollmontagepräparate eine bessere Visualisierung der seminiferous tubbule Architektur und ihrer interzellulären Kontakte bieten als die Immunfärbung auf Querschnitten. Wichtig ist, dass die transilluminationsunterstützte Inszenierung der Tubulesegmente vor der Immunfärbung den Ansatz noch stärker macht, indem Informationen über die spezifische Stufe eines bestimmten Segments eingebunden werden. Die Vollfärbung ist ein besonders nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Zellen an der Peripherie seminiferöser Tubuli, wie peritubululare Myoidzellen, peribuläre Makrophagen und Spermatogonie, könnte aber auch neue Erkenntnisse in der Forschung an meiotischen und postmetiotischen Keimzellen eröffnen.

Die Differenzierung männlicher Keimzellen von diploiden Spermatogonien zu reifen haploiden Spermatozoen, d.h.Spermatogenese, ist ein komplexer Prozess, der im Epithel von seminiferen Tubuli in den Hoden eines sexuell reifenIndividuums1 stattfindet. Mitotische Nachkommen von A1-Spermatogonien teilen sich zuerst fünfmal, um die differenzierungsgebundene Population zu erweitern, und treten dann als Spermatozyten ein, die letztlich zu haploiden Spermatoiden führen. Die Differenzierung von runden Spermien in Spermatozoen, d.h.Spermiogenese, beinhaltet komplexe Veränderungen in der zellulären Morphologie, einschließlich nuklearer Verdichtung und Konstruktion von spermienspezifischen Strukturen wie dem Akrosom und dem Flagellum. In der Maus dauert der gesamte Prozess der Spermatogenese 35 Tage, um2,3.
An jedem Gebietsschema beherbergt das Seminiferepithel bis zu fünf Kohorten differenzierender Keimzellen sowie der Keimbahnstamm-/Vorläuferzellen und der somatischen Sertolizellen1. Differenzierende Keimzellen bilden konzentrische Schichten, deren Zusammensetzung vorhersagbar ist, und haploide Zellen in einem bestimmten Entwicklungsschritt immer mit bestimmten Arten von Spermatozyten und Spermatogonie4,5assoziieren. Daher beherbergt jeder Querschnitt eines Tubuli Kohorten von Keimzellen mit konstanter Zusammensetzung. Diese spezifischen Zellassoziationen werden als die Stadien des seminiferen Epithels definiert. Stufen an sich stellen keine stagnierenden Kontrollpunkt-ähnlichen Zustände dar, sondern entwickeln sich ständig weiter, wenn die Differenzierung von Keimzellkohorten in Synchron1,2,6fortschreitet. Bei Mäusen gibt es 12 Stufen (I-XII)2, die segmental entlang der Längsachse des seminiferösen Tubuli angeordnet sind, und sie folgen einander in einer logischen Reihenfolge und bilden so die Welle des seminiferösen Epithels oder der spermaatogenen Welle7,8,9 ( Abbildung1). Die Vollendung der Spermatogenese dauert vier Zyklen, und hierarchische Schichten oder Kohorten von differenzierenden Keimzellen innerhalb eines seminiferösen Tubbulenquerschnitts sind zeitlich ein Seminiferzyklus voneinander entfernt. Die Länge des Zyklus ist artabhängig und in der Maus dauert jeder Zyklus 8,6 Tage10.
Die Stadien können auf der Grundlage der zellulären Zusammensetzung und Organisation des seminiferen Epithels auf den histologischen Hodenabschnitten5 (Abbildung 1 und Abbildung 2) identifiziert werden. Die histologische Analyse ist jedoch mühsam, zeitaufwändig und erfordert eine Fixierung und Färbung und kann daher nicht auf lebendes Gewebe angewendet werden. Wichtig ist, dass die Inszenierung auch auf lebendem Gewebe unter einem Seziermikroskop durchgeführt werden kann, indem die unterschiedlichen Lichtabsorptions-/Streumuster genutzt werden, die in verschiedenen Stadien des Zyklus dargestellt werden (Abbildung 2). Die Fähigkeit jeder Stufe, Licht zu absorbieren und zu streuen, ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad der späten postmeiotischen Spermaatien, die jede bestimmte Stufe Wirt ist, und der Verpackung dieser Zellen in Bündeln7,11. Die Spermadifferenzierung, d.h.Spermiogenese, ist weiter in 16 Entwicklungsschritte unterteilt, darunter 8 Schritte runder Sperma (Schritt 1-8) und 8 Schritte der lästigen Spermatiendifferenzierung (Schritte 9-16)(Abbildung 1). Schritt 9-11 langlängige Spermatoren (Stufe IX-XI) zeigen nur einen niedrigen Chromatinkondensationsgrad, was zu einer geringen Menge an Licht führt, die absorbiert wird. Die Chromatinkondensation beginnt in Schritt 11 Spermaatiden (Stufe XI), und Schritt 15-16 längliche Spermatien (Stufe IV-VIII) enthalten vollständig kondensiertes Chromatin und weisen daher eine maximale Lichtabsorption auf (Abbildung 3). Chromatin muss kondensiert werden, um fest in den Spermienkopf gepackt zu werden. Weitere Faktoren, die zum Lichtabsorptionsmuster beitragen, sind die Lage der länglichen Spermatoide innerhalb des Epithels (Basal vs. apikal) und die Bündelung von länden Spermaatiden (ausgesprochen in den Stadien II-V)11 (Abbildung 3). Bündel werden als Flecken in der Mitte der Tubuli und als Streifen an den Rändern unter einem Seziermikroskop und je kondensierter das Chromatin, desto dunkler der Fleck/Streifen11.
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulisegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen. Einmal isoliert, können inszenierte Tubulesegmente verschiedenen nachgelagerten Analysen unterzogen werden, einschließlich biochemischer RNA- und Proteinanalysen12,13,14,15, Durchflusszytometrie16, ex vivo Tubule-Kultur17 und Immunostaining18. Hier bieten wir auch detaillierte Nachflussprotokolle zur Vorbereitung von gequetschten Monolayern von inszenierten Tubulesegmenten für die morphologische Analyse von Lebenden Zellen und die anschließende Immunfärbung sowie für die ganzmontierte Immunfärbung von Tubulensegmenten. Der Workflow in Abbildung 4auf den Punkt gebracht.
Die transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht dank der synchronisierten zellulären Zusammensetzung der Stadien eine genaue Identifizierung und Isolierung von Keimzellen bei bestimmten Differenzierungsschritten. Wichtig ist, es ermöglicht auch die Untersuchung von stadium-abhängigen Ereignissen während der Spermatogenese auf lebendem Gewebe. Angesichts des Fehlens skalierbarer In-vitro-Modelle für die Spermatogenese hat diese Methode auch einen einzigartigen Vorteil, gezielte kurzfristige Entwicklungs- und toxikologische Studien an stufenspezifischen Tubulesegmenten ex vivo12,17zu ermöglichen. Während wir die Methode hier für die Maus beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf alle Säugetierarten mit Längs- und Segmentanordnung von seminiferen Epithelstadien angewendet werden, wie die Ratte4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenese ist ein einzigartiger Differenzierungsprozess, der letztlich zu einem der unterschiedlichsten Zelltypen des Körpers, dem Sperma, führt. Die Differenzierung von Keimzellen erfolgt in den zytoplasmatischen Taschen somatischer Sertolizellen, die gleichzeitig 4 bis 5 Generationen von Keimzellen beherbergen und ihre Entwicklung koordinieren und synchronisieren. Daher ist die Zusammensetzung der Keimzelltypen innerhalb eines Querschnitts konstant, und diese Zellassoziationen werden auch als Stadien (I–XII) des seminiferen Epithelzyklus bezeichnet. Wichtig ist, dass Stadien auch aus intakten seminiferen Tubuli identifiziert werden können, basierend auf ihren differenziellen Lichtabsorptions-/Streueigenschaften, die durch Transillumination aufgedeckt werden, und der Tatsache, dass die Stufen einander entlang des Tubuli in numerischer Reihenfolge folgen. Dieser Artikel beschreibt eine transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulensegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus der Maus darstellen. Das Lichtabsorptionsmuster seminiferöser Tubuli wird zunächst unter einem Seziermikroskop untersucht, und dann werden Tubulensegmente, die bestimmte Stufen darstellen, geschnitten und für nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschreiben wir Immunstainierungsprotokolle für stufenspezifische Squashpräparate und für intakte Tubulesegmente. Diese Methode ermöglicht es einem Forscher, sich auf biologische Ereignisse zu konzentrieren, die in bestimmten Phasen der Spermatogenese stattfinden, und bietet so ein einzigartiges Werkzeug für entwicklungstechnische, toxikologische und zytologische Studien der Spermatogenese und der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

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6.8K Aufrufe.  University of Turku, Turku, Finland. Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Serie: Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...