Diese Arbeit wurde von der HIT-CF-Programm der niederländischen CF-Stiftung (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103) unterstützt, der Wilhelmina Kinderkrankenhaus Research Fund und der Tschechischen Republik und Zilverenkruis / Achmea. Wir möchten S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, und G. Berkers (Abteilung für Pädiatrische Pneumologie, Wilhelmina Kinderkrankenhaus, UMC Utrecht) und RHJ Houwen (Abteilung für Pädiatrische Gastroenterologie, Wilhelmina zu danken Kinderkrankenhaus, UMC Utrecht) für die Patienten heranzugehen und die Biopsien für die Erzeugung eines CF Biobank zu bekommen.

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids.">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. , (2016).</li><li>Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiator+synergy+in+rectal+organoids+carrying+S1251N,+G551D,+or+F508del+CFTR+mutations.">Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations.</a> J Cyst Fibros. , (2016).</li><li>Dekkers, J. 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H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells.">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;2-adrenergic+receptor+agonists+activate+CFTR+in+organoids+and+subjects+with+cystic+fibrosis.">&#946;2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis.</a> Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).</li><li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+in+human+plasma.">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li><li>Graeber, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Current+Measurements+Detect+Activation+of+Mutant+CFTR+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+with+the+G551D+Mutation+Treated+with+Ivacaftor.">Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor.</a> Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).</li><li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivacaftor+potentiation+of+multiple+CFTR+channels+with+gating+mutations.">Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on patents for organoid culture and the Forskolin-induced swelling assay. Jeffrey M Beekman is an inventor on a patent for the Forskolin-induced swelling assay. Sylvia F Boj and Robert Vries are employed by the Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB), which holds the exclusive license to the Organoid Technology. Otherwise, the authors have nothing to disclose.

Hier bieten wir ein komplettes Protokoll für die Erzeugung, Expansion, Einfrieren und Auftauen von menschlichen kolorektalen Organoiden. Während wir uns vor 17 einige Zeit menschliche organoiden Kulturen etabliert haben, hat es sich manchmal als schwierig erwiesen , die Technologie in anderen Labors ohne zu etablieren praktische Ausbildung. Wir gehen davon aus, dass diese Protokolle eine solche Ausbildung ersetzen wird. Wnt-3A-konditioniertes Medium ist eines der wi...

CF wird durch Mutationen in der Mukoviszidose - Transmembran Regulator (CFTR) -Gen verursacht , die eine epitheliale Anionenkanals kodiert. CF betrifft etwa 85.000 Menschen weltweit 1. Über 2.000 CFTR - Mutationen wurden identifiziert ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Diese Vielfalt erklärt zum Teil , ein breites Spektrum an beobachteten Krankheitsphänotypen ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Sechs Klassen von CFTR-Mutationen definiert sind, auf der Grundlage ihrer Wirkung auf CFTR-Protein-Expression und Funktion: (I) keine Synthese, (II) beeinträchtigt Handel, (III) defekte Kanal-Gating, (IV) geändert Leitfähigkeit, (V) reduzierte Mengen von in der Regel CFTR funktioniert, und (VI) beeinträchtigt Zelloberflächenstabilität 4. Obwohl die gemeinsame CFTR-Mutationen gut untersucht sind, die CFTR-Funktion und die Beziehung mit dem klinischen Zustand bleiben poorly verstanden auf der Ebene des Individuums, vor allem für die große Gruppe der seltenen &quot;orphan&quot; Mutationen ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Kürzlich wurden Arzneimittel entwickelt, das CFTR-Protein in einem mutationsspezifischen Art und Weise auszurichten. Zwei Klassen von CFTR-Protein-Targeting Medikamente befinden sich in der klinischen Anwendung und haben unterschiedliche Wirkungsweisen. Potenziatoren, wie VX-770, verbessern die Open-Wahrscheinlichkeit von apikal lokalisierten mutierten CFTR und direkt auf ihre Zugabe zu den Zellen 5 handeln. Korrektoren, wie VX-809, den Handel des endoplasmatischen Reticulum lokalisierten misfolded CFTR wieder herzustellen und erfordern Vorinkubation mit Zellen vor den Auswirkungen 6 beobachtet werden. Das CFTR potentiator, VX-770 wurde für Patienten mit der G551D - Mutation 7, 8, sowie für die acht anderen registriertenCFTR - Gating - Mutationen, einschließlich S1251N 9; gemeinsam werden diese Mutationen durch 5% aller CF Probanden getragen. Andere Studien haben gezeigt , dass VX-770, mit dem Korrektor VX-809 kombiniert, hat begrenzte noch mit erheblichen Auswirkungen auf die Lungenfunktion und führt zu einer Abnahme in Exazerbationsraten in Subjekten homozygot für die F508del von 45-50% der Patienten durch mutation 10, 11. Herkömmliche Studien arzneimittelreaktions Subjekten innerhalb der verbleibenden 50% der CF-Patienten sind kostspielig und zeitaufwendig und sind nicht durchführbar für Personen mit extrem selten CFTR-Genotypen zu identifizieren. Neuartige, kostengünstige, personalisierte Methoden sind entscheidend, um die wachsende Zahl von CFTR-Modulatoren Personen zuordenbar jede Art von CFTR Mutation trägt. unter Verwendung von mutierten CFTR-Gen-Transfektion in h Bisher hat die Studie die Aufnahme von Patientengruppen tragen bestimmte CFTR-Mutationen wurden durch Studien geführteterologous Zellsysteme, gefolgt von elektrophysiologischen Studien in Ussing - Kammern 5, 6, 12. Aufgrund eines Mangels an ausreichenden CF Tiermodellen, Arzneimittelwirksamkeitsstudien an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche differenzierten für die Arzneimittelentwicklung 13 bronchialen Epithelzellen abgeleitet von CF Lungen Explantat Materialien wurden 14 verwendet wird , 15. die begrenzte Verfügbarkeit von Lungen Explantation Gewebe und den invasiven Verfahren jedoch zu bronchiale Zellen von Probanden ohne Endstadium der Erkrankung behindern die Analyse seltener CFTR-Mutationen erhalten und Drogentests in einem personalisierten Mode verhindern. Um diese Einschränkungen zu, &quot;easy access&quot; Gewebe, wie kolorektalen Organoiden, nasale Atemwegszellen und Atemwegszellen stammen aus induzierten pluripotenten Stammzellen zu überwinden, werden derzeit für personalisierte medikamentöse Behandlungen erforscht. 16, 17. Für den menschlichen Kolon / Rektum beinhalten die Kulturbedingungen definierten Wachstumsfaktoren (Epithelial Growth Factor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) und Noggin), kombiniert mit kleinen Molekülen (Nicotinamid, A83-01, und SB202190) in einer Basalmembranmatrix. Unter diesen Bedingungen wachsen einzelne Stammzellen oder kleine Gewebefragmente aus in geschlossene, zystische, 3D-Strukturen durch hochpolarisierten Epithel mit seinem basalen Seite gebildet außen orientiert. Alle Zelltypen erscheinen typischerweise in ihren normalen Verhältnissen und Positionen. Organoide kann durch wöchentliche mechanische Zerstörung und Wieder plating über lange Zeiträume erweitert werden. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und kann gespeichert werden, so dass langfristige Expansion und Bio-Banking - 17. Sie sind zugänglichalle Standard - zellbiologische / genetische Manipulationen und Analysetechniken für 2D - Zelllinien 18 entwickelt. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die CFTR - Funktion kann leicht in kolorektalen Organoiden in einer Forskolin-induzierte Schwellung (FIS) -Test 19, 20 gemessen werden. Wenn ausgesetzt Forskolin (FSK) oder alternativ an Choleratoxin, Organoiden schnell ihre zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) Spiegel erhöhen, was wiederum in der Öffnung des CFTR - Kanals 19. Organoide von gesunden Individuen oder von Patienten mit CFTR - Mutationen mit Restfunktion zugeordnet ist , wird anschließend als Folge des Ionen- und Wassertransport zu den organoiden Lumen schwellen, die in vitro - Äquivalent von sekretorischen Diarrhoe. Die FIS Antwort von kolorektalen Organoiden wurde zuvor gezeigt, vollständig CFTR-abhängig zu sein, wie abgeleitet von Organoiden angegeben von CFTR-null-Personen einnd durch die Verwendung von spezifischen pharmakologischen Inhibitoren CFTR 19. Große fachspezifische Datensätze können innerhalb weniger Wochen nach der Einnahme eine Biopsie entnommen werden. Für die FIS - Assay im Detail hier beschrieben, Organoide gezüchtet werden aus rektale Biopsien , die in jedem Alter und nur mit begrenztem Unannehmlichkeit 21 erhalten werden kann. Organoide werden wöchentlich durch mechanische Störung in einzelne Krypten agierten, die leicht wieder verschließen und neue Organoide bilden. Für den FIS - Test läuft, ~ 30-80 dieser gestört wenig Organoide werden in jede Vertiefung einer 96-Well - Platte 19 plattiert. Am Tag des Assays werden die Organoide mit Calcein grün gefärbt, ein fluoreszierendes zellpermeablen Farbstoff, der es innerhalb von lebenden Zellen zurückgehalten wird, Echtzeit-Bildgebung zu erleichtern. Dann Fsk, die die intrazelluläre cAMP erhöht und aktiviert dadurch CFTR, wird hinzugefügt, um organoide Schwellung zu stimulieren. Potenziatoren, die auf apikal CFTR wirken, werden gleichzeitig zugegeben with der Forskolin, während Korrektoren, die CFTR Handel wiederherzustellen 24 h vor der Zugabe von Fsk zugegeben. Die organoiden Quellung wird durch eine automatisierte Bildanalyse quantifiziert, die in der Gesamtfläche aller fluoreszierender Objekte für jeden Zeitpunkt auf Forskolin zusätzlich die relative Zunahme berechnet. 3D organoiden Schwellung Vor- und Nachteile gegenüber bestehenden elektro CFTR Ablesungen in 2D in Ussing-Kammern kultiviert Atemwegszellen liefert. Ein Hauptvorteil ist der Durchsatz des Quelltest. Die Zellen werden kultiviert und untersucht eine einzige Art von Kulturmedium verwenden, und ein erfahrener Techniker kann die Kultur bis zu 25 organoiden Proben auf einer wöchentlichen Basis, während rund 1.200 Datenpunkte pro Woche in 12 Patientenproben zu quantifizieren. Wir geben üblicherweise einen einzigen experimentellen Bedingungen durch doppelte oder dreifachen Messungen pro Platte und wiederholen Sie solche Messungen bei drei unabhängigen Inkubationszeit Punkte. Insgesamt etwa 300 bis 500 single organoide Strukturen werden dann pro experimentellen Bedingungen gemessen, die mit begrenzten technischen Variabilität sehr präzise Messungen der CFTR-Funktion führt. Diese Präzision ermöglicht es uns, deutliche Unterschiede definieren in Restfunktion und die Reaktion auf CFTR - Modulatoren und ermöglicht es uns leicht genetischen Hintergrund Effekte zwischen Patienten tragen identische CFTR - Mutationen 19, 22, 23, 24, 25 aufzunehmen. Die Datenqualität kann leicht von Mikroskopbildern beurteilt werden. Während FIS vollständig CFTR-abhängig ist, ist es ein indirektes Ergebnis Maßnahme für CFTR-Funktion, dessen Auslesung durch die Kopplung des Ionentransports zu den Fluidtransport verursacht. Dies steht im Gegensatz direkte CFTR - Funktion Messungen in Ussing - Kammern, die transepithelialen Ionenströme 26 messen. Ussing-Kammern ermöglichen die Auswahl Stimulation der apikalen oder basolateralen compartments (die die organoiden Test nicht erlaubt); von permeabilisierender basolateralen Membranen kann die apikal CFTR-abhängige Anion Sekretion selektiv 27 gemessen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Advanced Dulbecco&#8217;s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#12634</td>
			<td style="width:399px;">stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:355px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#35050</td>
			<td style="width:399px;">stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Hepes</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"># 15630-056</td>
			<td style="width:399px;">stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#15140-122</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:180px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">#655180</td>
			<td style="width:399px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:180px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">#662160</td>
			<td style="width:399px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">6 well culture plate</td>
			<td style="width:180px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">#657160</td>
			<td style="width:399px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies: Gibco</td>
			<td style="width:119px;">#14190-094</td>
			<td style="width:399px;">stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagles Medium&#160; (DMEM) 500ml&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#31966-021</td>
			<td style="width:399px;">For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:355px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:180px;">Bovogen</td>
			<td style="width:119px;">#SFBS LOT#11113</td>
			<td style="width:399px;">For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:355px;">L Wnt3A cell line</td>
			<td style="width:180px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">#CRL-2647</td>
			<td style="width:399px;">For Wnt-3A Conditioend Medium Production.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">TOP/FOP plasmids</td>
			<td style="width:180px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">#17-285</td>
			<td style="width:399px;">For measuring Wnt activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">pTK-Renilla</td>
			<td style="width:180px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:119px;">#E2241</td>
			<td style="width:399px;">For measuring Wnt activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">HEK-293</td>
			<td style="width:180px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">#CRL-1573</td>
			<td style="width:399px;">For measuring Wnt activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:180px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:119px;">#E1910</td>
			<td style="width:399px;">For measuring Wnt activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Zeocin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#R250-01</td>
			<td style="width:399px;">For Wnt-3A Cell line selection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific:&#160; Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#17504-044</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#A9165-5G</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#N0636</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Human Epithelial Growth Factor (hEGF)</td>
			<td style="width:180px;">PrepoTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-15</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:355px;">Gastrin</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#G9145</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">#2939</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)</td>
			<td style="width:180px;">Selleckchem</td>
			<td style="width:119px;">#S1049</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#S7067</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Primocin</td>
			<td style="width:180px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">#ant-pm-1</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Human Noggin (hNoggin)</td>
			<td style="width:180px;">PrepoTech</td>
			<td style="width:119px;">#120-10C</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Human R-spondin 3 (hRspo-3)</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#3500-RS/CF</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Vancomycin</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#861987- 250mg</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies: Gibco</td>
			<td style="width:119px;">#15710-049</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#431788</td>
			<td style="width:399px;">Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Matrigel</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#354230</td>
			<td style="width:399px;">stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">TryplE Express&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies: Gibco</td>
			<td style="width:119px;">#12605-010</td>
			<td style="width:399px;">for trypsinizing organoids for freezing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies: Gibco</td>
			<td style="width:119px;">#12648010</td>
			<td style="width:399px;">for freezing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcein</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies: Gibco</td>
			<td style="width:119px;">#C3100MP</td>
			<td style="width:399px;">stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Forskolin</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#1099-50 mg</td>
			<td style="width:399px;">stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lumacaftor (VX-809)</td>
			<td style="width:180px;">Selleckchem</td>
			<td style="width:119px;">#s1565</td>
			<td style="width:399px;">stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ivacaftor (VX-770)</td>
			<td style="width:180px;">Selleckchem</td>
			<td style="width:119px;">#s1144</td>
			<td style="width:399px;">stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Name of Reagents/Material</td>
			<td style="width:180px;">Solvent</td>
			<td style="width:119px;">Stock Concentration</td>
			<td style="width:399px;">Final Concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">200 mM</td>
			<td style="width:399px;">2m M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Hepes</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">1 M</td>
			<td style="width:399px;">10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">10K U/ml 10K &#181;g/ml</td>
			<td style="width:399px;">100 U/ml 100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Zeocin&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">100 mg/ml&#160;</td>
			<td style="width:399px;">125 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">100 x</td>
			<td style="width:399px;">1 x</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:180px;">MiliQ H20</td>
			<td style="width:119px;">500 mM</td>
			<td style="width:399px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:180px;">DPBS</td>
			<td style="width:119px;">1 M</td>
			<td style="width:399px;">10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Human Epithelial Growth Factor (hEGF)</td>
			<td style="width:180px;">DPBS 0.1%BSA</td>
			<td style="width:119px;">0.5 mg/ml</td>
			<td style="width:399px;">50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Gastrin</td>
			<td style="width:180px;">DPBS</td>
			<td style="width:119px;">100 &#181;M</td>
			<td style="width:399px;">10 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">5 mM</td>
			<td style="width:399px;">500 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">10 mM</td>
			<td style="width:399px;">10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">30 mM</td>
			<td style="width:399px;">10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Primocin</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">50 mg/ml&#160;</td>
			<td style="width:399px;">100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Human Noggin (hNoggin)</td>
			<td style="width:180px;">DPBS 0.1%BSA</td>
			<td style="width:119px;">100 &#181;g/ml</td>
			<td style="width:399px;">100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Human R-spondin 3 (hRspo-3)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">varies per lot</td>
			<td style="width:399px;">300 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Vancomycin</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:399px;">50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:399px;">50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:355px;">Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">MiliQ H20</td>
			<td style="width:119px;">0.5 M</td>
			<td style="width:399px;">2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Calcein</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">10 &#181;g/ml</td>
			<td style="width:399px;">3.3 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Forskolin</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">10 mM</td>
			<td style="width:399px;">variable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Lumacaftor (VX-809)</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">20 mM</td>
			<td style="width:399px;">variable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ivacaftor (VX-770)</td>
			<td style="width:180px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">20 mM</td>
			<td style="width:399px;">variable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

1A zeigt eine repräsentative frische Isolierung von Krypten auf BMM eingebettet. Die Krypten sind aus einem kolorektalen Biopsie einer CF Thema. Üblicherweise wird ein organoid aus jeder Krypta (1A - C) erzeugt. Aufgrund der Funktionsstörung der CFTR, sind die meisten der colon CF Organoide nicht cystic, sondern sind kompakt und mit Vorsprüngen und buddings (2A - 2B). Allerdings organoiden einige CF ...

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Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

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Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

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