Eine individualisierte Therapie für Mukoviszidose-Patienten kann durch ein In-vitro-Krankheitsmodell erreicht werden, um die CFTR-Aktivität zu Studienbeginn zu verstehen. Menschliche nasale Epithelorganoide oder HNE-Organoide produzieren Lumen unterschiedlicher Größe, die mit der CFTR-Aktivität korrelieren und zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden unterscheiden. Hier haben wir eine Methodik zur Kultivierung und Abbildung dieser HNE-Organoide im Detail beschrieben.
Ein dysfunktionaler epithelialer Ionentransport, insbesondere der von Chlorid und Bicarbonat, führt zu einem verringerten Volumen der epithelialen Auskleidungsflüssigkeiten. Dies betrifft auch die Schleimsekrete, die zu Mucostasis und Obstruktion führen. Daher wurde unser HNE-Modell für verschiedene Anwendungen entwickelt, abhängig vom experimentellen Design und den Ressourcen des Prüfers.
Neben der Beurteilung der CFTR-Aktivität zu Studienbeginn oder als Reaktion auf Therapeutika kann diese Technik auch auf andere Erkrankungen der Epithelzellfunktion, insbesondere des Flüssigkeitstransports von Epithelzellen, angewendet werden. Diese Methoden wurden in erster Linie für den Einsatz in Mukoviszidose-Studien entwickelt. Andere Studien, die die Atemwegsepithelien bewerten, wie die primäre ziliäre Dyskinesie, können diese Methoden ebenfalls hilfreich finden.
Diese Techniken erfordern Liebe zum Detail und Präzision. Sie erfordern auch eine sorgfältige Beobachtung, um sicherzustellen, dass die anfängliche Expansion der Zellen angemessen ist. Überwachen Sie jeden Tag alle Kulturen, und der Erfolg wird wahrscheinlicher.
Dissoziieren Sie zunächst die Nasenbürstenbiopsie in 8 Milliter RPMI-Medien in einem 15-Milliliter-Konusröhrchen, indem Sie die Zytologiebürste mehrmals durch eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit großer Bohrung führen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet dann wieder in drei Milliliter Zellablösungslösung.
16 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu verdauen. Verwenden Sie fünf Milliliter des Expansionsmediums, um die Zellen zweimal zu waschen. Dann fügen Sie sie zu einem T75-Kolben hinzu, der mit bestrahlten, inaktivierten und 50 bis 60% konfluierenden 3T3-Fibroblasten vorgesät ist.
Lassen Sie die Zellen 7 bis 14 Tage lang in den Expansionsmedien kokultivieren und expandieren. Wenn Antibiotika für Zellen von Patienten mit Mukoviszidose eingeführt wurden, sollten die Medien nach den ersten drei Tagen der Kultur durch antibiotikafreie Expansionsmedien ersetzt werden und können alle zwei Tage bis zu 80% Konfluent weiter wechseln. Waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS.
Dann fügen Sie 1,5 Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in den T75-Kolben hinzu und inkubieren Sie vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um den bestrahlten und inaktivierten 3T3-Fibroblasten aus der Kultur zu entfernen. Spülen Sie den T75-Kolben zweimal mit 1x DPBS ab, um die verbleibenden 3T3-Fibroblasten gründlich abzuwaschen. Geben Sie 1,5 Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in den T75-Kolben und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um HNEs zu lösen.
Neutralisieren Sie das Trypsin mit Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal gi für fünf Minuten. Verwerfen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit fünf Millilitern Expansionsmedien.
Die Zellen sind jetzt bereit für die Aussaat, um Organoide zu züchten. Tauen Sie die extrazelluläre Matrix der Organoidkultur oder ECM über Nacht bei vier Grad Celsius auf. Kühlen Sie die 15-Well-Angiogenese-Rutschen über Nacht bei gleicher Temperatur ab.
Als nächstes kühlen Sie die Pipettenspitzen auf vier Grad Celsius ab. Beschichten Sie die Objektträger mit fünf Mikrolitern kaltem 100% ECM auf Eis. Legen Sie sie für mindestens 30 Minuten zur Konsolidierung in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Zählen Sie die HNEs, die aus der Kokultur mit einem Hämozytometer gewonnen wurden. Verdünnen Sie dann die Zellen auf 500 Zellen pro Mikroliter in der Gesamtzahl, wobei 20% ECM durch Differenzierungsmedien auf Eis verdünnt werden. Nehmen Sie die ECM-beschichteten Objektträger aus dem Inkubator und säen Sie fünf Mikroliter der Kaltzellen-ECM-Mischung in jede der Vertiefungen.
Überführen Sie die Objektträger sofort für eine Stunde in einen Kulturinkubator bei 37 Grad Celsius, um die Zell-ECM-Mischung zu konsolidieren. Danach nehmen Sie die Objektträger aus dem Inkubator und führen die Zellen mit 50 Mikrolitern des Differenzierungsmediums in jede Vertiefung der 15-Well-Angiogenese-Objektträger ein. Bringen Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius in den Kulturinkubator zurück und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Organoide für weitere Experimente bereit sind.
Behandeln Sie die 8-Well-Glasboden-Kammerobjektträger 30 Minuten lang mit Zellkleber vor. Entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie die Brunnen für weitere 30 Minuten an der Luft. Als nächstes entsorgen Sie das Medium von der Oberseite des ECM und fügen Sie dann 50 Mikroliter des kalten 1x PBS in jede Vertiefung der 15-Well-Rutschen auf Eis hinzu.
Pipette drei- bis fünfmal mit 200 Mikrolitern der großvolumigen Pipettenspitze auf und ab. Verteilen Sie die Lösung auf die Mitte einer Vertiefung der 8-Well-Kammerobjektträger. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit sofort aus den Vertiefungen mit einer feinspitzen Pipette.
Legen Sie dann die Kammer für 40 Minuten in einen 37 Grad Celsius-Inkubator, um das Organoid, das am Glasboden haftet, zu verbessern. Nach 40 Minuten die Organoide zweimal vorsichtig mit 1x PBS waschen und mit 300 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd in jeder Vertiefung für 30 Minuten Raumtemperatur fixieren. Zweimal mit 1x PBS waschen und die Organoide in 1x PBS Set vier Grad Celsius zur Immunfärbung für bis zu zwei Wochen lagern.
Um die Organoide für histologische Studien zu ernten, entfernen Sie die Medien aus der Kultur und fügen Sie 50 Mikroliter kaltes 1x PBS in jede Vertiefung der Objektträger auf Eis hinzu. Pipette drei- bis fünfmal mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit großer Bohrung. Kombinieren Sie alle Lösungen aus dem 15-Well-Slide oder den Kultureinsätzen in einem 15-Milliliter-Konusrohr auf Eis.
Stellen Sie das Gesamtlösungsvolumen im Rohr auf 10 Milliliter ein, indem Sie kaltes 1x PBS hinzufügen. Zentrieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius, 300 mal g für fünf Minuten. Dann den Überstand absaugen und 60 Mikroliter warmes Histogel hinzufügen, um es mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit großer Bohrung mit dem Organoidpellet zu mischen.
Übertragen Sie die Suspension sofort in eine histologische Form. Nachdem Sie das Histogel bei Raumtemperatur konsolidiert haben, geben Sie den Formblock in 4% Paraformaldehyd zur Fixierung über Nacht bei vier Grad Celsius. Öffnen Sie die Software und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den unteren Bildschirmrand.
Wählen Sie dann Analysesteuerelemente und anschließend Automatisierte Messergebnisse aus. Öffnen Sie das Organoidbild und wählen Sie 5 bis 10 Organoide mit sichtbaren Lumen. Halten Sie den Rechtsklick auf das Bild gedrückt, um das Menü zu öffnen, und wählen Sie Polygonal ROI, um das vollständige Organoid zu skizzieren, um die Gesamtoberfläche des Organoids zu erhalten.
Umreißen Sie dann das Lumen, um den Lumenbereich zu erhalten. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Organoide im Bohrloch und alle Vertiefungen im Assay. Exportieren Sie schließlich die Daten nach Excel.
Teilen Sie die Lumenfläche durch die Gesamtoberfläche und berechnen Sie den Durchschnitt aller Organoide aus der Probe, um das Basis-Lumenverhältnis zu erhalten. Die Hellfeldbilder stellen HNEs aus einer erfolgreichen und erfolglosen Probensammlung dar. Die HNEs wachsen gut in einem großen Cluster.
Im Gegensatz dazu wachsen die HNEs schlecht in zwei kleinen Clustern, die die bestrahlten 3T3-Zellen umgeben. Organoide im 15-Well-Dia haben präzisere und schärfere Bilder als die im Kultureinsatz. Abgesehen davon wurde bei diesen beiden Kulturmethoden kein signifikanter morphologischer Unterschied beobachtet.
Nicht-CF-Organoide haben typischerweise ein größeres Lumen und mehr Flüssigkeit als CF-Organoide. Die HNE-Färbung in Organoiden von einem Nicht-CF, F508del/F508del-Subjekt, und die immunfluoreszierende Färbung von Zilien in einem Organoid sind in diesen Bildern dargestellt. Die mit Acetyliert-Tubulin gefärbten Zilien, der mit FITC markierte sekundäre Antikörper und die mit DAPI markierten Kerne sind hier dargestellt.
Hier werden maximale Projektionsbilder der beiden repräsentativen Organoide durch ganzmontierbare Immunfluoreszenzfärbung und die entsprechenden dreidimensionalen Rekonstruktionsbilder gezeigt. Schleim und Zilien innerhalb des Lumens der Organoide werden gezeigt. Die grafischen Bilder stellen den Forskolin-induzierten Schwellungsassay dar, um die CFTR-Funktion an den primären Nasenepithelzellen zu testen.
Ein repräsentatives Forskolin-Dosis-Wirkungs-Experiment von Nicht-CF-Freiwilligen ist hier gezeigt. Die FSK-Dosis-Wirkungs-Beziehung wird mit der durchschnittlichen Bruchteilsänderung nach einer Stunde im Vergleich zu acht Stunden verglichen, was darauf hindeutet, dass der Acht-Stunden-Assay einen signifikanteren Schwellungsunterschied zwischen verschiedenen FSK-Dosen erzeugen kann als bei einer Stunde. Der Bereich unter der Kurve kann einen geringfügigen Unterschied in der Schwellung im Vergleich zur durchschnittlichen Bruchänderung nach acht Stunden zeigen.
Beachten Sie beim Ausprobieren dieses Verfahrens, dass Organoide während des Sammlungs-, Fixierungs- und Färbeprozesses verloren gehen. Daher muss bei jedem Schritt sorgfältig vorgegangen und ausreichende Startnummern erzielt werden, um den Erfolg zu gewährleisten. Der Anbau von Organoiden in Kultureinlagen kann in dieser Hinsicht hilfreich sein, da diese Techniken entwickelt werden.
Hier haben wir kommerziell erhältliche Reagenzien und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die Expansion auf andere Ermittler zu erleichtern. Es wurde auch ein funktioneller Assay entwickelt, der gängige Mikroskoptechniken und speziellere Geräte verwendete.
