Wir möchten uns bei den Mitarbeitern des Veterinary Diagnostic Laboratory der Iowa State University, nämlich Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green und Jennifer Groeltz-Thrush, für die rechtzeitige Verarbeitung der Proben bedanken. Wir möchten uns auch bei Jodi Smith und Bethann Valentine für die Bereitstellung von Material für die Permeabilitätsexperimente bedanken. Wir möchten auch David Diaz-Reganon für seine Hilfe bei Abbildung 9 danken. Mit Ausnahme von Abbildung 6 wurden alle Zahlen im BioRender.com erstellt. Die Autoren möchten die Unterstützung des Faculty Startup, des ISU VPR Miller Award, des ISU VPR Miller Award und des NSF SBIR Subaward für ISU # 1912948 anerkennen.

K. Allenspach ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions. Sie ist als Beraterin für Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics und Mars tätig. J.P. Mochel ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions und als Berater für Ceva Animal Health und Ethos Animal Health tätig. Dieser Artikel spiegelt die Ansichten der Autoren wider und sollte nicht so ausgelegt werden, dass er die Billigung, Ansicht oder Politik der Food and Drug Administration darstellt. Andere Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Canine intestinale Organoidkulturen im permeablen Stützapparat sind ein einzigartiges Konzept, das traditionelle Wirkstoffpermeabilitätstests40 mit einem neuartigen In-vitro-Hundemodell 41 verbindet. Verschiedene Arten von intestinalen Organoiden bei Hunden können verwendet und basierend auf dem Ziel des Experiments mit minimalen Anpassungen bewertet werden. Es wird empfohlen, mehrere Konzentrationen des interessierenden Arzneimittels in 3-4 Vertiefungen pro Gruppe zu testen. Die Konzentrationen können auf der erwarteten Darmkonzentration des Arzneimittels basieren. Darüber hinaus kann die Verwendung früherer Forschungsergebnisse dazu beitragen, geeignete Zeitpunkte für das Studiendesign zu bestimmen. Eine angemessene Dokumentation des Studiendesigns sollte vorgenommen werden, um die Replizierbarkeit zu erhöhen und die Fehlerbehebung zu unterstützen.
Diese Technologie hat aufgrund der Neuheit der Methode42 mehrere Einschränkungen, hauptsächlich aufgrund der mangelnden Standardisierung bei der experimentellen Planung und Ausführung des Protokolls in allen Labors. Dieser Mangel an Standardisierung wurde von anderen Gruppen43 anerkannt, und die Canine 3D Organoid Monolayer Protocols werden zu einer Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien führen und die Standardisierung in dieses System einführen. Standardisierte Ansätze zur Datenanalyse verbessern die Replizierbarkeit und können die Ergebnisse vorläufiger Arzneimitteltests mit den Canine-Organoiden im permeablen Trägersystem in verschiedenen Labors verbessern. Dem 3D-Organoidmodell des Hundes fehlen auch Datensätze, die die In-vitro-P-App-Werte von Modellarzneimitteln mit ihrer bekannten in-vivo-Darmabsorption beim Menschen oder Hund vergleichen, ähnlich wie bei Caco-2-Zellen44,45,46. Sobald solche Daten generiert wurden, kann dieses Organoidmodell für Hunde verwendet werden, um die Darmpermeabilität während der Arzneimittelentwicklung zu bewerten.
Es ist wichtig, dass beim Aussäen der Organoide auf dem durchlässigen Unterstützungssystem darauf geachtet wird, eine ausreichend hohe Dichte an entsprechend dissoziierten Zellen zu säen. Die TEER-Werte des Systems sind zuverlässiger und reproduzierbarer, wenn sie in strengen Monolagen gezüchtet werden. Eine längere Kultur der Monoschichten kann zu einem exponentiellen Anstieg der TEER-Werte führen, der weiter von den physiologischen Werten des Darms entfernt ist. H & E-Abschnitte solcher 3D-Strukturen zeigen dann mehrere Zellschichten übereinander mit veränderten Strukturen von Enterozyten, die näher an der Membran liegen.
Nach erfolgreicher Expansion der intestinalen Organoid-Monoschicht des Hundes können die Ergebnisse auf die gleiche Weise wie herkömmliche 2D-Zellassays analysiert werden, indem der scheinbare Permeabilitätskoeffizient (PApp) eines Arzneimittels Formel44 berechnet wird. DerP-App-Wert (siehe Eq (2)) beschreibt die Transportrate über die zelluläre Monoschicht47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Die ist <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> die Anfangssteigung der Konzentration gegenüber der Zeitkurve (z. B. nmol/s). A ist die Fläche des Einsatzes (cm2) und C0 ist die Anfangskonzentration des Arzneimittels oder der Verbindung in der Spenderkammer37. Die zuverlässige Erkennung der Integrität der Monoschicht ist ein entscheidender Bestandteil des Permeabilitätsassays, der eine Standardisierung erfordert. Lichtmikroskopie und TEER-Messungen werden empfohlen, um Hundeorganoide in einem durchlässigen Stützsystem zu beurteilen und den richtigen Zeitpunkt des Experiments zu bestimmen. Zusätzlich können Null-Molekularpermeabilitätsmarker (z. B. FITC-Dextran, Lucifer Yellow, PEG-400) verwendet werden, um die Integrität der Organoid-Monoschicht funktionell zu bewerten. Es ist darauf zu achten, ob die getestete Verbindung von einem Transporter beeinflusst wird. P-Glykoprotein (P-gp) wird als häufiges Austrittspumpenbeispiel verwendet. Es muss ein Austrittsverhältnis erzeugt werden (Papp,BL-AP/P app,AP-BL) im Vergleich zu einem bekannten P-gp Sondensubstrat.
Die Lichtmikroskopie (glatt oder mit Phasenkontrast verstärkt) ist eine unschätzbare Methode, um die Integrität der 2D- oder 3D-Monoschicht und des Filtereinsatzes zu überprüfen und gleichzeitig ein mögliches zelluläres Überwachsen zu beurteilen. Abbildung 7 kann als Leitfaden für die Erkennung gesunder Organoid-Zellkulturen des Hundedarms dienen. TEER-Werte sind ein wichtiges Maß für die Bildung interzellulärer Verbindungen und die Differenzierung der Organoidkulturen zu einem intakten Darmepithel. Die intestinalen Organoide des Hundes differenzieren sich in Enterozyten und Becherzellen (Abbildung 6). Diese schleimproduzierenden Zellen ermöglichen die Untersuchung von Arzneimittel-Schleim-Interaktionen, was mit herkömmlichen 2D-Zellkulturen nur schwer zu erreichenwar 48. Das Vorhandensein enteroendokriner Zellen wurde zuvor in intestinalen Organoiden von Hunden durch Chandra et al.33 bestätigt.
Eine weitere Charakterisierung der kaninen Organoid-Monoschichten, die von jejunalen, ilealen und kolonalen Organoiden unter Verwendung von TEM abgeleitet sind, wird bereitgestellt. TEM-Bilder zeigen zelluläre Mikroarchitektur, einschließlich Tight Junctions und Mikrovilli-Bildung, was die Komplexität und Nützlichkeit dieser Organoidmodelle in der translationalen Medizin weiter veranschaulicht. Basierend auf den experimentellen Ergebnissen waren die Organoidkulturen auf dem permeablen Träger zwischen den Tagen 11 und Tag 13 nach der Aussaat experimentierbereit (Abbildung 9). Die TEER-Werte lagen zu diesem Zeitpunkt zwischen 1.500 und 2.500Ω,cm 2. Die Plateauphase der TEER-Werte dauert ein sehr begrenztes Zeitfenster, in dem das Experiment gestartet werden muss, bevor die TEER-Werte langsam sinken. TEER-Werte können auch ein entscheidender Bestandteil der Anzeige wichtiger experimenteller Ergebnisse sein, da einige Arzneimittel oder Hilfsstoffe für Arzneimittel mit der Monoschicht interagieren können (z. B. Engstellen), was sich stark auf die TEER-Wertauslesungen auswirken kann. Dies allein kann als Daten für ein Experiment dienen.
Canine Darmorganoide in einem Zweikammer-Zellkulturapparat können aufgrund der einzigartigen Architektur der resultierenden Zellmonoschicht in anderen Bereichen als der oralen Arzneimittelpermeabilität eingesetzt werden. Zum Beispiel können sie in der mikrobiologischen Forschung (z. B. die Auswirkungen der Veränderung der mikrobiellen Gi-Flora), viralen Aufnahmestudien, Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen und Arzneimitteltransportmechanismenverwendet werden 49. Die Spenderkammer ist typischerweise mit dem Testmedikament oder der Verbindung Ihrer Wahl gefüllt, und Aliquots aus der Empfängerkammer werden zu verschiedenen Zeitpunkten eingenommen. Diese Aliquots können mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie, enzymgebundenem Immunsorbensassay oder anderen Techniken analysiert werden, um die Menge und Geschwindigkeit zu bestimmen, mit der der gelöste Stoff die Monoschicht durchdringt.
Diese Studien erfordern eine intakte Monoschicht, um die Arzneimittelpermeabilität genau zu beurteilen. Dies erfordert in der Regel wachsende Monoschichten, die über die zur Berücksichtigung unbrauchbarer Bohrlöcher erforderlichen hinausgehen. Organoidzell-Monoschichten können auch verwendet werden, um die Virusaufnahme entweder von der apikalen oder basalen Seite einer Monoschicht aus zu messen, wobei Auslesungen einschließlich Immunfluoreszenz-Assays enthalten sind, bei denen Antikörper verwendet werden, um die zelluläre Aufnahme des Virus nachzuweisen. Schließlich können mehrere Medikamente (d. H. Substrat und Inhibitor) auf die Spenderkammer aufgetragen werden, um transporterbasierte Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen zu identifizieren.
Basierend auf den aktuellen Beobachtungen werden diese Methoden nicht nur auf Hundeorganoide in Kultureinlagen anwendbar sein, sondern auch für andere veterinärmedizinische Spezies und Organsysteme, wobei geringfügige Änderungen erforderlich sind, um der Spezies oder dem Organmodell der Wahl am besten zu entsprechen. Protokolle für das Organoidwachstum des Hundedarms mussten basierend auf den einzigartigen Eigenschaften der Kultur angepasst werden. So kann das Protokoll an eine andere Spezies angepasst werden, erfordert jedoch subtile Änderungen am Protokoll. Modifikationen können mit Änderungen der Zellaussaatdichte beginnen und sich auf Änderungen in der Medienzusammensetzung ausdehnen, um die interessierenden Organoide richtig zu differenzieren.
Die Standardisierung, die detaillierte Dokumentation der experimentellen Verfahren und die konsistente Überwachung der Zellmonoschichten sind entscheidende Praktiken, die für die durchlässigen Unterstützungsassays erforderlich sind und nicht auf das Hundesystem beschränkt sind. Diese möglichen Spezies- oder Organmodifikationen sind entscheidend für die Dokumentation und Berichterstattung für weitere Fortschritte auf diesem Gebiet. Dieses Modell hat mehrere Einschränkungen, z. B. seine Kostenanforderungen, die Variabilität zwischen den Ringen und begrenzte Daten über die Fähigkeit, die Darmabsorption in vivo vorherzusagen. Hunde besitzen in einigen Fällen andere Drogentransporter und metabolisierende Enzyme als Menschen50.
Darüber hinaus muss das Canine-Organoid-System an einer Vielzahl anderer Zweikammergeräte anderer Hersteller getestet werden, um die Eignung eines solchen Modells zu bestimmen (z. B. muss die Eignung verschiedener Filtermembranzusammensetzungen bestimmt werden). Ein weiterer Nachteil ist, dass der Teil des Drogenpermeabilitätsexperiments des Manuskripts weniger beschreibend ist als die vorherigen Teile. Dies wird durch einen Überschuss an Informationen in diesem Bereich verursacht. Das Ziel für diesen Teil des Manuskripts war es, diese Methoden auf modifizierbare Weise zu beschreiben, ohne die Eckpfeiler dieser Experimente zu schneiden. Detailliertere Informationen zu Permeabilitätsexperimenten wurden von Hubatsch et al.37 gesammelt. Darüber hinaus können durchlässige Einsätze in Kokultur-, Zellmigrations- und Invasionsassay-Experimentenverwendet werden 4.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intestinalen Organoide des Hundes in Zweikammerkulturapparaten das Potenzial haben, in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt zu werden, einschließlich biomedizinischer Bereiche und translationaler Medizin, um nur einige zu nennen. Die Protokolle schaffen mehrere Strategien, um ein Experiment zu planen und die Zuverlässigkeit von Ringdaten für Organoidmodelle im gesamten Bereich der Biologie zu fördern.

Permeable Unterstützungssysteme werden typischerweise verwendet, um die scheinbare Permeabilität von therapeutischen Wirkstoffkandidaten durch die Darmepithelbarriere 1,2 zu bestimmen. Sie können auch verwendet werden, um die Zellsekretion3, die Zellmigration4 und die Arzneimitteltoxizität5 zu beurteilen. In-vitro-Tests zur oralen Arzneimittelpermeabilität sind ein wichtiger Schritt im Arzneimittelentdeckungs- und -entwicklungsprozess2, wobei einzelne Arzneimittelkandidaten in einem frühen Stadium des Lebenszyklus der Arzneimittelforschung und -entwicklung getestetwerden 6. Das permeable Trägersystem ist ein Zweikammer-Zellkulturapparat, der aus einem Einsatz mit einer semiporösen Membran besteht, die in einer Mehrkammerplatte platziert ist. Dieses System ermöglicht den direkten Zugriff auf die apikalen und basolateralen Seiten einer Zell-Monoschicht, die im Insert7 gewachsen ist. Die in diesen Systemen verwendete Monoschicht wird typischerweise von gastrointestinalen Epithelzellen abgeleitet (z. B. humane kolorektale Adenokarzinom-Caco-2-Zelllinie)8. Zellkulturen wachsen in einem polarisierten Zustand, der die natürliche Mikroarchitektur von Darmepithelzellen nachahmt und eine weitere zelluläre Differenzierung, ähnliche Mikroanatomie und Funktionermöglicht 7. Details zum durchlässigen Stützeinsatz finden Sie in Abbildung 1. Die Aussaat der Einsätze mit 2D-Zellkulturen, die traditionell zur Beurteilung der Darmpermeabilität verwendet werden, ist relativ erschwinglich und leicht zu kultivieren9. Diese Systeme weisen mehrere große Einschränkungen auf, einschließlich ihrer begrenzten Fähigkeit, den Darmstoffwechsel von therapeutischen Arzneimittelkandidaten vorherzusagen10,11. Dies gilt für alle Mechanismen der Arzneimittelabsorption, sei es die passive Absorption durch die engen Verbindungen zwischen den Epithelzellen, die aktive transepitheliale Absorption durch Efflux oder Aufnahmetransporter (z. B. P-Glykoprotein, Monocarboxylat-Transporter 1) und Medikamente, die durch Enterozyten metabolisiert werden.
Hunde teilen eine gemeinsame Umgebung und Ernährung mit Menschen12. Die Darmanatomie und die Zusammensetzung des Mikrobioms von Hunden ähneln stark der des Menschen13, was der Domestizierung und der gemeinsamen Ernährung in den letzten 36.000 Jahren zugeschriebenwurde 14. Leider können diese Ähnlichkeiten auch häufige Ursachen/Auslöser für die Krankheitsentwicklung sein. Hunde entwickeln ähnliche chronische Morbiditäten wie Menschen, wie Fettleibigkeit15, entzündliche Darmerkrankung 16, kolorektales Adenokarzinom 17, gastrointestinaler Stromatumor (GIST)18 und verschiedene andere Pathologien, die mit ihrer relativen Langlebigkeitverbunden sind 19. Dementsprechend können canine Organoide im Sinne der One Health Initiative20 erfolgreich für die reverse translationale Erforschung dieser chronischen multifaktoriellen Erkrankungen eingesetzt werden.
Caco-2-Zellen sind die am häufigsten verwendeten Zelllinien für orale Absorptionsassays21. Diese Zellen gelten derzeit als das "Goldstandard"-Modell für In-vitro-Intestinalpermeabilitätsassays 2,22,23. Die Caco-2-Zelllinie exprimiert Efflux- und Aufnahmetransporter, die im menschlichen Darmtrakt vorkommen, wenn auch auf unterschiedlichen Expressionsniveaus24,25,26. Caco-2-Zellen werden auch häufig als Modelle verwendet, um festzustellen, ob ein Medikament ein Substrat oder ein Inhibitor von Darmeffluxtransportern ist22,27. Obwohl die Caco-2-Zellen kolonialen Ursprungs sind, ahmen sie eine Enterozytenzelle nach. Leider repräsentieren Caco-2-Zellen nur einen Zelltyp aus der Epithelschicht des Dünndarms9, der die komplexe Zusammensetzung des Darmepithelzelltyps nicht genau rekapituliert. Zum Beispiel fehlen Becherzellen, die der Schleimproduktion gewidmet sind, in Caco-2-Kulturen, so dass Schleim-Arzneimittel-Wechselwirkungen ohne Kokultur mit anderen Zelllinien nicht beurteilt werdenkönnen 28. Darüber hinaus exprimieren Caco-2-Kulturen nicht mehrere der wichtigen Kernrezeptoren, die typischerweise im Darm vorhanden sind, wie der X-Rezeptor der Schwangerschaft (PXR), der Steroid-X-Rezeptor (SXR) und der konstitutive Androstrezeptor (CAR)29. Folglich können Caco-2-Kulturen die Induktion von Wirkstofftransportern und -enzymen durch bestimmte Medikamente, die Induktoren dieser Rezeptoren sind (z. B. Rifampin), nicht modellieren30.
Die 3D-Darmorganoid-Technologie adressiert einige dieser Einschränkungen19. Organoide sind selbstzusammengesetzte Konstrukte, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden und aus Gewebeproben gewonnen werden können, die mit mikroinvasiven Techniken entnommen wurden20. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen werden für Darmpermeabilitätsmodelleverwendet 31,32. Canine Organoide bieten eine relevante Alternative zu menschlichen Organoiden, da die Forschung an menschlichen Stammzellen durch ethische Fragen eingeschränktist 33. Darüber hinaus bieten Hundeorganoide ein In-vitro-System zur Erforschung der Arzneimittelpermeabilität von Hunden, des Stoffwechsels, des aktiven Transports und der Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Arzneimitteln. Um diese Technologielücke zu schließen, wurde das konsistente und zuverlässige Wachstum von Darmorganoiden bei Hunden in einem durchlässigen Stützsystem beschrieben34. Ein Permeabilitätsassay mit intestinalen Organoiden bei Hunden kann möglicherweise die Darmpermeabilität des Hundes und den Metabolismus kleiner Wirkstoffmoleküle im Vergleich zu derzeit verwendeten Assays (Caco-2) vorhersagen. Die Bestätigung dieser entscheidenden Merkmale verleiht diesem neuartigen In-vitro-System zukünftige Arbeiten, die den möglichen Einfluss von Induktoren auf den intrazellulären Stoffwechsel und den aktiven Transport untersuchen.
Canine Organoide bestehen aus allen Zelltypen, die typischerweise in der Epithelschicht des Darms vorhanden sind. Aus funktioneller und mikroanatomischer Sicht bilden sie zuverlässig die Umgebung der Epithelschicht des Hundedarmsnach 19,35. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Schleim, hundespezifischen Wirkstofftransportern und -enzymen sowie die zelluläre Gesamtdifferenzierung in Darmorganoiden von Hunden vergleichbar mit dem, was in vivo bei Hundenbeobachtet wird 34. So können Organoide von erkrankten tierärztlichen Patienten isoliert und verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Krankheitsprozesse (z. B. chronische Darmentzündung) auf die orale Arzneimittelpermeabilität von Hunden zu modellieren19,36. Das intestinale Organoidsystem des Hundes kann auch in anderen Umgebungen als Medikamentenpermeabilitätsexperimenten verwendet werden. Diese 3D-Strukturen können auch von erkrankten Patienten isoliert werden, wie zuvor von Chandra et al. für entzündliche Darmerkrankungen, kolorektale Adenokarzinome und gastrointestinale Stromatumoren19 beschrieben.
Das Permeable Support Seeding Protocol beschreibt Verfahren zur Etablierung von intestinalen Organoidkulturen bei Hunden in den Einsätzen. Dieses erste Protokoll beschreibt Methoden zur Dissoziierung etablierter Organoidkulturen bei Hunden, die in der extrazellulären Membranmatrix plattiert sind. Weiterhin wird in diesem Protokoll die Vorbeschichtung der Einsätze mit Kollagen I und der extrazellulären Membranmatrix diskutiert. Die Einbettung von Hundeorganoiden in die durchlässigen Stützeinsätze wird ebenfalls ausführlich beschrieben.
Das zweite Protokoll ist das Monolayer Maintenance Protocol, das die allgemeine Wartung von 3D-Organoiden bei Hunden umfasst, die in einem Einsatz plattiert sind. Die Häufigkeit und das Volumen der Organoidmedien, die zur Auffrischung der Kultur verwendet werden, und Möglichkeiten zur Verhinderung von Zellkulturschäden werden in diesem zweiten Protokoll zusammen mit experimentellen Methoden zur Beurteilung des Zusammenflusses der epithelialen Monoschicht vorgestellt.
Schließlich konzentriert sich das Permeability Experimental Protocol auf Möglichkeiten, um festzustellen, ob die 3D-Organoide des Hundedarms in einem Permeabilitätsassay für den experimentellen Einsatz bereit sind, und auf die Verifizierungsschritte, die vor der Durchführung eines Experiments erforderlich sind. Dieser Abschnitt beschreibt auch den Aufbau und die erfolgreiche Durchführung eines Permeabilitätsexperiments sowie die Inkubation und Probenahme von therapeutischen Wirkstoffkandidaten in den Kammern der Monolayer-Kultur. Die Verwendung des Fluoresceinisothiocyanats mit geringer Permeabilität (FITC-Dextran) zur Überwachung der Integrität der Monoschicht wird ebenfalls diskutiert. Abschließend wird eine in vitro Evaluationsmethode zur Validierung der Ergebnisse nach Abschluss eines Experiments beschrieben. Permeabilitätsexperimente sind ein äußerst umfangreiches Thema und werden von Hubatsch et al.37 sehr gut zusammengefasst. Der Workflow der Protokolle ist in Abbildung 2 zusammengefasst.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Abbildung 1: Darmorganoide bei Hunden auf einem durchlässigen Stützsystem. Der durchlässige Stützeinsatz befindet sich in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die mikroporöse Membran ermöglicht die Aussaat von dissoziierten Darmorganoiden bei Hunden, und diese Zellen bilden schließlich eine organoide 2D-Monoschicht. Diese Technologie ermöglicht den Zugriff sowohl auf die AP- als auch auf die BL-Seite der Monolayer. Organoides Medium wird sowohl in den AP- als auch in den BL-Kammern des durchlässigen Trägers eingeführt. Die Absorption (AP→BL) und Sekretion (BL→AP) des Wirkstoffkandidaten werden ebenso dargestellt wie zwei mögliche Arten des Arzneimitteltransports. Abkürzungen: AP = apikal; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Abbildung 2: Workflow der organoiddurchlässigen Unterstützungsprotokolle für Hunde . Der durchlässige Stützeinsatz wird mit einer Mischung aus extrazellulärer Membranmatrix und Kollagen I vorbeschichtet und für 1 h inkubiert. Während des Inkubationsprozesses wird die Organoidkultur dissoziiert. Einzelne Organoidzellen werden im Insert ausgesät, Medium in der Basolateralkammer wird unmittelbar nach der Aussaat zugegeben, während Medium in die apikale Kammer 24 h nach Abschluss des Aussaatprozesses gegeben wird. Die Wartung und Überwachung der Organoide umfasst regelmäßige Mediumswechsel, TER-Wertmessungen und Lichtmikroskopie zur Bewertung der Integrität der Monoschicht. Vor dem Experiment müssen die Organoide unterschieden werden, indem ROCK-Inhibitor und GSKiβ aus dem Medium entfernt werden. Die TEER-Werte werden am Tag des Experiments gemessen und die Organoid-Monoschicht lichtmikroskopisch auf Schäden an den Zellen untersucht. Das Medium wird dann gegen einen geeigneten Puffer ausgetauscht und vor dem Experiment inkubiert. Der FITC-Dextran-Assay wird während der Darmpermeabilitätsexperimente39 als Marker für die Integrität der Monoschicht verwendet. TEER-Messungen werden nach dem Experiment durchgeführt, und die Lichtmikroskopie validiert die Ergebnisse nach 24 Stunden. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; F = Fluoreszenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

Das permeable Trägersystem wird typischerweise in Verbindung mit traditionellen zweidimensionalen (2D) Zelllinien als In-vitro-Werkzeug zur Bewertung der oralen Permeabilität neuer therapeutischer Wirkstoffkandidaten verwendet. Die Verwendung dieser konventionellen Zelllinien hat jedoch Einschränkungen, wie die veränderte Expression von Tight Junctions, die partielle Zelldifferenzierung und das Fehlen wichtiger Kernrezeptoren. Trotz dieser Mängel sind die Caco-2- und MDCK-Modelle weithin akzeptiert und für die Vorhersage der oralen Permeabilität des Menschen in vivo validiert.
Hunde sind aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der gastrointestinalen Anatomie und der Darmflora mit dem Menschen ein relevantes translationales Modell für die biomedizinische Forschung. Dementsprechend und zur Unterstützung der parallelen Arzneimittelentwicklung ist die Ausarbeitung eines effizienten und genauen In-vitro-Tools zur Vorhersage von In-vivo-Arzneimittelpermeabilitätseigenschaften sowohl bei Hunden als auch bei Menschen sehr wünschenswert. Ein solches Werkzeug könnte das intestinale Organoidsystem des Hundes sein, das durch dreidimensionale (3D), selbstorganisierte Epithelstrukturen gekennzeichnet ist, die aus adulten Stammzellen stammen.
Das (1) Permeable Support Seeding Protocol beschreibt die experimentellen Methoden zur Dissoziation und Aussaat von Hundeorganoiden in den Einsätzen. Die Isolierung, Kultur und Ernte von Organoiden bei Hunden wurde zuvor in einer separaten Reihe von Protokollen in dieser Sonderausgabe beschrieben. Methoden zur allgemeinen Erhaltung der intestinalen Organoid-Monoschicht des Hundes werden im (2) Monolayer Maintenance Protocol ausführlich diskutiert. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll Methoden zur Beurteilung der strukturellen Integrität der Monoschicht durch transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) und Lichtmikroskopie. Schließlich beschreibt das (3) Permeability Experimental Protocol die Aufgaben, die einem Experiment direkt vorausgehen, einschließlich der In-vitro-Validierung der experimentellen Ergebnisse.
Insgesamt überwindet das Organoidmodell für Hunde, kombiniert mit einer Zweikammer-Zellkulturtechnologie, die mit experimentellen 2D-Modellen verbundenen Einschränkungen und verbessert dadurch die Zuverlässigkeit der Vorhersagen der scheinbaren oralen Permeabilität therapeutischer Arzneimittelkandidaten sowohl beim Hund als auch beim menschlichen Patienten.

Standardarbeitsanweisungen für die Kultur von Canine-Organoiden wurdenzuvor 33 beschrieben, und das Canine Organoid Protocol wurde auch in dieser Sonderausgabe38 ausführlich diskutiert. Hundeintestinale Organoide, die auf durchlässigen Stützen kultiviert wurden, wurden fixiert und in Paraffin eingebettet, um die Mikroanatomie der Monoschicht und der Zellpopulationen zu untersuchen. Der Paraffin-Einbettungsprozess wurde zuvor von Gabriel et al.38 diskutiert. Es wurde eine routinemäßige Färbung (Hämatoxylin und Eosin) durchgeführt, und die Alcian Blue-Färbetechnik wurde verwendet, um Becherzellen in der organischen Monoschicht des Hundes nachzuweisen (siehe Abbildung 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Abbildung 7: Einschichtige Organoid-Monolayer-Färbung des Darms bei Hunden. Hundeintestinale Organoide kolonialen Ursprungs in der durchlässigen Stütze wurden in Paraffin eingebettet und mit H & E und AB gefärbt. Repräsentative Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie bei 40-facher (A) und 60-facher (B) Vergrößerung aufgenommen. Die H & E-Färbung zeigt eine säulenförmige Epithel-Monoschicht, und die Mikrovilli im apikalen Teil der Zellen können bei 60-facher Vergrößerung beobachtet werden. Die AB-Färbung enthüllt das Vorhandensein von Kelchzellen (dunkelblau) in der Organoid-Monoschicht des Hundedarms. Maßstabsstäbe = 20 μm (A), 50 μm (B). Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; AB = Alcian Blau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Organoidkultur auf dem permeablen Träger sollte für 10 bis 14 Tage gezüchtet werden, um für ein Permeabilitätsexperiment bereit zu sein. Die Lichtmikroskopie wird in Verbindung mit TER-Wertmessungen eingesetzt, um die Bereitschaft der Organoidkultur für Permeabilitätstests von Wirkstoffkandidaten zu bestätigen. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen verschiedener intestinaler Organoid-Monoschichten von gesunden und kranken Tieren sind in Abbildung 8 dargestellt.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Abbildung 8: Canine intestinal organoid monolayer microscopy. Bilder von wachsenden Monolayern, wie sie unter Lichtmikroskopie zu sehen sind. Organoid-Monoschichten, die von gesunden Spendern stammen, werden durch jejunale enteroide (10x; 40x) und colonoide (20x; 40x) Kulturen dargestellt. Organoide Monoschichten erkrankter Spender werden durch zwölffingerdarmige (5x; 10x) und ileale (5x; 10x) Enteroide dargestellt, die von einem Hundepatienten stammen, bei dem PLE diagnostiziert wurde. Beide PLE-Organoidkulturen sind Beispiele für eine unsachgemäße Zellisolierung während der Aussaat von Organoiden, und diese Kulturen konnten aufgrund des Vorhandenseins von 3D-Organoiden nicht für Wirkstoffpermeabilitätstests verwendet werden. Beispiele für Abweichungen von der richtigen Monolayer-Bildung, wie z.B. Monolayer-Risse (5x), werden durch unvorsichtige Manipulation der biologischen Proben verursacht. Die verlängerte Kultur von Organoiden (10x; 20x) wird durch die lange Aufrechterhaltung der Organoide auf dem Einsatz verursacht, wenn die Organoide beginnen, ihrer ursprünglichen 3D-Struktur zu ähneln. Zum Vergleich werden Bilder von traditionellen 2D-Zelllinien auf den permeablen Trägern gezeigt, die üblicherweise für Arzneimittelpermeabilitätsstudien verwendet werden (MDCK-10x; 40x und Caco-2-10x; 20x). Abkürzungen: PLE = proteinverlierende Enteropathie; MDCK = Madin-Darby-Hundeniere. Maßstäbe = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Organoid-Monoschichten wurden auch in 3% Paraformaldehyd-3% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Ultrastruktur der Organoidkultur auf den durchlässigen Trägern zu charakterisieren. Mikroanatomische Strukturen von Mikrovilli und Tight Junctions sind in Abbildung 9 zu sehen.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Abbildung 9: TEM-Bilder von gesunden intestinalen Organoid-Monoschichten bei Hunden. TEM wurde verwendet, um die zelluläre Mikroarchitektur von jejunalen (A), ilealen (B) und kolonen (C) organoiden Monoschichten aufzudecken. Die mikroporöse Membran des durchlässigen Stützeinsatzes ist mit einem gelben Pfeil gekennzeichnet. Das Vorhandensein von Mikrovilli (blauer Pfeil) und Tight Junctions (roter Pfeil) ist in den Bildern dargestellt. Abkürzung: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Maßstabsstäbe = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Sowohl TER-Messungen als auch Lichtmikroskopie sollten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das System für Permeabilitätstests bereit ist. Der Assay ist einsatzbereit, wenn TEER einen stationären Zustand erreicht, während die Lichtmikroskopie dazu beiträgt, Schäden oder Überwucherungen der Organoide auszuschließen. Eine Zusammenfassung typischer TEER-Messungen von fünf Gruppen, bestehend aus kaninen jejunalen Enteroiden und Kolonoiden, ist in Abbildung 6 dargestellt.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Organoidmedien und FAA. Die vollständige Zusammensetzung von CMGF+, CMGF+ R/G und FAA ist in dieser Tabelle zusammengefasst. Abkürzungen: ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ; FAA = Formalin-Essigsäure-Alkohol; EGF = epidermaler Wachstumsfaktor. Diese Tabelle ist von 38 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Tabelle für die Notizen zum Organoid von Hunden, dem durchlässigen Unterstützungssystem. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Kultur der Darmorganoide von Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Stützsystem beschreibt. Die organoide Aussaat in den durchlässigen Trägern, die Monolayer-Wartung und nachfolgende Wirkstoffpermeabilitätsexperimente werden beschrieben.

Darmorganoide für Hunde in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K Aufrufe.  Iowa State University. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Kultur der Darmorganoide von Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Stützsystem beschreibt. Die organoide Aussaat in den durchlässigen Trägern, die Monolayer-Wartung und nachfolgende Wirkstoffpermeabilitätsexperimente werden beschrieben.

Serie: Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Entwicklung eines Negativ Selektionsmarker für Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

Verwendung von humaninduzierten, zellabgeleiteten Intestarz-Organoiden zur Untersuchung und Modifizierung des epithelialen Zellschutzes gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...