Dieses Protokoll zeigt, wie Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chip-Technologie verwendet werden können, um einen physiologisch relevanten Darmchip zu erzeugen, der dann zur Vorhersage von Pharmakokinetik und Arzneimittelwechselwirkung und zur Untersuchung der intestinalen Epithelbarrieredysfunktion verwendet werden kann. Die Vereinigung von Organoiden in der Organ-on-a-Chip-Technologie ermöglicht es uns, die Komplexität des Darmepithels zu reproduzieren. Darüber hinaus ermöglicht es eine bessere experimentelle Kontrolle der mechanischen Hinweise, der Strömungsverteilung und der biochemischen Gradienten.
Diese Methode emuliert die komplexe Physiologie des menschlichen Darms und ermöglicht ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Grundlagen normaler und pathologischer Darmfunktionen. Dies hilft, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie potenzielle Arzneimittelkandidaten besser vorherzusagen, um entzündliche Schäden zu verhindern. Seeding ist ein kritischer Schritt im Protokoll.
Eine übermäßige Fragmentierung oder ungenaue Aussaatdichte der intestinalen Organoidfragmente kann die Entwicklung und Differenzierung der Epithelbarriere beeinträchtigen. Um zu beginnen, saugen Sie das Medium aus der statischen Organoidkultur ab. Gewinnen Sie Medien aus genügend Vertiefungen zurück, um eine endgültige Seeding-Dichte von acht Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Fügen Sie 500 Mikroliter eiskalte BMM-Dissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu und befestigen Sie das gelöste BMM von der Bohrlochoberfläche. Sammeln Sie die Suspension in ein 15 Milliliter proteinarmes Binderöhrchen und legen Sie es auf Eis. Schütteln Sie die Tube vorsichtig alle 15 Minuten für eine Stunde.
Zentrifugieren Sie bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um ein organoides Pellet zu erhalten. Wenn eine transparente Gelschicht über dem Pellet beobachtet wird, saugen Sie die Lösung aus dem Röhrchen ab. Resuspendieren Sie das Pellet und fügen Sie eine gleiche Menge BMM-Dissoziationslösung hinzu.
Auf Eis 10 Minuten inkubieren und zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine gelösten BMM-Rückstände mehr vorhanden sind. Dann den Überstand verwerfen und das Pellet in zwei Milliliter Organoid-Aufschlusslösung resuspendieren.
Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Minuten und fügen Sie acht Milliliter fortgeschrittenes DMEM F12 hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem organoidem Wachstumsmedium, um acht Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Aliquot 360 Mikroliter in sterilen 1,5 Milliliter proteinarmen Binderöhrchen.
Als nächstes entfernen Sie das Medium aus dem oberen Kanal der beschichteten Chips und fügen 30 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie die Chips über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Organoidfragmente an der Membran zu haften. Fügen Sie drei Milliliter voräquilibriertes vollständiges organoides Wachstumsmedium in das obere Einlassreservoir und drei Milliliter voräquilibriertes Endothelzellwachstumsmedium in das untere Einlassreservoir hinzu.
Geben Sie 300 Mikroliter des gleichen Mediums in die jeweiligen oberen und unteren Auslassbehälter. Bringen Sie das Fach mit den tragbaren Modulen in das Kulturmodul. Führen Sie auf dem Kulturmodul wiederholt den Prime-Zyklus durch, bis sich genügend Tröpfchen für eine erfolgreiche Verbindung der Chips bilden.
Schieben Sie dann den Chipträger in das tragbare Modul. Starten Sie dann den zweistündigen Regelzyklus, um die Kulturmedien im tragbaren Modul und Chip unter Druck zu setzen, wonach die programmierten Bedingungen wieder aufgenommen werden. Ändern Sie als Nächstes die Stretch-Einstellungen und starten Sie das Kulturmodul.
Nach 24 Stunden wiederholen Sie den Zyklus mit 10% Dehnung und der gleichen Frequenz. Zur Herstellung von Dosiermedien oder Vehikelkontrollen werden die CYP-Induktor-Stammlösungen oder DMSO in vollständigem Organoid-Wachstumsmedium und Endothelzellwachstumsmedium verdünnt. Pausieren Sie das Kulturmodul und bringen Sie die Schalen zur Biosicherheitswerkbank.
Ersetzen Sie die Medien in allen Ein- und Auslassbehältern durch zwei Milliliter Dosiermedien mit Induktoren oder Fahrzeugsteuerung. Bringen Sie die tragbaren Module zurück zum Kulturmodul und starten Sie den Durchfluss mit 30 Mikrolitern pro Stunde neu. Ersetzen Sie das Medium alle 24 Stunden durch eine frisch zubereitete Induzierlösung und setzen Sie die Kultur für 48 bis 72 Stunden fort.
Bringen Sie dann die Schalen zur Biosicherheitswerkbank und saugen Sie das Dosiermedium aus allen Behältern ab. Waschen und ersetzen Sie das obere Einlassreservoir durch warmes, fortschrittliches DMEM F12-Medium und das untere Reservoir durch ein Endothelzellwachstumsmedium. Ersetzen Sie das Waschmedium durch einen Milliliter Sondensubstratlösung.
Perfundiert die Chips fünf Minuten lang mit einer hohen Durchflussrate von 1.000 Mikrolitern pro Stunde und saugen Sie sowohl die oberen als auch die unteren Auslassbehälter ab. Die Chips werden in das Kulturmodul zurückgeführt und eine Stunde lang unter einem konstanten Fluss von 300 Mikrolitern pro Stunde inkubiert. Stoppen Sie nach einer Stunde Behandlung den Fluss und bringen Sie die Schalen zum Biosicherheitswerkbänke.
Sammeln Sie 100 Mikroliter Abwasser aus dem oberen Auslassbehälter und geben Sie es in ein Röhrchen mit 200 Mikrolitern Stopplösung. Stellen Sie die Röhrchen sofort auf Trockeneis und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie beide Kanäle mit 200 Mikrolitern sterilem DPBS.
Blockieren Sie dann den unteren Kanalauslass mit einer 200 Mikroliter Filterpipettenspitze. 50 Mikroliter der Dissoziationslösung durch den Bodenkanal perfundiert und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sorgen Sie für eine vollständige Ablösung der Endothelzellen und entfernen Sie die Dissoziationslösung durch Pipettieren aus dem Kanal.
Wiederholen Sie die Wäsche. Als nächstes blockieren Sie den oberen Kanalauslass und perfusionieren 75 Mikroliter Proteinlysepuffer. Lassen Sie die Pipettenspitze eingesetzt und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Sammeln Sie die Zelllysate in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie fünf- bis 10-mal pipettieren. Wiederholen Sie die Perfusion und Entnahme, um eine vollständige Ablösung der Zellen zu erhalten, und lagern Sie die Lysate bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Für die RNA-Lyse folgen Sie dem gleichen Verfahren, während Sie 150 Mikroliter RNA-Lysepuffer verwenden.
Zuerst wird eine Interferon-Gamma-Dosierlösung hergestellt, indem die Stammlösungen in entgastem Endothelzellwachstumsmedium verdünnt werden. Im Biosicherheitswerkschrank das Medium aus den unteren Kanaleinlassbehältern entnehmen und täglich durch drei Milliliter der Dosierlösung ersetzen. Dann legen Sie die Schalen in das Kulturmodul und perfundiert die Chips mit einer hohen Durchflussrate von 1.000 Mikrolitern pro Stunde für fünf Minuten.
Stellen Sie die Durchflussrate auf 60 Mikroliter pro Stunde um und setzen Sie die fluidische Kultur fort. Fügen Sie 100 Mikroliter DPBS pro Vertiefung in eine 96-Well-schwarze Wandplatte ein. Mit einer Mehrkanalpipette werden 50 Mikroliter des Abwassers aus allen Lagerstätten in die jeweiligen Brunnen gegeben.
Um eine Standardkurve zu erstellen, führen Sie eine dreifache Verdünnung des Mediums durch, das 100 Mikrogramm pro Milliliter drei Kilodalton Dextran-Kaskadenblau in DPBS enthält. Führen Sie dann serielle Wahnvorstellungen mit einer dreifachen Verdünnung des Wachstumsmediums der Endothelzellen in DPBS durch. Ausgeprägte morphologische Merkmale des Zwölffingerdarms und des Dickdarms wurden durch das Vorhandensein der zottenartigen Formationen im Zwölffingerdarmchip hervorgehoben, die die Architektur des Dünndarms darstellen.
In dem Zwölffingerdarmchip, der den Cytochrom-P450-Induktoren Rifampicin und Vitamin D3 ausgesetzt war, gab es eine erhöhte mRNA-Genexpression für das Arzneimittelmetabolisierungsenzym Cytochrom P450 3A4 und eine erhöhte katalytische Aktivität des Cytochrom-P450-Enzyms, was auf geeignete Induktionsreaktionen bei allen drei Organoidspendern hinweist. Bei der Behandlung der epithelialen Monoschicht des Dickdarmchips mit Interferon gamma wurden eine kompromittierte Zellmorphologie und ein Verlust des säulenförmigen Epithels beobachtet. Auch die Behandlung mit Interferon gamma führte im Vergleich zur Vehikelkontrolle zu einem erhöhten zytoplasmatischen Signal von Tight und Adhärent Junction Proteinen, was die Verschiebung der Tight Junction-Marker ZO-1 und Claudin 4 und die Internalisierung von Occludin und E-Cadherin zeigte.
Ein signifikanter Anstieg der epithelialen parazellulären Permeabilität wurde nach 48 Stunden Interferon-Gamma-Stimulation auf Dickdarmchips beobachtet. In ähnlicher Weise induziert Interferon gamma die Aktivierung der Apoptose, die durch eine Erhöhung des intrazellulären Inhalts der gespaltenen Caspase 3 angezeigt wird. Interferon gamma induzierte eine polarisierte Sekretion von entzündungsfördernden Molekülen im Dickdarmchip, wie die basolaterale Sekretion von VCAM-1 und Interleukin-6 und die apikale Sekretion von ICAM-1 und Serum-Amyloid-Protein A zeigen.Für eine erfolgreiche Darmchip-Kultur sollte man undifferenzierte Organoide verwenden und die Fragmentierungs- und Seeding-Dichte-Anweisungen befolgen.
Nach erfolgreicher Etablierung des Darmchips können wir die intestinale Resorption, den Transport und den Stoffwechsel, den Nährstoffgehalt und die Darmhormonsekretion, die Wechselwirkungen zwischen Wirtsmikrobenpathogenen, die Arzneimittelsicherheit und -wirksamkeit, patientenspezifische Krankheitsmechanismen und das Ansprechen auf Therapien untersuchen.
