Diese Arbeit wurde von Finanzhilfe aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048) unterstützt. Wir danken Drs. Betty Wu-Hsieh und Chien-Kuo Lee an der NTU, Leigh Zerboni an der Stanford University und Dr. Peter Hoffmann an der Universität von Hawaii für das Manuskript zu lesen, Yun Chien an der NTU für die technische Unterstützung und Dr. Wen-Chi Wei in Landwirtschaft Biotechnologie Research Center an der Academia Sinica für technische Beratung.

Weibliche Mäuse in 8 bis 12 Wochen alt wurden für diese Studie verwendet. C57 / BL6 - Wildtyp (WT) und IL-15 defiziente (IL - 15 - / -) Mäuse wurden von National Laboratory Animal Center (NLAC) erworben, Taiwan und Taconic Farm, respectively. IL-15-defiziente (IL - 15 - / -) und IL-15-dominant (IL - 15 IL - 15 und +/- + / +) zeigten ein Verhältnis 1: 3 in der zweiten Generation aus der Kreuzung von IL - 15 +/- Heterozygoten. Der Genotyp von IL - 15 - / - Mäuse wurden durch PCR - Analyse bestätigt. Die Mäuse wurden in der Spezifische pathogenfreie (SPF) Anlage im Labor Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine gehalten. Alle Tierverfahren einschließlich der Betäubung Materialien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Tier Protokoll, das von der National Taiwan University College of Medicine und der Hochschule für Public Health Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) (Affidavit der Genehmigung des Tier Protokolls 20130225) genehmigt durchgeführt. &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Herstellung von Akupunkturnadeln HINWEIS: Akupunkturnadeln sind Medizinprodukte, bestehend aus einem Handgriff und einem Nadelende (1A). Die Durchmesser der Akupunkturnadel lag im Bereich von 0,2 mm (36 G) bis 0,35 mm (28 G). Wir wählen den besten Punkt der Nadel während Einstechen in die Haut mögliche übermäßige Zellschäden zu vermeiden. Es gibt 4 verschiedene Längen der 0,2-mm-Nadel einschließlich 13 mm (0,5 Zoll), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 Zoll) und 50 mm (2,0 in) in der Länge. Ein Bündel aus 10 Nadeln mit 13 mm Länge bereitgestellt, um den besten bequemen Griff während des Nadel Oszillieren auf C57BL / 6-Mäusehaut. Die Parameter können geändert werden, wenn das Verfahren auf die Haut von größeren Tieren angewandt wird oder von den Forschern mit größeren Händen durchgeführt. <ol><li> Entfernen Sie Akupunkturnadeln aus dem sterilen, pyrogenfreien Paket. Legen Sie die Nadeln auf einem sterilen Tuch. </li><li> Verwenden Klebeetikettenband 10 Nadeln zusammenzubinden ina Bündel (1B). HINWEIS: Die Nadeln 10 sind geometrisch angeordnet, um eine Zylinderform zu bilden. Der Einfachheit halber wird ein Stück Paraffinfilm verwenden, um die Anordnung zu stabilisieren, bevor das Klebeband aufgebracht wird. Stellen Sie sicher, dass alle Nadelspitzen auf der gleichen Ebene liegen. ein Bündel anstelle einer einzelnen Nadel erleichtert maximale DNA Infusion durch den Kontaktbereich zwischen den Nadeln und der Haut zu erhöhen. </li></ol> 2. Herstellung einer großen Menge und Endotoxin-freie Plasmid-DNA <ol><li> Verwandeln chemisch kompetente Bakterienzellen mit dem Plasmid DNA. </li><li> Auswählen und inokulieren eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB - Medium , das Antibiotika und inkubieren bei 37 ° C in einem Schüttler über Nacht. </li><li> Scale - up die Kultur durch die Bakterienkultur in 1 verdünnt: 100 in 250 ml LB - Medium mit Antibiotika und Schütteln über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine große Menge an DNA, die durch eine hohe qualit Verwendungy, Endotoxin frei Plasmidpräparation Kit nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Acufection Protokoll erfordert eine hohe Reinheit und eine große Menge an Plasmid-DNA. Verwendung einer hohen Qualität, frei von Endotoxin und column-gereinigter Plasmid-DNA wird empfohlen. </li><li> Eluieren der DNA in sterilem Wasser. Shop DNA in kleinen Portionen bei -20 ° C bis zu seiner acufection. HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-und-Tau von DNA konsistent Plasmid-DNA-Expression zu gewährleisten. </li><li> Verdünnte Plasmid-DNA zu 1 mg / ml in sterilem PBS für acufection. </li></ol> 3. Verfahren für die Acufection HINWEIS: Die optimale Menge an DNA und der Bereich der Zielhautoberfläche kann für verschiedene Gene variieren und müssen weiter optimiert werden. Die Einstichkraft und die Anzahl der Male, die Hornschicht der Haut zu lösen, auch in Abhängigkeit von der Hautdicke variieren. Diese Bedingungen müssen sorgfältig bestimmt werden, nachdem das Expressionsniveau von acufected Gen transcri Bewertungpts durch qRT-PCR. <ol><li> Wiegen der Mäuse und verabreichen Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) durch peritoneale Injektion. HINWEIS: 2,2,2-Tribromethanol ist ein injizierbares Narkosemittel, das bei Mäusen häufig verwendet wurde. Lösungen werden durch Lösen eines nicht pharmazeutischem Grad 2,2,2-Tribromethanol (2,5 g) in destilliertem Wasser (200 ml), enthaltend 2,5% 2-Methyl-2-butanol hergestellt. </li><li> Verwenden vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern. HINWEIS: - 2 min betäubende Wirkung wird in 1 induziert werden. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex vor dem Betrieb eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten. </li><li> Shave die dorsale Flanke und die Haut anwenden Enthaarungscreme Keratinproteinen in der Haarschaft zu lösen. HINWEIS: Die Verwendung von Enthaarungscreme Haare entfernen wird die Infusion von DNA in die Haut erleichtern. </li><li> Verwenden Sie Wasser getränkte Wattebäusche die Enthaarungscreme abzuwischen. HINWEIS: Die Enthaarungscreme in Wasser löslich sind. Die vollständige Entfernung der Creme will eine schmierige Oberfläche verhindern und eine bessere stech Ergebnis zu gewährleisten. </li><li> Verwenden ein steriles Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt, um die Hautoberfläche zu desinfizieren. </li><li> Markierung des Zielbereich (1 cm x 1 cm) auf der enthaarten Haut mit einer vorgemessenen Schablone. HINWEIS: Um die Zielstelle Kennzeichnung wird dazu beitragen, das Nadelbündel nach oben und nach unten innerhalb eines definierten Bereichs anzuwenden. Dies ist wichtig, Lieferung der gleichen Menge an DNA zu einer spezifischen Oberfläche, um sicherzustellen, Experiment zu Experiment Variation zu minimieren. </li><li> Legen Sie eine 10 uL Tropfen von Plasmid-DNA (10 ug) auf die markierte Haut. HINWEIS: Die Menge an DNA für acufection variiert mit verschiedenen Genen und dem Typ des Expressionsvektors. Die Menge an DNA verwendet wird, sollte sorgfältig titriert werden, bevor das Experiment von Interesse durch. Die 10 &amp; mgr; L ist ein kleiner Flüssigkeitstropfen und es sitzt gut auf dem rasiert und enthaart Haut ohne rollten während Einstechen. Umfassen eine Kontrollgruppe von Mäusen, die mit 10 &amp; mgr; l leeren Vektor DNA behandelten Mäusen mit einem zum Vergleichmit der Studie Gen cufected. </li><li> Halten Sie die Akupunkturnadel Bündel (1B) und stechen die markierte Oberfläche mit einer Auf- und Abbewegung zu 100 - mal oder bis die Feuchtigkeit von DNA in PBS auf die Haut verschwindet. HINWEIS: Einige Rötung der Hautoberfläche auftreten kann. Vermeiden Sie tiefe Schnitte zu machen, die bluten. Die Anzahl der Auf- und Abbewegungen auf der Hautoberfläche Einstechen ist funktionsfähig bestimmt, wenn die Feuchtigkeit von DNA in PBS (10 ul) verschwindet auf der Haut. Wir entschieden uns 100 mal in 30 s, weil es die meisten konsistente Ergebnisse aus acufection-gelieferten Gene gegeben hat. Gegebenenfalls können die Nadeln bis zu 6 Zielhaut pricks (1 cm x 1 cm je) wiederverwendet werden. Spülen Sie die Nadeln in 70% Ethanol und PBS zwischen acufection. Wechseln Sie in neue Nadeln, wenn sie stumpf oder für verschiedene Plasmid-DNA sind eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Platzieren acufected Mäuse auf einem Heizkissen, die Körpertemperatur, bis wach zu halten. </li><li> Rück Mäuse in ihren Käfig, wenn siewieder genügend Bewusstsein. Hinweis: Halten Sie acufected Mäuse in separaten Käfig (weniger als 5 Tiere pro Käfig) aus dem Käfig von un-acufected Mäuse. </li><li> Setzen Sie Wasserflasche an Ort und Stelle und gibt den Käfig mit dem IVC (einzeln belüfteten Käfig) Rack. </li></ol> 4. postoperative Pflege <ol><li> Für die ersten 48 Stunden nach dem Eingriff, genau überwachen Mäuse für irgendwelche Beschwerden einschließlich Verhaltensänderungen (Unruhe, Erregung oder Essstörung) oder Auffälligkeiten (grobe Behaarung oder gekrümmte Haltung). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) Behandlung von IL-15ΔE7-acufected Haut HINWEIS: Transkriptions-Expression und Proteinproduktion von acufected Genen nachweisbar ist am 3. Tag Mäusen acufected mit dem Plasmid von Interesse kann mit verschiedenen Arten von Stimulanzien 3 Tage nach der Transfektion behandelt werden. Wir zeigen hier durch die IL-15ΔE7-acufected Mäusehaut mit IMQ Creme behandeln. IMQ ist ein imidazoquinolin Amin zugelassen foder Behandlung von externen Genitalwarzen und perinatale 13. Topische IMQ Behandlung wird gezeigt mit der Manifestation der schuppigen Haut, epidermale Proliferation und dermalen Neutrophileninfiltration 12, 14, 15 Human Psoriasis-ähnlichen Hauterkrankungen bei Mäusen zu induzieren. HINWEIS: Der Plasmidvektor enthalten Volllängen-Maus-IL-15-cDNA unter der Regulation der Elongationsfaktor-1 α (PEF), flankiert mit einer IL-2-Signalpeptid und ein FLAG-Tag am C-Terminus (pEF-IL- 15, 5859 Basenpaare), die von Bamford et al , wie beschrieben konstruiert. 16. Das Plasmid wird als ein IL-15-Vorlage verwendet, um die ersten 16 Aminosäuren an den Resten 33 zu löschen - 48 in Exon 7 des IL-15-Gen für IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 Basenpaare) durch SOE (Synthese durch Overlap - Extension) PCR - Verfahren 17. Bakterienkolonien, die waren erfolgreichtransformiert mit IL-15ΔE7 wurden durch Restriktionsenzymverdau und DNA - Sequenzieren , gefolgt von 12, 18 überprüft. Eine große Menge von Endotoxin-freien Plasmid-DNA wurde in dem Protokoll Schritt 2 beschrieben, hergestellt. <ol><li> Anesthetize acufected Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) und gelten vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex auf eine ausreichende Tiefe der Anästhesie vor dem Beginn der operativen Verfahren zu gewährleisten. Hinweis: Da eine 2 cm x 2 cm der Haut wird für IMQ behandelt werden, 2 Dosen von pIL-15ΔE7 Plasmid-DNA (10 ug in 10 ul PBS pro Dosis) auf 2 Zielstellen acufected (1 cm x 1 cm pro Stück). </li><li> Mark Flankenhaut (2 cm x 2 cm), die den acufected Bereich. </li><li> Verwenden Q-tip Applikator topisch IMQ Creme auf der markierten Oberfläche anzuwenden. Hinweis: Schritt 5.1 wird nur für die erste Dosis durchgeführt (60 mg / Dosis).Die nächsten aufeinanderfolgenden Dosen werden nicht-narkotisierten Mäusen angewandt. </li><li> Dokumentieren Sie die Änderungen von IMQ behandelten Rückenhaut täglich mit einem High-Definition-Camcorder. Hinweis: Eine Person hält die Maus, während ein anderes aufnimmt. Standbilder werden geschossen und zu einem späteren Zeitpunkt bearbeitet werden. </li><li> Euthanize Mäuse durch eine Überdosis von Tribromethanol (800 &amp; mgr; g pro Gramm Körpergewicht) Injektion, gefolgt von Genickbruch am Tag 4 oder Tag 7 nach IMQ Behandlung. Die Haut wird ausgeschnitten und verarbeitet (Schritte 4,1-4,5). </li></ol> 6. Homogenat von Mäusehaut <ol><li> Verwenden, um eine chirurgische Schere einen horizontalen Schnitt von der Basis des Schwanzes zu machen. Verfahren bilateral an die Basis der hinteren Gliedmaße und weiterhin vertikal entlang der Flanke mit der Basis des Vorderbeins schneiden. </li><li> Vorsichtig die Haut von dem darunterliegenden Gewebe von posterior zum anterioren. Verwenden Sie die Schere die dorsale Haut abzuschneiden. Legen Sie die Haut auf einer sterilen Petrischale. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell Ziel auszuschneidenHaut und in flüssigem Stickstoff sofort einzufrieren. Anmerkung: Die gleiche Größe acufected Haut ohne (1 cm x 1 cm) oder mit IMQ Behandlung (2 cm x 2 cm) wird für jede Maus befestigt zu minimieren Experiment zu Experiment Variationen. </li><li> Das tiefgefrorene Hautgewebe in der Mitte eines vorgekühlten 2-Kammer-Mörtel mit Griffen und einem Stößel. Verwenden Sie einen Bleihammer auf dem Mörtel um das Gewebe zu pulverisieren. </li><li> Schnell platzieren das pulverisierte Gewebe in ein neues Röhrchen 500 ul Zelllysereagenz zur RNA-Extraktion oder in ein Röhrchen, das 50 ul PBS und 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail enthält Proteinlysat zu erhalten. </li></ol> 7. H &amp; E und immunhistochemische Färbung von Haut Section <ol><li> Platzieren Sie die Hautgewebe in einer Kassette und tauche sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht. </li><li> Einbetten und Gewebeschnitt, die in unserem Fall durch das Pathologie-Labor an der LAC, NTU durchgeführt wurden. Hinweis: Der Abschnitt in einer Dicke von 5 um geschnitten. Platz Gewebe Abschnitons auf positiv geladene Objektträger. </li><li> Wärme , um die Objektträger bei 65 ° C für 15 min. </li><li> Legen Sie die Folien in einer Färbebank. Tauchen Sie die Zahnstange in der entsprechenden Behältern enthalten Xylolersatz zweimal für 5 min, gefolgt von aufeinanderfolgenden Eintauchen in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% und 50% Ethanol (jeweils 5 min) zur Rehydratisierung. Tauchen Sie die Objektträger in Leitungswasser für 3 Minuten vor der Färbung. </li><li> Führen Sie Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Hinweis: H &amp; E-Färbung wurde an der LAC, NTU auf Anfrage bei Pathology Laboratory durchgeführt. </li><li> Für immunhistochemische Färbung, blockieren den Abschnitt mit Blocklösung bei Raumtemperatur für 5 min nicht spezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. Hinweis: Die Blocklösung wird im Handel mit Immunfärbungstechniken entwickelt. Kein Tierserum ist in diesem Produkt enthalten sind. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in PBS die Blocklösung auszuspülen. </li><li> Verdünne die Blocklösung in PBS bei 1:10 und fügen 2% fötalen Rinderserum (FBS) (Verdünnungslösung). </li><li&gt; Pipette der in geeigneten primären Antikörper auf den Abschnitt verdünnt und für 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Die Antikörper werden in Verdünnungslösung verdünnt. Die Antikörperkonzentrationen für diese Färbung wurden bei 1 optimiert: 800 und 1: 200 für Ki67 (Klon SolA15) und Ly6G (Klon 1A8) verbunden sind. Diese Konzentrationen gefunden werden, ohne Hintergrundfärbung deutlichen Fleck zeigen. <ol><li> Befleckt einen seriellen Abschnitt im gleichen Durchlauf mit der gleichen Lösung des primären Antikörper verzichtet wird, um nicht-spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu steuern. </li></ol></li><li> Wasch gleitet dreimal in TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST-Lösung) für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen. </li><li> Pipette einen Tropfen von markierten Polymeren zu jedem Abschnitt und inkubiere bei Raumtemperatur für 40 min. Hinweis: Das markierte Polymer durch Kombination von kommerziell Aminosäurepolymere mit Peroxidase und sekundärem Antikörper hergestellt wird, die zu einem Fab&#39;-Fragmente reduziert wird. Das Reagenz ist bereit für die Verwendungimmunhistochemische Färbung von Maus-Gewebeschnitten. </li><li> Wash gleitet dreimal in TBST für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen. </li><li> Pipette 3,3&#39;-diaminobenzindine tetrahydrochlorid (DAB) Lösung auf Gewebeschnitt und läßt bei Raumtemperatur stehen, bis ein brauner Niederschlag unter einer Hellfeldmikroskopie sichtbar ist. Hinweis: Die Zeit für DAB in Gegenwart von Peroxidase zu fällen ist etwa 30 min. </li><li> Tauchen Sie gleitet in Wasser zu Peroxidase-Aktivität zu stoppen. Dip Slides in Methyl grüne Lösung für die Kernfärbung. Wash gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Platzieren ein Deckglas über den gefärbten Abschnitt, der mit permanentem Befestigungsmedium (8 &amp; mgr; l pro Abschnitt) abgedeckt ist. </li></ol> 8. Foto und Analyse von gefärbten Gewebeschnitten <ol><li> Visualisieren H &amp; E gefärbt und IHC Gewebeschnitte unter einem Hellfeld-Mikroskop. Erfassen von Bildern unter Verwendung von ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) Kamera an das Mikroskop angebracht ist. für qengenAnalyse können Bildverarbeitungssoftware verwendet werden, <ol><li> Scannen Sie die ganzen gefärbten Schnitten eine Scanscope mit einem 20x-Objektiv verwendet wird. </li><li> Messen Sie die epidermale Dicke im 1-mm-Segment der Epidermis und die Anzahl der Ki67-immunoreaktive Zellen innerhalb des Segments zählen. HINWEIS: Die quantitative Analyse wird unter Verwendung von Mikroskopie Automatisierung und Bildanalyse-Software durchgeführt. Epidermisdicke wird durch den Abstand zwischen der Basalschicht und der äußersten Schicht der Epidermis definiert. </li><li> Zähle die Anzahl der Ly6G-immunoreaktive Zellen in der dermalen Bereich (230 x 270 um2 Rechteck) unmittelbar unter topischer IMQ behandelten Haut. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen offen zu legen.

Der kritischste Schritt die Expression des acufected Plasmid-DNA, um sicherzustellen, ist gleichmäßig zu schwingen und die Hornschicht der Haut zu lösen. Während die Nadeln drückt sanft, ohne die Haut zu schneiden, sollte die Kraft stark genug sein, um die Oberfläche zu drücken. Zur Erleichterung der Aufnahme von DNA in 10 &amp; mgr; l Lösung auf einer 1 cm x 1 cm Oberfläche, sollten die Nadeln oszillieren up-and-down für etwa 100-mal in 30 s. Man kann die Kraft bestimmen, die die Haut stechen muss und durch d...

Die Haut ist die erste Linie der Verteidigung des Wirts. Keratinozyten (KCS) ist der Hauptzelltyp in der Haut von Menschen und Mäusen. Als Reaktion auf Umweltreize (zB Sonnenlicht, Sauerstoff, Chemikalien und pathogene invasion) wird KCs aktiviert , und eine Vielzahl von proinflammatorischen Zytokine und Chemokine, wie IL-8 produzieren, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α und GM-CSF - 1. Gemeinsam lösen sie die Rekrutierung von Immunzellen auf der Haut. VERSCHLIMMERT kutanen Entzündung ist oft mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen , einschließlich akut ectopic Kontaktdermatitis und chronischen T - Zell-vermittelte Entzündung (zB allergische Kontaktdermatitis und Psoriasis) 2 verbunden. proinflammatorischen Reaktionen in der Haut modulierenden durch KC Aktivierung Hemmung ist ein plausibler Ansatz Hautentzündung zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz zur transient ein Zytokin-Gen in den Epidermis, um auszudrücken Immun res zu studierenponse Folge einer solchen Behandlung in der Haut. Die Epidermis bildet die oberflächliche Schicht der Haut. Es dient als physikalische Barriere zu halten externe Substanzen, wie Nukleinsäuren und Pathogenen aus den tieferen Schichten der Haut eintritt. Mehrere nadelfreie Techniken wurden für DNA - Transfer epidermalen 3, 4 aufgebaut. DNA in Lösung oder in Verbindung mit kationischen Liposomen oder Adenovirusvektoren wurde an die Epidermis mit Techniken modifiziert wie die Entfernung des Stratum corneum oder die Behandlung mit depilating Reagenz direkt angewendet. Die Entfernung des Epithels verhornten erleichtert DNA die epidermalen Barriere und Interaktion mit Keratinozyten und Langerhans&#39;schen Zellen kreuzen 5 - Immunantworten zu induzieren. Während eine große Oberfläche für die DNA-Transfer zur Verfügung steht und dieser Ansatz ist nicht mit Nadeln, gibt es einschließlich Nachteile der Anforderungfür die großen Mengen an DNA (10-100 ug), harter Behandlung auf der Haut durch Strippen und die inkonsistenten Ergebnisse der Immunantwort in den immunisierten Tieren ohne DNA - Abgabe Booster 6 induziert wird . Mikroteilchen-vermittelte intrazelluläre Abgabe nackten DNA auf die Haut wurde zum Induzieren von Immunantwort , 7, 8 sehr leistungsfähig und reproduzierbar erwiesen. Tragbares Genkanone verwendet worden ist, die Haut Zielstelle mit Plasmid - DNA-beschichteten Goldteilchen 2 &amp; mgr; m-Durchmesser in der Größe mit Hilfe von Druckluft Heliumstrom 9 zu bombardieren. Der Plasmid - DNA wird vermutlich durch KCsand dendritische Zellen (DCs) in der Haut und das Protein aufgenommen wird lokal ausgedrückt , oder 10 bis ableitenden Lymphknoten von DCs transportiert wird. Obwohl die Gen - Kanone System ist einfach und erfordert begrenzte technische Erfahrung, die Kosten für die Herstellung und Lieferung des &quot;DNA - bullassen &quot;(dh Goldpulver, Heliumgas) und für die Gen - Kanone selbst seine allgemeine Geltung hat beschränkt. Darüber hinaus die Leichtigkeit des Genkanone Transports die Forderung nach einem Heliumgas - Abgabesystem begrenzt , wenn die Experimente an verschiedenen Orten durchgeführt werden. Microseeding ist 11 eine höhere Effizienz des Gentransfers als Einzelinjektion und Teilchenbeschuss gezeigt zu erreichen. Microseeding eine Tätowierung Pistole verwendet , ohne die Verwendung von Partikeln Wülste 11. Oszillieren der Mikronadel auf der Haut ist mit diesem Ansatz DNA auf die Haut zu liefern wahrscheinlich direkt die Zellmembran schaben und so DNA zu mehreren Zellen gleichzeitig übertragen. jedoch mit der großen Anzahl von Injektionen verbundenen Schmerzen mit 0,254 mm Durchmesser Nadeln ein Nachteil ist. Hier bieten wir einen alternativen Ansatz zur DNA - Verabreichung in vivo. Die „acufection“ </strOng&gt; Protokoll wir hier beschrieben wird, liefert eine wirtschaftliche und effiziente Weise Plasmid-DNA in Mäusehaut zu liefern. Kurz gesagt, wurden zehn Akupunkturnadel (0,2 mm Durchmesser x 13 mm Länge) in einem Bündel durch ein Klebeband gebunden. Ein Volumen von 10 &amp; mgr; l PBS mit 10 ug Plasmid-DNA, die das Transgen von Interesse enthält, wurde auf der rasierten, Enthaarungscreme behandelter Flanke Haut platziert. Durch die Verwendung von Bündel der Akupunkturnadel, die Oberfläche (1 cm x 1 cm) der Haut, die Keratine an der Hornschicht zu oszillieren wurden gelöst und die Plasmid-DNA auf die Oberfläche aufgebracht wurde, in die Epidermis absorbiert. Hautschäden wurden überwacht und minimal sein gefunden. Die Expression des transfizierten Gens in der acufected Haut wurde sowohl durch quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA bestätigt. Die immunmodulatorische Wirkung von acufection-lieferte IL-15ΔE7 auf kutane Entzündung wurden unter Verwendung des IMQ behandelter demonstriert Mausmodell 12. Während acufection beweist eine einfache und weniger dema seinnden Verfahren zur DNA - Verabreichung in vivo, hat sie die optimale Menge an DNA für verschiedene Gene und die Zeiten , um die Haut stechen sorgfältig optimiert werden , um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Medical device</td></tr><tr><td>Nair&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td>N/A</td><td>Use to remove hair</td></tr><tr><td>Shandon Xyline substitute</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparaffinization</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Solvent for the dissolution of avertin</td></tr><tr><td>Difco&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; LB broth, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Propagation and maintenance of &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; for molecular biology</td></tr><tr><td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Measure IL-15 protein</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>Antibody used for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>anti-mouse Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Antibody used for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>Ultra V block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Reduce nonspecific background staining</td></tr><tr><td>Methyl green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Nuclear staining</td></tr><tr><td>Vecta Mount&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Permanently preserving histochemical stains</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Inhibit protease activity in cell lysate</td></tr><tr><td>Aldara cream</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imiquimod cream</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Use to pulverize skin tissue</td></tr><tr><td>ABI7900HT cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>quantitative real-time PCR assay</td></tr><tr><td>Camcorder</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Image documentation</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Bright-field microscopy</td></tr></tbody></table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

Dysregulation der Immunantwort in der Haut ist mit zahlreichen menschlichen Hauterkrankungen in Verbindung gebracht. Ein direkte Übertragung von immunbezogenen Genen in Hautgewebe ist ein faszinierender Ansatz Immunmodulation von Hautentzündung in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein kostengünstiges Protokoll, die nackte DNA in Mäusehaut geliefert und führt zu einem Transgen-Expression. Das Verfahren wird geprägt „acufection“, bezeichnet ACU Punktur-vermittelter DNA trans fektion. Zur Durchführung acufection, Mäusehaut wurde zuerst mit DNA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend gespitzt leicht mit einem Bündel von Akupunkturnadeln infundiert die Aufnahme von DNA und Transfektion in Zellen zu erleichtern. Der Plasmid-DNA wird vermutlich durch die Keratinozyten und dendritischen Zellen (DCs) in der Haut und in dem Protein exprimiert aufgenommen. Mechanische Stich mit der Nadel per se nicht Hautschäden verursachen oder Keratinozyten - Aktivierung induzieren. Der Ausdruckdie transfizierten Gene wurde sowohl für 2 Tage nach acufection Transkriptions- und Translationsniveau in der Haut detektiert und gehalten bis 7 Tage. Das primäre Ziel für die Entwicklung dieser acufection Methode war eine zuvor nicht definiert Isoform von IL-15 zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahren wird eine alternativ gespleißte IL-15-Isoform mit teilweise deletierten Exon 7 (IL-15ΔE7) wurde in der Haut exprimiert und anschließend mit einem Toll-like-Rezeptor 7 (TLR7) -Agonisten, Imiquimod (IMQ) behandelt, um Entzündung zu induzieren. Acufection-lieferte IL-15ΔE7 in der Haut unterdrückt Keratinozytenproliferation, epidermale Dicke und neutrophile Rekrutierung in IMQ-induzierte Hautentzündung. Mit zunehmendem Interesse der Regulationsmechanismen der Hautentzündung bei der Identifizierung beschriebenes Protokoll hier bietet eine kostengünstige und vielseitige Alternative zu dem Genkanone System oder Microseeding zur DNA - Verabreichung in vivo. Es kann möglicherweise Entdeckung der Funktion eines neuen erlaubenGene in der Haut oder für neue Behandlung für Hautkrankheiten zu untersuchen.

Während einige Rötung innerhalb der ersten Stunde nach dem Einstechen mit Akupunkturnadeln evident war, die Haut am Tag 2 und kein nachteiliger Hautreaktionen 7 bis Tag gelöscht wurde nach Einstechen (2A) beobachtet. Nadeleinstich sehr niedriges Niveau von epidermalen Orthokeratose und minimaler dermalen Infiltration von H &amp; E - Analyse im Vergleich zu unbehandelter Haut (2B) induziert. Die Dicke der Epidermis <strong cla...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für die nackten Plasmid-DNA in Mäusehaut exprimiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist immunbezogenen Gene in Hautgewebe liefern die funktionelle Rolle eines spezifischen Gens in Hautentzündung zu beschreiben.

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K Aufrufe.  National Taiwan University College of Medicine.  Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für die nackten Plasmid-DNA in Mäusehaut exprimiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist immunbezogenen Gene in Hautgewebe liefern die funktionelle Rolle eines spezifischen Gens in Hautentzündung zu beschreiben. 

Serie: Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Forschung

Genetik

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Entwicklungsbiologie

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Biotechnik

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

Aufbau und Betrieb eines akustofluidischen Geräts zur verbesserten Abgabe molekularer Verbindungen an Zellen

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, we describe the protocol for using&#160;an absorbent microneedle-based device, absorbent microbiopsy, for minimally invasive sampling of skin and blood mixture. Our goal is to help facilitate rapid progress in clinical research, the establishment of biomarkers for skin disease and reducing the risk for clinical research participants. In contrast to conventional skin biopsy techniques, the absorbent microbiopsy can be performed within seconds and does not require intensive training due to its simple design. In this report, we describe the use of absorbent microbiopsy, including loading and application, on a&#160;volunteer. Then, we show how to isolate RNA from the absorbed sample. Finally, we demonstrate the use of quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to quantify mRNA expression levels of both blood (CD3E and CD19) and skin (KRT14 and TYR). The methods that we describe utilize off the shelf kits and reagents. This protocol offers a minimally invasive approach for simultaneous sampling of skin and blood within the same absorbent microbiopsy matrix. We have found human ethics committees, clinicians and volunteers to be supportive of this approach to dermatological research.

In this article, we demonstrate how the absorbent microbiopsy technique is performed and how the sample can be used for RNA extraction for simple and simultaneous sampling of skin and blood in a minimally invasive manner.

Saugfähige Microbiopsy Probenahme und RNA-Extraktion für Minimal-Invasive, gleichzeitige Blut und Hautanalyse

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

Medizin

Herstellung von Rohvektoren und effiziente DNA-Verabreichung in Zellkulturen

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue types, making them a popular choice for gene delivery in animal models and in clinical settings. In addition to therapeutic applications, rAAVs are a useful laboratory tool for delivering transgenes tailored to the researcher&#39;s experimental needs and scientific goals in cultured cells. Some examples include exogenous reporter genes, overexpression cassettes, RNA interference, and CRISPR-based tools, including those for genome-wide screens. rAAV transductions are less harmful to cells than electroporation or chemical transfection and do not require any special equipment or expensive reagents to produce. Crude lysates or conditioned media containing rAAVs can be added directly to cultured cells without further purification to transduce many cell types&#8212;an underappreciated feature of rAAVs. Here, we provide protocols for basic transgene cassette cloning and demonstrate how to produce and apply crude rAAV preparations to cultured cells. As proof of principle, we demonstrate the transduction of three cell types that have not yet been reported in rAAV applications: placental cells, myoblasts, and small intestinal organoids. We discuss appropriate uses for crude rAAV preparations, the limitations of rAAVs for gene delivery, and considerations for capsid choice. This protocol outlines a simple, low-cost, and effective method for researchers to achieve productive DNA delivery in cell culture using rAAV without the need for laborious titration and purification steps.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung des Potenzials von ungereinigten rekombinanten AAVs in der Zellkulturforschung 

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is widely used for clinical and preclinical gene delivery. An underappreciated use for rAAVs is the robust transduction of cultured cells without the need for purification. For researchers new to rAAV, we provide a protocol for transgene cassette cloning, crude vector production, and cell culture transduction.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Aufbau und Betrieb eines akustofluidischen Geräts zur verbesserten Abgabe molekularer Verbindungen an Zellen

Saugfähige Microbiopsy Probenahme und RNA-Extraktion für Minimal-Invasive, gleichzeitige Blut und Hautanalyse

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Zusammenfassung

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Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Aufbau und Betrieb eines akustofluidischen Geräts zur verbesserten Abgabe molekularer Verbindungen an Zellen

Saugfähige Microbiopsy Probenahme und RNA-Extraktion für Minimal-Invasive, gleichzeitige Blut und Hautanalyse

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus