この作品は、科学技術省からの助成金によってサポートされていました（MOST 103から2633-B-002から002; 104から2320-B-002から048）。私たちは、博士に感謝します。原稿を読み取るためのベティ呉謝とハワイ大学のスタンフォード大学博士とピーター・ホフマンのNTUでチェンクオ・リー、リー・ゼボーニ、農業バイオテクノロジーの技術支援のためのNTUでユンチェン、博士ウェン・チ・ウェイ技術的助言のための中央研究院の研究センター。

8の雌マウス - 生後12週は、この研究のために使用しました。 C57 / BL6野生型（WT）とIL-15欠損（IL15 - / - ）マウスは、それぞれ国立研究所動物センター（NLAC）、台湾とをTaconic農場から購入しました。 IL-15欠損（IL-15 - / - ）およびIL-15ドミナント（IL15 +/-及びIL15 + / +）は 1を示した：IL15 +/-ヘテロ接合体の断面から第二世代の3比。 IL-15の遺伝子型- / -マウスは、PCR分析により確認しました。マウスは、実験動物センター（LAC）、国立台湾大学医学部（NTU）大学の特定病原体フリー（SPF）施設で維持しました。麻酔薬の材料および方法を含むすべての動物の手順は、公衆衛生施設内動物管理使用委員会（IACUC）（動物議定20130225の承認の宣誓供述書）の国立台湾大学医学部の大学や専門学校で承認された動物のプロトコルに従って行いました。 &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 1。鍼の調製注：鍼治療の針は、ハンドルとニードル端（ 図1A）からなる医療装置です。鍼治療の針の直径を0.2mm（36 G）から0.35ミリメートル（28 G）の範囲でした。私たちは肌を刺す時に潜在的な過剰な細胞の損傷を避けるために、針の最高のポイントを選択します。長さ13ミリメートル（0.5インチ）、25ミリメートル（1.0）、40ミリメートル（1.5）および50mM（2.0）を含む0.2 mmの針の4つの異なる長さが存在します。 13ミリメートルの長さ10針の束は、C57BL / 6マウスの皮膚に針を振動中最良の快適なグリップを提供しました。この方法は、大型動物の皮膚に適用されるか、大きな手で研究者によって行われた場合のパラメータを変更することができました。 <ol><li>無菌の、非発熱性パッケージから鍼を削除します。滅菌ドレープの上に針を置きます。 </li><li>私は一緒に10針をバインドするために、接着ラベルテープを使用しますNA束（ 図1B）。 注：10針が幾何学的に円筒形状を形成するように配置されています。便宜上、粘着テープを適用する前に、装置を安定化させるためにパラフィンフィルム片を使用します。すべてのニードルポイントが同一平面上にあることを確認します。代わりに、単一の針の束を使用することで、針と皮膚との接触面積を増やすことで、最大のDNAの注入を容易にします。 </li></ol>大量かつエンドトキシンフリープラスミドDNAの調製<ol><li>プラスミドDNAを化学的にコンピテント細菌細胞を形質転換します。 </li><li>選択し接種単一細菌コロニーを抗生物質を含むLB培地3mLにし、シェーカーで一晩37℃でインキュベートします。 </li><li>抗生物質を含むLB培地250mLに100と37℃で一晩振とう：1で細菌培養物を希釈することによって、培養をスケールアップ</li><li>高品質Reduceを用いてDNAを大量に調製しますY、製造者の指示に従って、エンドトキシンフリーのプラスミド調製キット。 注：Acufectionプロトコルは、高純度のプラスミドDNAを大量に必要とします。高品質の使用は、エンドトキシンフリーでカラム精製プラスミドDNAが推奨されます。 </li><li>滅菌水中にDNAを溶出します。 acufection直前まで-20°Cで小分けに保管してDNA。 注：一貫性のプラスミドDNAの発現を確実にするためにDNAの繰り返し凍結と融解を避けてください。 </li><li> acufection無菌PBS中1mg / mLのプラスミドDNAを希釈します。 </li></ol> Acufection 3.手順注：DNAの最適量および標的皮膚表面の領域は、異なる遺伝子に対して変化し、さらに最適化される必要があるかもしれません。穿刺力及び回数は、皮膚の厚さに応じて変えることができるまた、皮膚の角質層を緩め。これらの条件は慎重acufected ジーン・トランスクリーの発現レベルを評価した後に決定されなければなりません定量RT-PCRによってPTS。 <ol><li>マウスを秤量し、腹腔内注射によりトリブロモエタノール（グラム体重あたり400μgの）を管理します。 注：2,2,2-トリブロモエタノールは、一般的にマウスで使用された注射用麻酔剤です。溶液は、2-メチル-2-ブタノール2.5％を含有する蒸留水（200 mL）中の非医薬品グレードの2,2,2-トリブロモエタノール（2.5 g）を溶解することにより作製されます。 </li><li>麻酔下で乾燥するのを防ぐために、目に獣医眼科軟膏を使用してください。 注： - 2分麻酔効果は1に誘導されます。操作の前に麻酔の十分な深さを確保するために、つま先ピンチ反射を確認してください。 </li><li>背側脇腹の皮膚を剃ると毛幹にケラチンタンパク質を溶解するために脱毛クリームを適用します。 注：髪を除去するための脱毛クリームの使用は、皮膚へのDNAの注入を容易にするであろう。 </li><li>脱毛クリームを拭き取る水に浸した綿球を使用してください。 注：脱毛クリームは水溶性です。クリームウィルの完全な除去lは脂っこい表面を防止し、より良い穿刺の結果を確認してください。 </li><li>皮膚表面の消毒に70％エタノールに浸した滅菌綿棒を使用してください。 </li><li>予め測定ステンシルと脱毛皮膚にマーク対象領域（X 1、CM1センチ）。注：ターゲットサイトをマーキングすると、上下定義された領域内針バンドルを適用するのに役立ちます。これは、実験間変動を最小限にするために特定の表面領域にDNAの同量の送達を保証することが重要です。 </li><li>マークされた皮膚へのプラスミドDNA（10μgの）の10μLのドロップを置きます。 注：acufectionためのDNAの量は、異なる遺伝子および発現ベクターの種類に応じて変化します。使用されたDNAの量は慎重に関心の実験を行う前に滴定されるべきです。 10μL、小さな液滴であり、それは刺しながら転がり落ちずに剃り、脱毛肌によく座っています。マウスAと比較するために、10μLの空のベクターDNAで処置したマウスのコントロール群を含みます研究遺伝子とcufected。 </li><li>鍼治療の針束（ 図1B）を保持し、100倍または消失皮膚にPBS中のDNAからの水分まで上下運動でマークされた表面を刺します。注：皮膚表面の一部赤みが発生する可能性があります。出血深い切り傷を作ることは避けてください。 PBS中のDNAからの水分（10μL）を皮膚に消える場合、皮膚表面上の上下穿刺動作の数が動作可能に決定されます。それはacufection配信される遺伝子から最も一貫した結果を与えているので、私たちは30秒で100回を決めました。該当する場合、針は、最大6つの標的皮膚呵責（1センチメートルX 1センチメートル毎）に再利用することができます。 acufectionの間に70％エタノール及びPBSで針をすすぎます。彼らは鈍いか、交差汚染を避けるために、異なるプラスミドDNAのためのものであるときに新しい針に変更します。 </li><li>覚醒するまで、体温を維持するために、加熱パッド上acufectedマウスを置き。 </li><li>彼らが持っているとき、自分のケージにマウスを返します。十分な意識を取り戻しました。注：未acufectedマウスのケージから別のケージにacufectedマウスを保持し（ケージ当たり5匹の未満の動物）。 </li><li>場所に水のボトルを入れて、IVC（個別に換気ケージ）ラックにケージを返します。 </li></ol> 4.術後ケア<ol><li>処置後最初の48時間、密接に行動変化（情動不安、攪拌または摂食障害）または異常な外観（粗い被毛又は猫背姿勢）を含む任意の不快感のために、マウスを監視します。 </li></ol> IL-15ΔE7-acufectedスキンの5イミキモド（IMQ）トリートメント注：acufected遺伝子の転写発現とタンパク質の生産は、目的のプラスミドをトランスフェクションの3日後に覚せい剤の異なる種類で処理することが可能でacufected 3日目のマウスで検出可能です。私たちは、IMQクリームとIL-15ΔE7-acufectedマウスの皮膚を処理することによって、ここに示しています。 IMQがfを承認したイミダゾキノリンアミンでありますまたは外性器や周産期いぼ13を処理します。局所IMQ処理は、薄片状皮膚、表皮増殖および皮膚好中球浸潤12、14、15の発現を有するマウスにヒト乾癬様皮膚疾患を誘発することが示されています。 注：プラスミドベクターが含まれる完全長マウスIL-15 cDNAを、伸長因子1α（PEF）の調節下で、C末端にIL-2シグナルペプチドおよびFLAGタグと隣接し（PEF-IL- 15、バンフォードらによって記載されるように構築された5859塩基対）。 16。プラスミドは残基で33最初の16個のアミノ酸を削除するためのIL-15をテンプレートとして使用される - SOEによってIL-15ΔE7ためのIL-15遺伝子のエキソン7 48（PEF-IL-15ΔE7、5811塩基対）（合成オーバーラップ伸長）PCR法17によって。成功した細菌コロニーIL-15ΔE7で形質転換し、制限酵素消化によって確認し、DNA配列12、18により追跡しました。プロトコルのステップ2に記載したようにエンドトキシンフリープラスミドDNAの大量調製しました。 <ol><li>トリブロモエタノール（グラム体重あたり400μgの）の腹腔内注射によりacufectedマウスを麻酔し、麻酔下で乾燥を防ぐために、目に獣医眼科軟膏を適用します。手術手順の開始前に、麻酔の十分な深さを確保するためにつま先ピンチ反射を確認してください。注記さ：2 cm×2センチ皮膚がIMQために処理されるので、のpIL-15ΔE7プラスミドDNA（用量あたり10μLのPBS中10μg）の2つの用量を2つの標的部位（1センチメートルX 1センチメートル毎）にacufectedれます。 </li><li>マークは、皮膚（×2 cm 2のCM）acufected領域をカバーに隣接します。 </li><li>局所的にマークされた表面積にIMQクリームを適用するにはQ-チップアプリケーターを使用してください。注：ステップ5.1は第一の用量（60 /用量）のためにのみ行われます。次の連続投与は、非麻酔したマウスに適用されます。 </li><li>ハイビジョンビデオカメラで毎日IMQ処理した背部皮膚の変化を文書化します。注意：一人は別が記録している間にマウスを保持しています。静止画を撮影し、後で編集しています。 </li><li> IMQ処理後4日目または7日目に頸椎脱臼続いトリブロモエタノールの過剰摂取（グラム体重あたり800μgの）を注射することによってマウスを安楽死させます。皮膚を切除し、処理された（ - 4.5 4.1ステップ）。 </li></ol>マウス皮膚の6ホモジネート<ol><li>尾の付け根から水平カットを作るために、手術ハサミを使用してください。後肢のベースに左右対称に進み、前肢のベースに脇腹に沿って垂直に切断し続けます。 </li><li>慎重に、前方への後部から下部組織から皮膚の皮をむきます。背部皮膚をカットするはさみを使用してください。滅菌ペトリ皿の上に皮を置きます。 </li><li>ターゲットを切除する外科用メスを使用します皮膚、直ちに液体窒素で凍結。注：（X 1、CM1 cm）の無し又はIMQ処理（×2 cm 2のCM）とacufected皮膚の同じ大きさは、実験間の変動を最小限に抑えるために、各マウスのために固定されています。 </li><li>ハンドル付き予冷2区画乳鉢及び乳棒の中心で凍結皮膚組織を置きます。組織を粉砕するモルタルのリードハンマーを使用してください。 </li><li>迅速RNA抽出のため、またはタンパク質溶解物を得るための50のPBSμL及び1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むチューブに細胞溶解試薬の500μLを含む新しいチューブに粉砕組織を置きます。 </li></ol> 7.皮膚切片のH＆Eおよび免疫組織化学染色<ol><li>カセット内の皮膚組織を置き、一晩、4％パラホルムアルデヒドでそれを浸します。 </li><li>我々の場合にはLAC、NTUで病理学研究所で行われた埋め込みやセクションの組織、。注：セクションを5μmの厚さで切断されます。組織sectiを配置正に荷電したスライド上のアドオン。 </li><li> 15分間65℃でスライドを加熱します。 </li><li>染色ラックにスライドを置きます。二回、100％、95％、80％、再水和のための75％、60％および50％エタノール（5分毎）に順次浸漬して、続いて5分間のキシレン代替物を含む対応するタンクにラックを浸します。染色の前に、3分間スライドを水道水で浸します。 </li><li>ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。注：H＆E染色はLAC、NTUで病理研究所で要求に応じて行きました。 </li><li>免疫組織化学染色のために、非特異的バックグラウンド染色を減少させるために5分間室温でブロック溶液でセクションをブロックします。注：ブロック溶液は市販の免疫染色技術を用いて開発されています。いいえ動物血清は、この製品に含まれていません。 </li><li>ブロック溶液をリンスするためにPBSでスライドを浸し。 </li><li> 1：10でPBSでブロック溶液を希釈し、2％ウシ胎児血清（FBS）（希釈溶液）を加えます。 </li><lI&gt;ピペット部上に適切に希釈した一次抗体と室温で60分間インキュベートします。注：抗体は、希釈溶液で希釈します。この染色用の抗体濃度は1で最適化されている：800および1：200のKi67（クローンSolA15）およびLy6G（クローン1A8）のために、それぞれ。これらの濃度は、バックグラウンド染色せずに明瞭な染色を示すことがわかっています。 <ol><li>二次抗体の非特異的結合を制御するために、一次抗体を省略し、同じ溶液で同じラン内の1つの連続切片を染色します。 </li></ol></li><li>洗浄は、5分ごとにTBS中で3回+ 0.1％のTween-20（TBST溶液）をスライドさせます。洗浄の間に変更するソリューション。 </li><li>各セクションに標識されたポリマーの一滴をピペットで40分間室温でインキュベート。注：標識されたポリマーは、商業的にFab」フラグメントに還元されるペルオキシダーゼ及び二次抗体とアミノ酸ポリマーを組み合わせることによって調製されます。試薬は、使用する準備ができていますマウスの組織切片の免疫組織化学染色。 </li><li>洗浄は5分ごとに、TBSTで3回スライド。洗浄の間に変更するソリューション。 </li><li>組織切片上にピペット3,3&#39;- diaminobenzindine四塩酸塩（DAB）溶液と褐色の沈殿物が明視野顕微鏡下で表示されるまで、室温で放置します。注：DABペルオキシダーゼの存在下で沈殿する時間は約30分です。 </li><li>ペルオキシダーゼ活性を停止するために、水にスライドを浸します。核染色のためのメチルグリーン溶液中でディップスライド。洗浄は、5分ごとにPBSで3回スライドします。 </li><li>永久封入剤（セクション当たり8μL）で覆われている染色切片上にカバースリップを置きます。 </li></ol>ステンド組織切片の8写真と分析<ol><li>明視野顕微鏡下でH＆E染色およびIHC組織切片を視覚化します。顕微鏡に取り付けられた電荷結合素子（CCD）カメラを用いて画像を捕捉します。 Qについてuantitative分析、イメージングソフトウェアを使用することができます<ol><li> 20Xの目的でscanscopeを使用して全体の染色切片をスキャンします。 </li><li>表皮の1mmのセグメント内の表皮の厚さを測定し、セグメント内のKi67免疫反応性細胞の数を数えます。 注：定量分析は、顕微鏡の自動化＆画像解析ソフトウェアを使用して行われます。表皮の厚さは、基底層および表皮の最外層との間の距離によって定義されます。 </li><li>直ちに局所IMQ処理された皮膚下の皮膚領域（230 X 270μm2の長方形）でLy6G免疫反応性細胞の数を数えます。 </li></ol></li></ol>

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著者は、開示することは一切金銭興味を持っていません。

acufectedプラスミドDNAの発現を確実にするために最も重要なステップは、均等に振動し、皮膚の角質層を緩めることです。皮膚を切断することなく穏やかに針を押しながら、力は、表面を押圧しにくい十分であるべきです。 1センチメートルX 1cmの面積に10μL溶液中のDNAの吸収を促進するために、針は30秒で約100回上下に振動するべきです。一つは、肌を刺すとacufected遺伝子の最高発現レベルを?...

皮膚は、宿主防御の第一線です。ケラチノサイト（KCS）は、ヒトとマウスの皮膚における主要な細胞型です。環境刺激（ 例えば、日光、酸素、化学物質や病原性浸潤）に応答して、KCSは、活性化され、このようなIL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-αなどの炎症性サイトカインおよびケモカインの広い配列を生成していますαおよびGM-CSF 1。彼らは一緒に皮膚への免疫細胞の動員を誘発します。悪化皮膚炎症は、多くの場合、急性異所性接触性皮膚炎および慢性のT細胞媒介性炎症（ 例えば、アレルギー性接触性皮膚炎および乾癬）2を含む多数のヒト疾患に関連付けられています。 KC活性化を阻害することにより、皮膚の炎症誘発性の応答を調節することは、皮膚の炎症を治療するためのもっともらしいアプローチです。このプロトコルは、一過性免疫解像度を研究するために、表皮におけるサイトカイン遺伝子を発現するための新しいアプローチを説明します皮膚のような治療に必然ponse。 表皮は、皮膚の最表層を構成します。それは、皮膚のより深い層に侵入するような核酸および病原体などの外部物質を保持物理的障壁として働きます。いくつかの無針技術は、表皮のDNAの転送3、4のために確立されています。溶液中のDNAまたはカチオン性リポソームまたはアデノウイルスベクターに関連した直接そのような角質層の除去または試薬を脱毛での処理のような技術を用いて修飾された表皮に適用されています。角化上皮の除去は、DNAケラチノサイトおよび免疫応答5を誘発するランゲルハンス細胞と表皮バリアとの相互作用を横断を容易にします。大きな表面積は、DNAの転送のために利用可能であり、このアプローチは、針を必要としませんが、要件を含む欠点があります（ - 100μgの10）、ストリッピングによって皮膚に過酷な治療、及びDNA送達ブースター6なしで免疫された動物において免疫応答を誘導するのに矛盾した結果、DNAの大量のために。皮膚への裸のDNAの微粒子媒介性の細胞内送達は、免疫応答7,8を誘導するための非常に効率的で再現性のあることが示されています。手持ち遺伝子銃は、加圧されたヘリウム空気流9により径2μm直径プラスミドDNA被覆金粒子による皮膚の標的部位に衝突するために使用されています。プラスミドDNAは、おそらく皮膚にKCsand樹状細胞（DC）によって取り込まれ、タンパク質が局所的に発現されるか、またはDCを10によって流入領域リンパ節に輸送されます。遺伝子銃システムはシンプルで、限られた技術的な経験を必要とし、「DNA BULを準備し、提供するためのコストが、う」（ すなわち、金粉末、ヘリウムガス）および遺伝子銃用自体は、その一般的な適用を制限している。実験は異なる場所で行われる場合に加えて、ヘリウムガス供給システムの要件は、遺伝子銃の輸送の容易さを制限する。Microseeding単回注射、粒子ボンバードメント11よりも遺伝子導入の高い効率を達成することが実証されている。Microseedingは粒子ビーズ11を使用せずに皮膚にDNAを送達するために入れ墨銃を使用する。このアプローチを用いて皮膚上にマイクロニードルを発振する可能性があります直接細胞膜をこすり、したがって、同時に複数の細胞にDNAを移す。ただし、0.254ミリメートル直径の針を注射の多数に関連する疼痛が欠点です。 ここでは、in vivoでの DNA送達するための別のアプローチを提供します。 「acufection」 </strオング&gt;私たちはここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚にプラスミドDNAを提供する経済的かつ効率的な方法を提供します。簡潔には、10本の鍼治療針（長さX 13ミリメートル、直径0.2 mm）を粘着テープによってバンドルに結合させました。目的の導入遺伝子を含むプラスミドDNAの10μgのPBS中の10μLの体積を剃毛、脱毛クリームで処理した脇腹皮膚上に置きました。皮膚の表面（1センチメートル×1 cm）を発振する鍼バンドルを使用して、角質層におけるケラチンを緩めし、表面に適用されるプラスミドDNAは、表皮に吸収させました。皮膚の損傷を監視し、最小限であることが判明しました。 acufected皮膚におけるトランスフェクトされた遺伝子の発現を、定量的リアルタイムPCR（定量RT-PCR）およびELISAの両方で確認しました。皮膚炎症に対するacufection送達IL-15ΔE7の免疫調節効果は、IMQ処理されたマウスモデル12を使用して実証されました。 acufectionは簡単で、あまりDEMAであると証明する一方でインビボにおける DNA送達のための方法をnding、異なる遺伝子及び皮膚を刺すための時間のDNAの最適量は注意深く再現性のある結果を得るために最適化されなければなりません。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

皮膚の免疫応答の調節不全は、多くの人間の皮膚疾患と関連しています。皮膚組織への免疫関連遺伝子の直接転写は、ヒト疾患のマウスモデルにおける皮膚炎症の免疫調節を調査するための魅力的なアプローチです。ここでは、マウスの皮膚に裸のDNAを提供し、導入遺伝子の発現をもたらすコスト効率のプロトコルを提示します。この方法は、ACUパンク媒介DNAトランスフェクションを示す、「acufection」を造語しています。 acufectionを実行するために、マウスの皮膚は、最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にDNAを注入した後、細胞にDNAおよびトランスフェクションの吸収を容易にするために、鍼治療針の束で軽く刺しました。プラスミドDNAは、おそらく、ケラチノサイト及び皮膚での樹状細胞（DC）によって取り込まれ、タンパク質に発現されます。針自体に機械的にプリックは、皮膚の損傷を引き起こしたり、ケラチノサイトの活性化を誘導しませんでした。表現トランスフェクトされた遺伝子の2日間acufection次転写および翻訳の両方のレベルで皮膚中で検出されたと7日まで維持。このacufection法の開発のための第一の目標は、IL-15の以前に未定義のアイソフォームを調査することでした。炎症を誘導するために、皮膚中で発現させ、続いてToll様受容体7（TLR7）アゴニスト、イミキモド（IMQ）で処理し、この方法は、部分的に欠失し、エクソン7（IL-15ΔE7）と選択的にスプライシングされたIL-15アイソフォームを用いました。皮膚におけるAcufection送達IL-15ΔE7はIMQ誘発性皮膚炎症においてケラチノサイト増殖、表皮の厚さと好中球動員を抑制しました。皮膚炎症の調節機構を同定することに関心の高まりとともに、ここで説明するプロトコルは、 インビボにおける DNA送達のための遺伝子銃システム又はmicroseedingに費用効果的かつ多目的な代替物を提供します。これは、潜在的に小説の機能の発見を可能にすることができます皮膚内または皮膚疾患の新しい治療法を調査するための遺伝子。

いくつかの赤みが鍼治療針を穿刺した後に最初の時間以内に明らかであったが、皮膚は2日目にクリアされ、7日目までの有害な皮膚反応は、（ 図2A）を穿刺した後に観察されませんでした。針の穿刺は、未処置皮膚（ 図2B）と比較してH＆E分析によって表皮orthokeratosisと最小の皮膚浸透の非常に低いレベルを誘導しました。?...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

このプロトコルは、マウスの皮膚に裸のプラスミドDNAを発現するための費用対効果の高い代替法です。プロトコルの全体的な目標は、皮膚の炎症における特定の遺伝子の機能的役割を描写するために皮膚組織への免疫関連遺伝子を提供することです。

「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K ビュー.  National Taiwan University College of Medicine. このプロトコルは、マウスの皮膚に裸のプラスミドDNAを発現するための費用対効果の高い代替法です。プロトコルの全体的な目標は、皮膚の炎症における特定の遺伝子の機能的役割を描写するために皮膚組織への免疫関連遺伝子を提供することです。 

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

免疫・感染学

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

開発<em&gt; in vitroで</emとの相互作用を研究するための&gt;モデル系<em&gt;エクウス</em&gt;<em&gt; caballus</emその高親和性受容体FcεRIとした&gt;のIgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

の栽培<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus：</em&gt;免疫調節虫寄生虫とその分泌製品

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...