이 작품은 과학 기술부에서 부여에 의해 지원되었다 (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). 우리는 박사 감사합니다. 원고를 읽기위한 베티 우 셰 행정 원장과 하와이 대학에서 스탠포드 대학 박사 피터 호프만에서 NTU에 치엔 쿠오 리, 리 저보니, 농업 생명 공학의 기술 지원 NTU에서 윤 치엔 박사 웬 - 치 웨이 기술 자문에 대한 중앙 연구원에서 연구 센터.

8에서 여성 마우스 - 연령 12 주 본 연구에 사용되었다. C57 / BL6 야생 - 타입 (WT)와 결핍 IL-15 (IL15 - / -) 마우스는 각각 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만, 타 코닉 농장에서 구입 하였다. IL15 +/- 이형의 단면으로부터 제 3 세대의 비율 결핍 IL-15 (IL15 - - /) 및 IL-15을 보이면서 (+/- IL15 및 IL15은 + / +) 1을 나타내었다. IL15의 유전자형 - / - 생쥐는 PCR 분석에 의해 확인 하였다. 마우스는 실험 동물 센터 (LAC), 국립 대만 대학교 의학 (NTU) 대학에서 특정 병원체 무료 (SPF) 시설에서 유지되었다. 마취 대상 및 방법을 포함한 모든 동물의 절차는 공중 보건 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (동물 프로토콜 20130225 승인의 진술서)의 국립 대만 대학 의과 대학 및 대학의 승인 동물 프로토콜에 따라 수행되었다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. 침의 제조 참고 : 침술 바늘은 핸들과 바늘 끝 (그림 1A)로 구성된 의료 장치입니다. 침술 바늘의 직경은 0.35 mm (28 G)는 0.2 mm (36 G)에서이었다. 우리는 피부를 따끔 따끔하는 동안 잠재적 인 과도한 세포 손상을 방지하기 위해 바늘의 최고 지점을 선택합니다. 13mm (0.5)에 25 mm (1.0)에 40 mm (1.5) 및 길이 50 ​​mm (2.0)를 포함하는 0.2-mm 바늘 길이의 4 가지가있다. 13mm 길이 10 개 바늘의 번들 C57BL / 6 마우스의 피부에 바늘을 진동하는 동안 가장 편안한 그립을 제공했다. 이 방법은 큰 동물의 피부에 이상 손으로 연구자에 의해 수행되는 경우 매개 변수를 수정할 수 있습니다. <ol><li> 멸균, 비발 열성 패키지에서 침을 제거합니다. 멸균 드레이프에 바늘을 놓습니다. </li><li> 난 10 바늘을 함께 결합하는 접착 라벨 테이프를 사용NA 번들 (도 1b). 참고 : 10 개 바늘 기하학적 원통 모양을 형성하도록 배치된다. 편의를 위해, 접착 테이프를 적용하기 전에 구성을 안정화 파라핀 필름의 조각을 사용한다. 모든 바늘 포인트가 동일 평면 상에 있는지 확인합니다. 대신 하나의 바늘의 번들을 사용하면 바늘과 피부의 접촉 면적을 증가시켜 최대 DNA 주입을 용이하게합니다. </li></ol> 2. 많은 양의 준비 및 독소가없는 플라스미드 DNA <ol><li> 플라스미드 DNA 화학적 유능한 박테리아 세포를 형질. </li><li> 선택한 LB 배지 함유 항생제 3ml를 단일 박테리아 콜로니를 접종하고, 밤새 진탕하에 37 ℃에서 배양한다. </li><li> C. 항생제를 LB 배지 100 250 mL로 37 ℃에서 밤새 진탕 : 1의 세균 배양을 희석하여 배양을 확장 </li><li> 고해서 양질를 사용하여 DNA를 대량으로 준비Y, 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 플라스미드 준비 키트. 참고 : Acufection 프로토콜은 높은 순도와 플라스미드 DNA를 대량으로 필요합니다. 고품질의 사용은, 내 독소 무료 및 열 정제 플라스미드 DNA를 권장합니다. </li><li> 멸균 수에 DNA를 용출시켰다. acufection에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 작은 씩에 ​​보관 DNA. 참고 : 일관성있는 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 DNA의 반복 동결과 해동을 피하십시오. </li><li> acufection 무균 PBS에 1 ㎎ / ㎖로 플라스미드 DNA를 희석. </li></ol> Acufection 3. 절차 주 : DNA의 최적 량 및 대상 피부면의 면적이 다른 유전자 변화 및 더 최적화 될 필요가있다. 찌름 힘 횟수 피부 두께에 따라서 달라질 수있다 또한 피부의 각질층 느슨하게. 이러한 조건은주의 깊게 acufected 진 트랜스크리의 발현 수준을 평가 한 후 결정해야한다QRT-PCR에 의한 점. <ol><li> 마우스 체중을 복막 주사 tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)을 관리. 참고 : 2,2,2- tribromoethanol 일반적으로 마우스에 사용 된 주사 마취 에이전트입니다. 용액은 2- 메틸 -2- 부탄올 중 2.5 %를 함유하는 증류 물 (200 mL) 중이 아닌 약제 학적 등급 2,2,2- tribromoethanol (2.5 g)를 용해시킴으로써 제조된다. </li><li> 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다. 참고 : - 2 분 마취 효과는 1에서 유도됩니다. 수술 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. </li><li> 지느러미 측면 피부를 면도하고 모발에 케라틴 단백질을 용해 제모 크림을 적용합니다. 참고 : 머리를 제거하는 제모 크림의 사용은 피부에 DNA의 주입을 용이하게합니다. </li><li> 제모 크림을 닦아 물을 적신 면봉을 사용합니다. 주 : 제모 크림은 물에 용해입니다. 크림 줘야의 완전 제거L은 기름기 표면을 방지하고 더 나은 찌름 결과를 확인합니다. </li><li> 피부 표면을 소독하기 위해 70 % 에탄올에 적신 멸균 면봉을 사용합니다. </li><li> 마크 미리 측정 스텐실 면도 한 피부의 목표 영역 (1cm X 1cm). 참고 : 대상 사이트를 표시하는 것은 위아래 정의 된 영역 내에서 바늘 번들을 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 이 실험 실험 간 변동을 최소화하는 표면적 DNA에 동일한 양의 전달을 보장하는 것이 중요하다. </li><li> 피부에 표시된 플라스미드 DNA (μg의 10)의 10 μL 강하를 놓는다. 참고 acufection위한 DNA의 양은 다른 유전자 발현 벡터의 종류에 따라 달라진다. 사용되는 DNA의 양을주의 깊게 관심의 실험을 수행하기 전에 적정해야한다. 10 μL 작은 액적이며 ​​샤프트 동안 굴러없는 면도를 면도하고 피부에 잘 앉는다. 마우스 A를 비교하는 10 μL 빈 벡터 DNA로 처리 된 마우스의 대조군을 포함연구 유전자 cufected. </li><li> 침술 바늘 번들 (그림 1B)를 누른 상태에서 100 배 또는 피부가 사라집니다 PBS의 DNA에서 수분까지 상하 운동으로 표시된 표면을 찌르. 참고 : 피부 표면의 일부 홍반이 발생할 수 있습니다. 피가 깊은 상처를 피합니다. PBS에서 DNA로부터 수분 (10 μL)을 피부에 사라지면 피부 표면에서의 움직임을 샤프트 위아래의 수는 동작 가능하게 결정된다. 이 acufection-전달 유전자 가장 일관된 결과를 제공했기 때문에 우리는 30 초에 100 번을 결정했다. 해당하는 경우, 바늘은 최대 6 개의 표적 피부 찌르는 (1cm X 1cm 각)에 대해 재사용 될 수있다. acufection 사이에 70 %의 에탄올과 PBS에서 바늘을 씻어. 그들이 무딘 또는 교차 오염을 방지하기 위해 다른 플라스미드 DNA에 대한 때 새 바늘로 변경합니다. </li><li> 웨이크까지 체온을 유지하기 위해 가열 패드 acufected 마우스 놓는다. </li><li> 그들이있을 때 자신의 케이지에 마우스를 반환회복 충분한 의식. 참고 : 않은 acufected 쥐의 케이지에서 별도의 새장에 acufected 마우스를 유지 (케이지 미만 5 동물). </li><li> 장소에 물병을 넣고 IVC (개별 환기 케이지) 랙에 새장을 반환합니다. </li></ol> 4. 수술 후 케어 <ol><li> 시술 후 첫 48 시간 동안, 밀접하게 행동 변화 (불안, 교반 또는 섭식 장애) 또는 비정상적인 모양 (거친 털 코트 또는 구부리고 자세)를 포함한 모든 불편에 대한 마우스를 모니터합니다. </li></ol> IL-15ΔE7-acufected 스킨의 제 퀴 모드 (IMQ) 치료 참고 : acufected 유전자의 전사 발현과 단백질 생산은 관심의 플라스미드가 삼일 형질 전환 후 각성제의 다른 유형으로 처리 할 수와 acufected 일 3. 마우스에 감지 할 수 있습니다. 우리는 IMQ 크림과 IL-15ΔE7-acufected 마우스 피부를 처리하여 여기에 설명한다. IMQ는 imidazoquinolin 아민 승인 F이고또는 외부 생식기 및 주 산기 사마귀 (13)을 치료. 국소 IMQ 처리는 판상 피부 표피 증식 및 피부 호중구 침윤 12, 14, 15의 발현과 마우스에서 인간 건선과 같은 피부 질환을 유발하는 것으로되어있다. 주 : 플라스미드 벡터는 C 말단 (PEF-IL-에서 IL-2 신호 펩티드 및 FLAG 태그 측면 연장 인자 -1 α의 조절 (PEF)하에 전장 마우스 IL-15의 cDNA를 포함 뱀 포드 등에 의해 기술 된 바와 같이 제조 하였다 (15), 5859 염기쌍). (16). 플라스미드 잔기에서 처음 16 개 개의 아미노산을 삭제하기 위해 IL-15 주형 33 사용 - SOE 의해 IL-15ΔE7 (PEF-IL-15ΔE7, 5,811 염기쌍)에 IL-15 유전자의 엑손 7 48 (합성 오버랩 연장) PCR 방법 (17). 성공적이었다 세균성 식민지IL-15ΔE7 형질는 제한 효소 절단에 의해 확인되고 DNA 서열 12, 18 따랐다. 프로토콜 2 단계에서 설명 된 바와 같이 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 대량으로 제조 하였다. <ol><li> tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 acufected 마취 하에서 건조를 방지하기 위해 눈 안과 의사 연고를 적용한다. 수술 절차를 시작하기 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. 주 : 2cm X 2cm 피부가 IMQ 치료되기 때문에, 필 - 15ΔE7 플라스미드 DNA (용량 당 10 μL PBS에서 10 μg의) 2 투여 2 개 표적 부위에 acufected된다 (1cm X 1cm 각). </li><li> 표 피부 (2cm X 2cm)을 acufected 면적의 측면. </li><li> 국소 표시된 면적에 IMQ 크림을 적용하는 Q-팁 어플리케이터를 사용합니다. 주의 : 단계 5.1 첫 번째 투여 하였다 (60 mg / 투여 량)에 대해 수행된다.다음 연속 투여가 아닌 마취 된 쥐에 적용됩니다. </li><li> 고화질 캠코더와 함께 매일 IMQ 처리 지느러미 피부의 변화를 문서화합니다. 참고 : 한 사람이 또 다른 기록하는 동안 마우스를 보유하고 있습니다. 스틸 사진을 촬영하고 나중에 편집됩니다. </li><li> IMQ 처리 후 4 일째 또는 7 일째 경추 탈구 하였다 tribromoethanol의 과량 (GM 체중 당 800 μg의)을 주입하여 마우스를 안락사. 피부는 절개되고 처리된다 (- 4.5 4.1 단계). </li></ol> 마우스 피부 6. 균질 현탁액 <ol><li> 꼬리의 기지에서 수평 컷을 만들기 위해 수술 가위를 사용합니다. 사지의베이스에 양자 진행하고 앞다리의베이스에 측면을 따라 수직으로 절단하는 것을 계속한다. </li><li> 조심스럽게 앞쪽에 후부에서 하부 조직으로부터 피부를 벗겨. 등쪽 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 멸균 페트리 접시에 피부를 놓습니다. </li><li> 대상을 절제하기 위해 메스를 사용하여피부 즉시 액체 질소에 동결. 참고 실험 실험 간 변동을 최소화하기 위해 각각의 마우스에 대해 고정 된 동일한 acufected없이 피부의 크기 (1cm X 1cm) 또는 IMQ 처리를하여 (2cm X 2cm). </li><li> 핸들과와 유 봉, 사전 냉장 2 칸 박격포의 중심에 냉동 피부 조직을 놓습니다. 조직을 분쇄하기 위해 박격포에 리드 망치를 사용합니다. </li><li> 신속 RNA 추출 또는 단백질 용 해물을 얻기 위해 50 μL의 PBS 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 튜브에 세포 용해 시약 500 μL를 포함하는 새로운 튜브로 분쇄 된 조직을 놓는다. </li></ol> 스킨 부분의 제 H &amp; E 염색과 면역 <ol><li> 카세트에서 피부 조직을 놓고 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에 젖어. </li><li> 우리의 경우에는 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서 수행 하였다 퍼가 부 조직. 주 : 단면 5 ㎛의 두께로 절단한다. 장소 조직 섹션에 ì양전하를 슬라이드 위에 기능. </li><li> 15 분 동안 65 ° C에서 슬라이드를 가열한다. </li><li> 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 회 100 %, 95 %, 80 %, 75 %, 60 % 및 재수 50 % 에탄올 (각 5 분)에 순차 침지 한 다음 5 분간 크실렌 대체물을 포함하는 탱크에 대응하는 랙을 담근다. 염색 전에 3 분 동안 수돗물 슬라이드를 담근다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 수행합니다. 주 : H &amp; E 염색은 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서의 요청에 따라 수행 하였다. </li><li> 면역 조직 화학 염색을 위해, 비특이적 백그라운드 염색을 감소시키기 위해 5 분 동안 실온에서 차단 용액으로 차단 부. 참고 : 블록 솔루션은 상업적으로 면역 염색 기술로 개발되고있다. 어떤 동물 혈청이 제품에 포함되지 않습니다. </li><li> 블록 솔루션을 씻어 PBS에서 슬라이드를 찍어. </li><li> 1:10 PBS에서 차단 용액을 희석하고, 2 % 소 태아 혈청 (FBS) (희석액)을 추가한다. </li><lI&gt; 피펫 적절히 희석 차 항체 부분 상에 실온에서 60 분 동안 배양한다. 참고 : 항체를 희석 용액에 희석된다. 염색이 항체 농도는 1에서 최적화되었다 : 800 내지 1 : 200 Ki67 (클론 SolA15) 및 Ly6G (클론 1A8)에 대해 각각. 이 농도는 배경 얼룩없이 별개의 얼룩을 보여 발견된다. <ol><li> 동일한 용액은 이차 항체의 비특이적 결합에 대해 제어하는 ​​차 항체를 생략과 동일한 실행 한 직렬 섹션 얼룩. </li></ol></li><li> 세척을 5 분마다 TBS 세 번 더하기 0.1 % 트윈 -20 (TBST 용액)을 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다. </li><li> 각 구역에 표지 된 중합체의 한 방울을 피펫 및 40 분 동안 실온에서 배양한다. 주 : 표지 중합체 상업적 된 Fab &#39;단편 감소 옥시다아제 및 이차 항체 아미노산 중합체를 조합하여 제조된다. 시약은 사용 준비가마우스 조직 절편의 면역 조직 화학 염색. </li><li> 워시는 5 분마다 TBST에 세 번 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다. </li><li> 피펫 3,3&#39;- diaminobenzindine 조직 섹션 위에 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션과 갈색 침전물이 밝은 필드 현미경 아래에 보일 때까지 실온에 서 보자. 주 : DAB는 퍼 옥시 다제의 존재 하에서 석출하는 시간은 약 30 분이다. </li><li> 과산화 효소 활동을 중지하기 위해 물에 슬라이드를 담가. 핵 염색 메틸 녹색 솔루션의 딥 슬라이드. 워시는 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드. </li><li> 영구 장착 매체 (부 당 8 μL)으로 덮여 염색 섹션 위에 커버 슬립을 놓는다. </li></ol> 제 사진 및 분석 스테인드 조직 절편의 <ol><li> 명 시야 현미경으로 H &amp; E 염색 IHC 조직 절편을 시각화. 현미경에 연결된 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 이미지를 캡처. Q 들어uantitative 분석, 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 <ol><li> 20 배 목표와 scanscope를 사용하여 전체 스테인드 섹션을 검색합니다. </li><li> 표피의 1 mm 세그먼트 내의 표피 두께를 측정하고, 세그먼트 내의 Ki67 면역 세포의 수를 계산. 참고 : 정량 분석은 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 표피 두께 기저층과 표피의 최 외곽 층 사이의 거리에 의해 정의된다. </li><li> 바로 국소 IMQ 처리 피부 아래의 피부 영역 (230 X 270 μm의 구형 2)에 Ly6G 면역 세포의 수를 계산. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin.">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li><li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes'+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity.">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li></ol>

저자는 공개 재정적 이해에는이 없습니다.

acufected 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 가장 중요한 단계는 균일 진동과 피부의 각질층을 느슨하게한다. 피부를 절단하지 않고 부드럽게 바늘을 누르는 동안, 힘이 표면을 누르기 힘든 충분해야한다. 1cm X 1cm의 면적에 10 μL의 용액에서 DNA의 흡수를 용이하게하기 위해, 바늘은 30 초에 100 회 상하 진동을한다. 하나는 피부를 찌를 필요가 힘을 결정하고 acufected 유전자의 최고 발현 수준을 산?...

피부 숙주 방어의 첫 번째 라인이다. 각질 세포 (KCS)는 인간과 쥐의 피부의 주요 세포 유형입니다. 환경 적 자극 (예를 들면 태양 광, 산소, 화학 물질 및 병원균 침입)에 응답하여, 관세청 활성화 및 IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 다양한 생산되고 α 및 GM-CSF 1. 이들은 피부에 면역 세포의 채용을 트리거합니다. 악화되는 피부 염증은 종종 급성 자궁외 접촉 피부염 및 만성 T 세포 매개 성 염증 (예를 들어 알레르기 성 접촉 피부염 및 건선) 2 등 다양한 인간 질병과 연관되어 있습니다. KC 활성화를 억제함으로써 피부의 염증 반응을 조절하는 것은 피부 염증을 치료하는 그럴듯한 방법입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 면역 고해상도를 연구하기 위해 표피에서 사이토 카인 유전자를 표현하는 새로운 접근 방식을 설명합니다피부에 이러한 치료에 결과적 ponse. 표피는 피부의 가장 표층을 구성한다. 그러한 피부의 심층 들어가는 병원체 핵산과 같은 외부 물질을 유지하는 물리 장벽으로서 기능한다. 여러 바늘없는 기술은 표피 DNA 전달 3, 4 설립되었다. 용액 중의 DNA 또는 양이온 성 리포솜 또는 아데노 바이러스 벡터와 연관된 직접 이러한 각질층의 제거 또는 시약과 함께 탈모 치료 기법으로 변성 표피에 적용되었다. 각질화 된 상피를 제거하여 DNA는 면역 반응을 유도하는 5 각화 세포 및 랑게르한스 세포, 표피의 장벽 작용을 넘어 용이하게한다. 큰 표면적이 DNA 전송을 위해 사용할 수 있으며이 방법은 바늘을 포함하지 않지만, 요구 사항을 포함하여 단점이있다스트리핑에 의해 - (100 μg의 10), 피부 가혹하고 DNA 전달 부스터 6 않고 면역화 된 동물에서 면역 반응을 유도하는 일관성있는 결과 DNA의 대량 대한. 피부 벗은 DNA의 미립자 - 매개 세포 내 전달은 면역 반응을 7, 8을 유도하는 고효율 및 재현성 것으로 밝혀졌다. 휴대용 유전자 총 가압 헬륨 기류 (9)의 수단에 의해 크기가 2 ㎛의 직경의 플라스미드 DNA 코팅 된 금 입자는 피부의 표적 부위 도배 사용되고있다. 플라스미드 DNA는 아마도 피부 KCsand 수지상 세포에 의해 흡수되고, 단백질은 로컬 표현 또는 수지상 10 림프절로 이송된다. 유전자 총 시스템은 간단하고 제한된 기술 경험은 &quot;DNA의 BUL을 준비하고 제공하기위한 비용이 필요하지만하자 &quot;(즉, 금 분말, 헬륨 가스)와 유전자 총을위한 자체는 일반 응용 프로그램을 제한하고있다. 실험은 서로 다른 위치에서 수행 할 때 또한, 헬륨 가스 공급 시스템에 대한 요구 사항이 유전자 총 수송의 용이성을 제한합니다. Microseeding 단일 분사 입자 충격 (11)에 비해 유전자 전달의 높은 효율을 달성하는 것으로 입증되었다. Microseeding 입자 비드를 사용하지 않고 피부에 DNA를 전달하기 위해 문신 총을 사용한다 (11). 진동이 방법을 이용하여 피부에 미세 바늘이 가능성 직접 동시에 여러 세포에 DNA를 전송하므로 세포막을 긁어. 그러나, 0.254 mm 직경의 바늘 주사 다수과 관련된 통증이 단점이다. 여기에서 우리는 생체 내에서 DNA 전달에 대한 대안 접근 방식을 제공합니다. 은 &quot;acufection&quot; </str옹&gt; 우리는 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스의 피부에 플라스미드 DNA를 전달하는 경제적이고 효율적인 방법을 제공합니다. 간략 10 개 침 (× 길이 13mm, 직경 0.2 mm)를 접착 테이프에 의해 다발로 결합 하였다. 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 10 μg의와 PBS의 10 μL의 볼륨은 면도, 제모 크림 처리 된 측면 피부에 배치되었다. 피부 표면 (1cm X 1cm)을 진동 침술 바늘 뭉치를 사용하여 각질층의 케라틴 느슨하게하고, 표면에 적용되는 플라스미드 DNA는 표피에 흡수시켰다. 피부 손상 모니터링하고 최소한의 것으로 밝혀졌다. acufected 피부 형질 감염된 유전자의 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 및 ELISA에 의해 확인 하였다. 피부 염증에 acufection-전달 IL-15ΔE7의 면역 조절 성 효과는 IMQ 처리 된 마우스 모델 (12)을 이용하여 증명되었다. acufection가 증명하는 동안 쉽고 덜 DEMA 수생체 내에서 DNA 전달을위한 방법을 웍 다른 유전자와 피부를 찌를 수있는 시간에 대한 DNA의 최적의 양은 신중하게 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최적화되어야한다.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Medical device</td></tr><tr><td>Nair&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td>N/A</td><td>Use to remove hair</td></tr><tr><td>Shandon Xyline substitute</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparaffinization</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Solvent for the dissolution of avertin</td></tr><tr><td>Difco&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; LB broth, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Propagation and maintenance of &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; for molecular biology</td></tr><tr><td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Measure IL-15 protein</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>Antibody used for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>anti-mouse Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Antibody used for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td></tr><tr><td>Ultra V block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Reduce nonspecific background staining</td></tr><tr><td>Methyl green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Nuclear staining</td></tr><tr><td>Vecta Mount&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Permanently preserving histochemical stains</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Inhibit protease activity in cell lysate</td></tr><tr><td>Aldara cream</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imiquimod cream</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Use to pulverize skin tissue</td></tr><tr><td>ABI7900HT cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>quantitative real-time PCR assay</td></tr><tr><td>Camcorder</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Image documentation</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Bright-field microscopy</td></tr></tbody></table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

피부 면역 반응의 조절 장애는 수많은 인간의 피부 질환과 연관되어 있습니다. 피부 조직에 면역 관련 유전자의 직접 전송은 인간의 질병의 마우스 모델에서 피부 염증의 면역 변조를 조사 할 수있는 매력적인 방법입니다. 여기에서 우리는 마우스의 피부에 벌거 벗은 DNA를 전달 유전자 발현에 이르게 비용 효율적인 프로토콜을 제시한다. 상기 방법은 천공 ACU 매개 DNA 트랜스 fection를 나타내는 &quot;acufection&quot;를 만들어 낸된다. acufection을 수행하려면 마우스 피부 제 인산 완충 용액 (PBS)에 DNA 주입 후 세포 내로의 DNA 및 형질 흡수를 용이하게 침 다발로 가볍게 찔러 하였다. 플라스미드 DNA는 아마도 각화 세포 및 피부의 수지상 세포에 의해 용해 단백질로 발현된다. 바늘 자체와 기계 녀석은 피부 손상을 일으키거나 각질 세포의 활성화를 유도하지 않았다. 표현형질 전환 된 유전자의 2 일간 acufection 다음 전사 및 번역 모두 수준에서 피부에서 발견 된 7 일까지 유지했다. 이 acufection 방법의 개발에 주 목적은 IL-15의 미리 정의 이성체를 조사 하였다. 염증을 유도하기 위해, 피부에 표현하고이어서 수신자 같은 수용체 7 (TLR7) 작용제, 이미 퀴 모드 (IMQ) 처리이있어서, 부분적으로 삭제 엑손 7 (IL-15ΔE7)와 다르게 스 플라이 싱 된 IL-15 이성체이었다 사용. Acufection-전달 피부는 IL-15ΔE7 IMQ 유도 된 피부 염증의 각질 세포 증식, 상피 두께 및 호중구 모집을 억제 하였다. 피부 염증의 조절기구를 식별하는 관심이 증가함에 따라, 프로토콜은 여기에 기재된 생체 내에서 DNA 전달을위한 유전자 총 시스템 또는 microseeding에 비용 효과적인 다목적의 대안을 제공한다. 잠재적으로 새로운 기능의 검색을 허용 할 수있다피부 또는 피부 질환에 대한 새로운 치료법을 조사하는 유전자.

일부 붉은 침술 바늘로 찌르는 후 첫 시간 이내에 분명 동안, 피부는 하루 2 지워지고 7 일까지 불리한 피부 반응 (그림 2A)를 따끔 따끔 후 관찰되지 않았다. 바늘 찌름 미처리 피부 (도 2b)과 비교하여 H &amp; E 분석 표피 orthokeratosis 최소한의 피부 침투를 매우 낮은 수준의 유도. 표피 두께 (도 2C) 및 Ki67 +<...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다.

&quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K 조회수.  National Taiwan University College of Medicine.  이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다. 

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Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

피부는 DNA 백신 배달을위한 새로운 접근 방식으로 문신

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

연구

생체공학

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

생물학

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

식물에 대한 효율적인 생체 분자 및 염료 전달을 위한 탄소 나노섬유 어레이 사용

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

저자 스포트라이트: 탄소 나노섬유 어레이를 통한 혁신을 통한 플랜트 변화 실현 

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

생체분자 및 염료를 식물에 전달하기 위해 단단하거나 유연한 기판에 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이 사용

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, we describe the protocol for using&#160;an absorbent microneedle-based device, absorbent microbiopsy, for minimally invasive sampling of skin and blood mixture. Our goal is to help facilitate rapid progress in clinical research, the establishment of biomarkers for skin disease and reducing the risk for clinical research participants. In contrast to conventional skin biopsy techniques, the absorbent microbiopsy can be performed within seconds and does not require intensive training due to its simple design. In this report, we describe the use of absorbent microbiopsy, including loading and application, on a&#160;volunteer. Then, we show how to isolate RNA from the absorbed sample. Finally, we demonstrate the use of quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to quantify mRNA expression levels of both blood (CD3E and CD19) and skin (KRT14 and TYR). The methods that we describe utilize off the shelf kits and reagents. This protocol offers a minimally invasive approach for simultaneous sampling of skin and blood within the same absorbent microbiopsy matrix. We have found human ethics committees, clinicians and volunteers to be supportive of this approach to dermatological research.

In this article, we demonstrate how the absorbent microbiopsy technique is performed and how the sample can be used for RNA extraction for simple and simultaneous sampling of skin and blood in a minimally invasive manner.

흡수 성 Microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 RNA 추출

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

의학

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

A Rapid In Vivo Bioassay for Developmentally Active Enhancers

A potential regulatory sequence (PRS) can be identified by several approaches including conservation analysis and transcription factor-specific chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (TF ChIP-seq). TF ChIP-seq generates a large data set (TF-regulatome) that includes PRSs and background interactions. These approaches require secondary low throughput validation in model systems that replicate the temporal and spatial specificity of the PRS. 
In this report, a protocol is described to rapidly validate activity of PRSs in their developmental context. Following selection of candidate PRSs, the associated sequences are isolated, cloned into a GFP reporter construct, and then transfected into chick embryos. For PRSs that are anticipated to be functional during early development, from gastrulation through early organogenesis, whole embryo electroporation (EP) is recommended. With this technique transfection, incubation and monitoring occurs ex ovo during early gastrulation. The entire embryo is transfected and as structures form, they can be monitored live for PRS activity. This ex ovo approach supports development up to early limb bud outgrowth. 
If the functional activity of a PRS is expected to be later in development or if the investigation is to ascertain its activity during the development of a specific organ, targeted regional electroporation (TREP) is used. This approach requires injection of construct DNA directly into the developing organ, precursor or adjacent cavity prior to electroporation. An approach to transfect the presumptive limb bud using TREP is also outlined and illustrated. TREP supports a rapid organ-specific validation of a PRS' activity. Both techniques can also be used to investigate regulatory domains by site-directed mutagenesis of the PRS-reporter construct. 
The chick as a bioassay offers a rapid effective tool for PRS validation, functional domain determination, and further characterization of the regulatory events responsible for development.

With the increased use of transcription factor-specific ChIP-seq technology, techniques to validate potential regulatory regions are critical. The authors describe a rapid chick bioassay to validate the activity of regulatory sequences functioning during development.

A potential regulatory sequence (PRS) can be identified by several approaches including conservation analysis and transcription factor-specific chromatin ...

"Acufection"와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

요약

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피부는 DNA 백신 배달을위한 새로운 접근 방식으로 문신

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

생체분자 및 염료를 식물에 전달하기 위해 단단하거나 유연한 기판에 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이 사용

생체분자 및 염료를 식물에 전달하기 위해 단단하거나 유연한 기판에 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이 사용

생체분자 및 염료를 식물에 전달하기 위해 단단하거나 유연한 기판에 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이 사용

흡수 성 Microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 RNA 추출

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달

A Rapid In Vivo Bioassay for Developmentally Active Enhancers