Este trabajo fue apoyado por la subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos a los Dres. Betty Wu-Hsieh y Chien-Kuo Lee en NTU, Leigh Zerboni la Universidad de Stanford y el Dr. Peter Hoffmann en la Universidad de Hawai por leer el manuscrito, Yun Chien en la NTU para la asistencia técnica, y el Dr. Wen-Chi Wei en Agricultura Biotecnología Centro de Investigación de la Academia Sinica de asesoramiento técnico.

Los ratones hembra de 8 - 12 semanas de edad se utilizaron para este estudio. C57 / BL6 de tipo salvaje (WT) y la IL-15 deficientes (IL15 - / -) ratones fueron adquiridos de Laboratorio Nacional Centro de Animales (NLAC), Taiwán y Taconic Farm, respectivamente. IL-15-deficiente (IL15 - / -) y IL-15-dominante (IL15 e IL15 +/- + / +) mostró una proporción de 1: 3 en la segunda generación de la cruz de heterocigotos IL15 +/-. El genotipo de IL-15 - / - ratones se confirmó por análisis PCR. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Laboratorio Animal Center (ALC), Universidad Nacional de Taiwán (NTU) Facultad de Medicina. Todos los procedimientos con animales, incluyendo los materiales y métodos anestésicos se realizaron de acuerdo con el protocolo de animales aprobado por el Taiwan National College de la Universidad de Medicina y la Facultad de Salud Pública Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) (Declaración jurada de la aprobación del Protocolo de animales 20130225). &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Preparación de agujas de acupuntura NOTA: Las agujas de acupuntura son dispositivos médicos compuestos de un mango y un extremo de la aguja (Figura 1A). Los diámetros de la aguja de acupuntura variaron de 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Seleccionamos el mejor punto de la aguja para evitar posibles daños en las células excesiva durante pinchar la piel. Hay 4 longitudes diferentes de la aguja 0.2 mm incluyendo 13 mm (0,5 in), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 in) y 50 mm (2,0 pulgadas) de longitud. Un haz de 10 agujas con una longitud de 13 mm proporcionó el agarre mejor cómodo durante oscilar la aguja en C57BL / 6 de piel de ratón. Los parámetros pueden ser modificados si se aplica el método a la piel de los animales más grandes o lleva a cabo por investigadores con manos más grandes. <ol><li> Retire las agujas de acupuntura del envase estéril, no pirogénico. Colocar las agujas en un campo estéril. </li><li> Use cinta etiquetado adhesivo para unir 10 agujas juntos ihaz na (Figura 1B). NOTA: Los 10 agujas están dispuestas geométricamente para formar una forma de cilindro. Por conveniencia, utilizar un trozo de película de parafina para estabilizar la disposición antes de aplicar la cinta adhesiva. Asegúrese de que todos los puntos de la aguja están en el mismo plano. El uso de un paquete en vez de una sola aguja facilita infusión máxima de ADN mediante el aumento del área de contacto entre las agujas y la piel. </li></ol> 2. Preparación de una cantidad grande y libre de endotoxina de ADN plásmido <ol><li> Transformar células bacterianas químicamente competentes con el ADN plásmido. </li><li> Seleccionar y inocular una sola colonia bacteriana en 3 ml de LB antibióticos que contienen medio y se incuba a 37 ° C en un agitador durante la noche. </li><li> Escala de la cultura diluyendo el cultivo bacteriano en 1: 100 en 250 ml de medio LB con antibióticos y agitación durante la noche a 37 ° C. </li><li> Preparar una gran cantidad de ADN mediante el uso de un alto quality, kit de preparación de plásmido libre de endotoxinas siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: protocolo Acufection requiere alta pureza y una gran cantidad de ADN de plásmido. El uso de una alta calidad, se recomienda libre de endotoxinas y ADN de plásmido se purificó en columna. </li><li> Eluir el ADN en agua estéril. ADN tienda en pequeñas alícuotas a -20 ° C hasta el momento de acufection. NOTA: Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación del ADN para asegurar la expresión de ADN plasmídico consistente. </li><li> Diluir ADN plasmídico a 1 mg / ml en PBS estéril para acufection. </li></ol> 3. Procedimiento para Acufection NOTA: La cantidad óptima de ADN y el área de la superficie de la piel diana puede variar para los diferentes genes y necesitan ser optimizado aún más. La fuerza de pinchado y el número de veces, para soltar la capa córnea de la piel también puede variar en función del espesor de la piel. Estas condiciones deben determinarse cuidadosamente después de evaluar el nivel de expresión de gene transcri acufectedpts mediante qRT-PCR. <ol><li> Pesar los ratones y administrar tribromoetanol (400 g por g de peso corporal) por inyección peritoneal. NOTA: 2,2,2-tribromoetanol es un agente anestésico inyectable que se utiliza comúnmente en ratones. Las soluciones se prepararon disolviendo una calidad no farmacéutica 2,2,2-tribromoetanol (2,5 g) en agua destilada (200 ml) que contenía 2,5% de 2-metil-2-butanol. </li><li> Utilice veterinario pomada oftalmológica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. NOTA: efecto anestésico puede ser inducida en 1 - 2 min. Compruebe el pellizco reflejo del dedo del pie para asegurar la suficiente profundidad de la anestesia antes de la operación. </li><li> Shave la piel flanco dorsal y aplicar crema depilatoria para disolver proteínas de la queratina en el cabello. NOTA: El uso de crema depilatoria para eliminar el vello facilitará infusión de ADN en la piel. </li><li> El uso del agua empapada bolas de algodón para limpiar la crema depilatoria. NOTA: La crema depilatoria es soluble en agua. La eliminación completa de la crema de Will prevenir una superficie grasienta y asegurar un mejor resultado pinchazo. </li><li> Use un hisopo de algodón estéril empapado en etanol al 70% para desinfectar la superficie de la piel. </li><li> Delimitar la zona de objetivo (1 cm x 1 cm) en la piel depilada con una plantilla previamente medida. NOTA: Al marcar el sitio de destino le ayudará a aplicar el lote de aguja hacia arriba y hacia abajo dentro de un área definida. Esto es importante para asegurar la entrega de la misma cantidad de ADN a un área de superficie específica para minimizar la variación-experimento a experimento. </li><li> Coloque una gota 10 l de ADN plásmido (10 mg) sobre la piel marcada. NOTA: La cantidad de ADN para acufection varía con los diferentes genes y el tipo de vector de expresión. La cantidad de ADN utilizado debe ser cuidadosamente valoró antes de realizar el experimento de interés. El 10 l es una pequeña gota de líquido y se sienta bien en la piel afeitada y depiladas sin rodar hacia abajo mientras pinchazo. Incluyen un grupo de control de ratones tratados con 10! L de ADN vector vacío para comparar con los ratones unacufected con el gen de estudio. </li><li> Mantenga el haz aguja de acupuntura (Figura 1B) y pinchar la superficie marcada con un movimiento hacia arriba y hacia abajo para 100 veces o hasta que la humedad de ADN en PBS en desaparece la piel. NOTA: se puede producir un enrojecimiento de la superficie de la piel. Evitar hacer cortes profundos que sangran. El número de arriba y abajo pinchando movimientos en la superficie de la piel se determina de manera operativa cuando la humedad a partir de ADN en PBS (10 l) desaparece en la piel. Decidimos 100 veces en 30 s, ya que ha dado los resultados más consistentes de los genes acufection-entregado. Si procede, las agujas pueden ser reutilizados para hasta 6 pinchazos en la piel de destino (1 cm x 1 cm cada uno). Enjuagar las agujas en 70% de etanol y PBS entre acufection. Cambiar a nuevas agujas cuando están sordo o para diferentes ADN de plásmido para evitar la contaminación cruzada. </li><li> Coloque ratones acufected sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo hasta que despierta. </li><li> Devolver los ratones a sus jaulas cuando tienenrecuperado el conocimiento suficiente. NOTA: Mantenga ratones acufected en jaula separada (menos de 5 animales por jaula) de la jaula de los ratones un-acufected. </li><li> Ponga la botella de agua en su lugar y volver a la jaula de la vena cava inferior (jaulas ventiladas por separado) bastidor. </li></ol> 4. Cuidado post-operatorio <ol><li> Durante las primeras 48 h después del procedimiento, supervisar de cerca ratones para cualquier incomodidad incluyendo cambios de comportamiento (inquietud, agitación o trastorno de la alimentación) o apariencia anormal (pelo áspero o postura encorvada). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) Tratamiento de la Piel acufected-IL-15ΔE7 NOTA: la expresión transcripcional y la producción de proteínas de gen acufected son detectables en el día 3. Los ratones acufected con el plásmido de interés se puede tratar con diferentes tipos de estimulantes 3 días después de la transfección. Se ilustra aquí mediante el tratamiento de la piel acufected-IL-15ΔE7 ratón con crema de IMQ. IMQ es una f imidazoquinolin amina aprobadoo el tratamiento de verrugas genitales externas y perinatales 13. Tratamiento IMQ tópica se muestra para inducir trastornos de la piel con psoriasis-como humanos en ratones con la manifestación de la piel escamosa, proliferación epidérmica y la infiltración 12, 14, 15 de neutrófilos dérmica. NOTA: El vector de plásmido contenía ratón de longitud completa de IL-15 cDNA, bajo la regulación del factor-1 de alargamiento α (PEF), flanqueado con un péptido señal de IL-2 y una etiqueta FLAG en el extremo C-terminal (pEF-IL- 15, 5859 pares de bases), que fue construido como se describe por Bamford et al. 16. El plásmido se usa como una plantilla de IL-15 para eliminar los primeros 16 aminoácidos en los residuos 33 - 48 en el exón 7 del gen de IL-15 por IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 pares de bases) por SOE (síntesis por extensión de solapamiento) método de PCR 17. Las colonias de bacterias que estaban con éxitotransformada con IL-15ΔE7 fueron verificadas mediante digestión con enzimas de restricción y seguida de la secuenciación de ADN 12, 18. Una gran cantidad de ADN de plásmido libre de endotoxinas se preparó como se describe en el paso 2 protocolo. <ol><li> Anestesie ratones acufected por inyección intraperitoneal de tribromoetanol (400 g por g de peso corporal) y aplicar veterinario pomada oftalmológica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. Compruebe el pellizco reflejo del dedo del pie para asegurar suficiente profundidad de la anestesia antes del comienzo de los procedimientos operativos. NOTA: Como una piel de 2 cm x 2 cm será tratada para IMQ, 2 dosis de ADN de plásmido pil-15ΔE7 (10 g en 10 l de PBS por dosis) se acufected en 2 sitios diana (1 cm x 1 cm cada uno). </li><li> Marcos flanquean la piel (2 cm x 2 cm) que cubre el área acufected. </li><li> Utilice aplicador Q-tip para aplicar tópicamente crema de IMQ en la superficie marcada. Nota: el paso 5.1 se realiza sólo para la primera dosis (60 mg / dosis).Las siguientes dosis consecutivas se aplican a los ratones no anestesiados. </li><li> Documentar los cambios de piel dorsal tratada con IMQ al día con una videocámara de alta definición. Nota: Una persona sostiene el ratón mientras que otro está grabando. Las imágenes fijas se graban y editan en un momento posterior. </li><li> La eutanasia a los ratones mediante la inyección de una sobredosis de tribromoetanol (800 g por g de peso corporal), seguido por dislocación cervical en el día 4 o el día 7 después del tratamiento IMQ. La piel se cortó y se procesa (pasos 4.1 a 4.5). </li></ol> 6. homogeneizado de ratón Piel <ol><li> Use un par de tijeras quirúrgicas para hacer un corte horizontal desde la base de la cola. Bilateralmente proceder a la base de la extremidad posterior y continuar a cortar verticalmente a lo largo del flanco a la base de la extremidad anterior. </li><li> Con cuidado, pelar la piel del tejido subyacente de posterior a la anterior. Use las tijeras para cortar la piel dorsal. Coloque la piel en una placa de Petri estéril. </li><li> Utilizar un bisturí para extirpar objetivopiel y congelarlo en nitrógeno líquido inmediatamente. Nota: El mismo tamaño de la piel acufected sin (1 cm x 1 cm) o con tratamiento IMQ (2 cm x 2 cm) se fija para cada ratón para minimizar las variaciones-experimento a experimento. </li><li> Coloque el tejido de la piel congelada en el centro de un pre-refrigerada mortero 2-compartimiento con asas y una mano de mortero. Use un martillo de plomo en el mortero para pulverizar el tejido. </li><li> colocar rápidamente el tejido pulverizado a un nuevo tubo que contiene 500 l de reactivo de lisis celular para la extracción de ARN o a un tubo que contiene 50 l de PBS y 1x cóctel inhibidor de proteasa para obtener el lisado de proteínas. </li></ol> 7. H &amp; E y tinción inmunohistoquímica de la Sección de la piel <ol><li> Coloque el tejido de la piel en un casete y sumergirlo en paraformaldehído al 4% durante la noche. </li><li> Insertar y sección de tejido, que en nuestro caso se llevó a cabo por el Laboratorio de Patología de la LAC, NTU. Nota: La sección se corta a un espesor de 5 micras. la sección de entre el tejido Placecomplementos en portaobjetos cargados positivamente. </li><li> Calentar los portaobjetos a 65 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en una gradilla de tinción. Sumergir el estante en el tanque correspondiente que contiene sustituto xileno durante 5 min dos veces seguido de inmersión secuencial en 100%, 95%, 80%, 75%, 60% y 50% de etanol (5 min cada uno) para la rehidratación. Sumergir los portaobjetos en agua del grifo durante 3 min antes de la tinción. </li><li> Realizar hematoxilina y eosina. Nota: H &amp; E tinción se realizó a petición del Laboratorio de Patología de la LAC, NTU. </li><li> Para tinción inmunohistoquímica, bloquear la sección con solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 5 min para reducir la tinción de fondo no específica. Nota: La solución de bloqueo se desarrolla comercialmente con las técnicas de inmunotinción. No suero animal está contenido en este producto. </li><li> Sumergir el portaobjetos en PBS para enjuagar la solución de bloqueo. </li><li> Se diluye la solución de bloqueo en PBS a 01:10 y añadir 2% de suero bovino fetal (FBS) (solución diluyente). </li><li&gt; Pipeta el anticuerpo primario diluido apropiadamente sobre la sección y se incuba durante 60 min a temperatura ambiente. Nota: Los anticuerpos se diluyen en solución diluyente. Las concentraciones de anticuerpos para esta tinción se han optimizado a 1: 800 y 1: 200 para Ki67 (clon SolA15) y Ly6G (clon 1A8), respectivamente. Estas concentraciones se encontraron para mostrar distinta mancha y sin tinción de fondo. <ol><li> Tinción de una sección en serie en la misma ejecución con la misma solución omitiendo el anticuerpo primario para controlar la unión no específica del anticuerpo secundario. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en TBS más 0,1% de Tween-20 (solución TBST) durante 5 min cada uno. Cambie la solución entre los mismos. </li><li> Pipetear una gota de polímeros marcados para cada sección y se incuba a temperatura ambiente durante 40 min. Nota: El polímero marcado se prepara comercialmente mediante la combinación de polímeros de aminoácidos con peroxidasa y anticuerpo secundario que se reduce a un fragmento Fab&#39;. El reactivo está listo para usar paratinción inmunohistoquímica de secciones de tejido de ratón. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en TBST durante 5 min cada uno. Cambie la solución entre los mismos. </li><li> Pipeta 3,3&#39;-diaminobenzindine tetraclorhidrato solución (DAB) en sección de tejido y se deja reposar a temperatura ambiente hasta un precipitado de color marrón es visible bajo un microscopio de campo brillante. Nota: El tiempo para DAB a precipitar en presencia de peroxidasa es de alrededor de 30 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos en agua para detener la actividad de peroxidasa. diapositivas de inmersión en solución de verde de metilo para la tinción nuclear. Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Colocar un cubreobjetos sobre la sección teñida que se cubre con medio de montaje permanente (8 l por sección). </li></ol> 8. Fotografía y Análisis de Stained sección de tejido <ol><li> Visualizar las secciones de tejido teñidas con H &amp; E y de IHC con un microscopio de campo claro. Capturar imágenes utilizando dispositivo de carga acoplada (CCD) adjunta al microscopio. Por qanálisis CUANTITATIVA, software de formación de imágenes se puede utilizar <ol><li> Análisis de todo los cortes teñidos usando un sondascopio con un objetivo 20X. </li><li> Mida el espesor de la epidermis dentro de un segmento de 1 mm de la epidermis y contar el número de células Ki67 inmunorreactivas dentro del segmento. NOTA: Análisis cuantitativo se realizó mediante microscopía de automatización y software de análisis de imágenes. El grosor epidérmico se define por la distancia entre la capa basal y la capa más externa de la epidermis. </li><li> Contar el número de células Ly6G inmunorreactivas en el área dérmica (230 x 270 m 2 rectángulo) inmediatamente debajo de la piel tópico IMQ-tratada. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen intereses económico alguno.

El paso más crítico para asegurar la expresión del ADN plásmido acufected es a oscilar y aflojar la capa córnea de la piel de manera uniforme. Mientras empuja las agujas suavemente sin cortar la piel, la fuerza debe ser lo suficientemente duro para deprimir la superficie. Para facilitar la absorción de ADN en 10 solución! L en un 1 cm x 1 cm área de la superficie, las agujas deben oscilar hacia arriba y hacia abajo por cerca de 100 veces en 30 s. Se puede determinar la fuerza que necesita para pinchar la piel y ...

La piel es la primera línea de defensa del huésped. Los queratinocitos (KCS) son el principal tipo de células en la piel de los seres humanos y ratones. En respuesta a estímulos ambientales (por ejemplo la luz solar, oxígeno, productos químicos y la invasión patógena), KCS se activan y producen una amplia gama de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas tales como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α y GM-CSF 1. Juntos desencadenan el reclutamiento de células inmunes en la piel. Inflamación cutánea agravado a menudo se asocia con numerosas enfermedades humanas, incluyendo la dermatitis de contacto ectópico aguda y la inflamación mediada por células T crónico (por ejemplo, dermatitis de contacto alérgica y psoriasis) 2. Modulación de las respuestas proinflamatorias en la piel inhibiendo la activación KC es un enfoque plausibles para tratar la inflamación cutánea. Este protocolo describe un nuevo enfoque para expresar transitoriamente un gen de citoquina en la epidermis con el fin de estudiar res inmunesPonse como consecuencia de un tratamiento de este tipo en la piel. La epidermis se compone la capa más superficial de la piel. Sirve como una barrera física de mantenimiento de sustancias externas tales como ácidos nucleicos y patógenos entren en las capas más profundas de la piel. Varias técnicas libres de agujas han sido establecidos para la transferencia de ADN epidérmico 3, 4. ADN en solución o asociado con liposomas catiónicos o los vectores de adenovirus se ha aplicado directamente a la epidermis modificados con técnicas tales como la eliminación de la capa córnea o el tratamiento con depilación reactivo. La eliminación del epitelio cornified facilita ADN de cruzar la barrera epidérmica y la interacción con los queratinocitos y células de Langerhans para inducir respuestas inmunes 5. Mientras que una gran área de superficie está disponible para la transferencia de ADN y este enfoque no implica agujas, hay desventajas, incluyendo el requisitopara las grandes cantidades de ADN (10 - 100 mg), el tratamiento dura en la piel mediante separación por arrastre, y los resultados inconsistentes en la inducción de respuesta inmune en los animales inmunizados sin refuerzo suministro de ADN 6. La administración intracelular de micropartículas mediada de ADN desnudo para la piel se ha demostrado ser altamente eficiente y reproducible para la inducción de respuesta inmune 7, 8. Una pistola de genes de mano se ha utilizado para bombardear el sitio diana de la piel con el plásmido partículas de oro recubiertas de ADN 2 micras de diámetro de tamaño por medio de flujo de aire de helio presurizado 9. El ADN plásmido se presumiblemente captado por las células dendríticas (DCs) KCsand en la piel y la proteína se expresa de forma local o siendo transportado a ganglios linfáticos de drenaje por DCs 10. Aunque el sistema de pistola de genes es simple y requiere experiencia técnica limitada, el costo para la preparación y la entrega de los &quot;bul de ADNdejar &quot;(es decir, polvos de oro, gas helio) y para la pistola de genes se ha limitado su aplicación general. Además, el requisito de un sistema de suministro de gas helio limita la facilidad de transporte pistola de genes cuando los experimentos se llevan a cabo en diferentes lugares. microsiembra se ha demostrado que se obtiene una mayor eficiencia de la transferencia de genes de una sola inyección y el bombardeo de partículas 11. microsiembra utiliza una pistola de tatuaje para administrar ADN a la piel sin el uso de perlas de partículas 11. oscilante las microagujas en la piel usando este enfoque es probable que raspar directamente la membrana celular y por lo tanto la transferencia de ADN a múltiples células al mismo tiempo. Sin embargo, el dolor asociado con el gran número de inyecciones con agujas de 0,254 mm de diámetro es una desventaja. Aquí proporcionamos un enfoque alternativo para la entrega de ADN in vivo. El &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocolo describimos aquí proporciona una manera económica y eficiente para entregar ADN plasmídico en la piel del ratón. Brevemente, diez agujas de acupuntura (0,2 mm de diámetro x 13 mm de longitud) fueron atados en un manojo por cinta adhesiva. Un volumen de 10! L de PBS con 10 g de ADN plásmido que contiene el transgén de interés se colocó en el afeitado, depilación piel flanco crema-tratada. Mediante el uso del haz de aguja de acupuntura para oscilar la superficie (1 cm x 1 cm) de la piel, las queratinas en la capa córnea se aflojaron y el ADN plásmido aplicado a la superficie fue absorbida en la epidermis. daño de la piel se controló y se encontró que ser mínimo. La expresión del gen transfectado en la piel acufected fue confirmada por tanto cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) y ELISA. Los efectos moduladores inmunes de acufection-entregado IL-15ΔE7 sobre la inflamación cutánea se demostraron usando el modelo de ratón IMQ tratados con 12. Mientras acufection demuestra ser una dema fácil y menosmétodo Nding para la entrega de ADN in vivo, la cantidad óptima de ADN de diferentes genes y los tiempos para pinchar la piel tiene que ser optimizado cuidadosamente para obtener resultados reproducibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

La desregulación de la respuesta inmune en la piel se asocia con numerosos trastornos de la piel humanos. La transferencia directa de genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel es un enfoque fascinante para investigar la modulación inmune de la inflamación cutánea en modelos de ratón de enfermedades humanas. Aquí se presenta un protocolo rentable que entregó ADN desnudo en la piel del ratón y conduce a la expresión del transgen. El método se acuñó &quot;acufection&quot;, que denota acu ADN punción mediada fection trans. Para realizar acufection, la piel del ratón se infundió primero con el ADN en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se pincha ligeramente con un manojo de agujas de acupuntura para facilitar la absorción de ADN y transfección en células. El ADN plásmido se presumiblemente tomado por el queratinocito y las células dendríticas (DC) en la piel y se expresó en una proteína. Pinchazo mecánico con la agujas per se no causa daños en la piel o inducir la activación de los queratinocitos. La expresionde los genes transfectados se detectó en la piel, tanto a nivel de transcripción y traducción siguientes acufection durante 2 días y se mantuvo hasta 7 días. El objetivo principal para el desarrollo de este método acufection fue investigar una isoforma antes delimitada IL-15. Usando este método, un corte y empalme alternativo de IL-15 isoforma con parcialmente suprimido el exón 7 (IL-15ΔE7) se expresó en la piel y, posteriormente, tratado con un receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para inducir la inflamación. Acufection-entregado IL-15ΔE7 en la piel suprime la proliferación de queratinocitos, espesor de la epidermis y el reclutamiento de neutrófilos en la inflamación cutánea inducida por IMQ. Con el aumento de interés en la identificación de los mecanismos de regulación de la inflamación cutánea, el protocolo descrito aquí proporciona una alternativa eficaz y versátil costo para el sistema de pistola de genes o microsiembra para la entrega de ADN in vivo. Puede que potencialmente permitir el descubrimiento de la función de una novelagen en la piel o para la investigación de nuevos tratamientos para las enfermedades cutáneas.

Mientras que algunos enrojecimiento era evidente dentro de la primera hora después de pincharse con las agujas de acupuntura, la piel se aclaró en el día 2 y se observó ninguna reacción adversa de la piel hasta el día 7 después de pinchar (Figura 2A). Pinchazo de aguja indujo muy bajo nivel de ortoqueratosis epidérmica y dérmica mínima infiltración por H &amp; E análisis en comparación con la piel no tratada (Figura 2B).</st...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Este protocolo es una alternativa rentable para expresar ADN plasmídico desnudo en la piel del ratón. El objetivo general del protocolo es para suministrar genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel para delinear el papel funcional de un gen específico en la inflamación cutánea.

Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por &quot;Acufection&quot; y su aplicación a la investigación de la piel

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K vistas.  National Taiwan University College of Medicine.  Este protocolo es una alternativa rentable para expresar ADN plasmídico desnudo en la piel del ratón. El objetivo general del protocolo es para suministrar genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel para delinear el papel funcional de un gen específico en la inflamación cutánea. 

Video: Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Desarrollo de una<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudiar la interacción de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE con su receptor de alta afinidad Fc RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

El cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...