Wir danken Sabine Reckinger für exzellente technische Hilfe und Unterstützung.

1. Vorbereitungen <ol><li> Beispielsammlung Hinweis: Der Magnetrührer Verfahren kann für einzelne oder gepoolte Muskelproben verwendet werden. <ol><li> Die Proben aus den entsprechenden Prädilektionsstellen und in einer angemessenen Menge 9. Beachten Sie die länderspezifischen Anforderungen oder den Empfehlungen der IKT, der OIE oder ISO. <ol><li> Für die Europäische Union, zum Beispiel, nehmen Sie eine 1 g Probe aus einem Zwerchfellpfeiler am Übergang zum sehnigen Teil von Hausschweinen. Stellen Sie sicher, dass alle Muskelproben frei von Fett und Bindegewebe sind. </li></ol></li><li> Wenn die Zunge getestet wird, entfernen Sie die Oberflächenschicht vor dem Test. </li><li> Achten Sie darauf , ob die Proben eingefroren werden, da die meisten Trichinenlarven nicht beständig einfrieren und abrollen nach dem Tod, sind weniger resistent gegen die Verdauung und neigen dazu , an den Behälterwänden zu haften, zu einer verringerten Empfindlichkeit des Assays führt. Hinweis: Wenn gefroren, verdoppeln die Stichprobengröße bei lOsten und die Sedimentation Zeit zu erhöhen (siehe unten). </li></ol></li><li> Vorbereitung der Verdauungsflüssigkeit <ol><li> In 25% HCl (16 ± 0,5 ml) auf 2 l Leitungswasser vorgewärmt bei 46 bis 48 ° C in einen 3 L Becherglas. Eine zu niedrige Temperatur führt zu einer unvollständigen Verdauung; zu hohe Temperatur deaktiviert die enzymatischen Eigenschaften von Pepsin. </li><li> Legen Sie einen Rührstab in den Becher, und rühren Sie die Lösung auf eine vorgewärmte Platte (46-48 ° C). </li><li> Werden 10 ± 0,2 g Pepsin (1: 10.000 NF, 1: 12.500, BP, 2.000 FIP) mit der sauren Lösung. Hinweis: Die Qualität des Pepsin ist von größter Bedeutung, und die Enzymaktivität muss vom Hersteller zertifiziert werden. Für Labor Gründen der Sicherheit und der Pepsin Aktivität zu erhalten, wobei die Reihenfolge Verdauungsflüssigkeit Komponenten der Zugabe muss eingehalten werden. </li></ol></li><li> Muskel - Probenvorbereitung <ol><li> Hacken Sie bis zu 100 g Muskelproben in einem Mixer oder Schleifer. Zur Erleichterung der blending, 2 ml für 2 Wasser zu den Proben und mischen bei max Geschwindigkeit vorgewärmt - 3 s. </li><li> Vor der zweiten Mischung, öffnen Sie den Mixer geben und übertragen jede Muskelprobe an der Spitze des Mischschüssel Kantenrand auf den Boden und wiederholen Sie Blending. Weiter mit Ausbrüchen von 2 Mischen - 3 s, bis keine sichtbaren Fleischstücke bleiben. Hinweis: Eine zu geringe Vermischung in unvollständiger Verdauung führen, während zu viel Verschnitt 6 die Trichinella Larven in den Proben vorhandenen beschädigen. </li></ol></li></ol> 2. Verfahren <ol><li> Muscle Probenaufschluss <ol><li> Übertragung 1 L des Verdauungsflüssigkeit in einen Zylinder. Übertragen Sie das Hackfleisch in den Becher und zu verbreiten, in der Verdauungsflüssigkeit mit einem Löffel oder Gabel. Spülen Sie den Mixer Deckel, Messer und Mixer Schüssel mit 500 ml des vorgewärmten Verdauungsflüssigkeit in den 3-Liter-Becher. Hinweis: Unvollständige Spülen in dem Verlust von sens führen kannitivity. </li><li> Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und halten eine konstante Temperatur von 44-46 ° C und Monitor mit einem Thermometer. </li><li> Rühren Sie die Verdauungsflüssigkeit für 30 Minuten einen tiefen Wirbel ohne Spritzen zu schaffen, bis die Fleischpartikel verschwinden. Je nach der Art des Fleisches getestet (zB Fleisch von Wildtieren), erhöhen die Verdauungszeit bis maximal 60 min. </li></ol></li><li> Filtration und Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit <ol><li> Um die Menge der unverdauten Gewebe bestimmen, stellen Sie die Waage auf Null, wiegen das Sieb vor dem Gebrauch, und beachten Sie dessen Gewicht. Das Sieb sollte sauber und frei von irgendwelchen Gewebepartikel sein, die die Trichinenlarven Erreichen des Sedimentationstrichter behindern könnten. Überprüfen Sie, ob die Trennung Trichter vertikal nivelliert. </li><li> Nach der Verdauung, gießen Sie vorsichtig die Verdauungsflüssigkeit durch ein 180 um Sieb in einen Trichter Trennung Glas. Die Breite des Trennglastrichter sollte nicht be größer als 55% der Länge gute Larve Sedimentation zu ermöglichen. Achten Sie darauf, um ein Überlaufen zu vermeiden. </li><li> Um zu vermeiden, Verlust der Empfindlichkeit, gründlich den Glasbecher und das Sieb mit etwa 200 ml Leitungswasser aus einer Spritzflasche und übertragen das Spülwasser in die Sedimentation Glastrichter. Achten Sie sorgfältig die Ränder des 3-Liter-Becher spülen. Heben Sie das Sieb und spülen Sie gründlich die Fläche unter dem Sieb. </li></ol></li><li> Bestimmung von unverdauten Gewebemenge Anmerkung: Aufgrund von Fehlern in der Ausführung des Verfahrens kann Muskelgewebe verbleiben auf dem Sieb als auch Faszie und Bindegewebe, die unverdaulich sind. Die Menge der unverdauten Gewebe wird während der ersten 10 min Sedimentationsschritt (siehe 2.5) bestimmt. Auf diese Weise können etwa 30 Minuten für das Sieb, um zu trocknen, als Restwasser das ermittelte Gewicht des unverdauten Gewebe beeinflussen können. <ol><li> Legen Sie ein Papiertuch auf einer Skala und wiegen das Sieb mit den undigested Gewebe. </li><li> Ziehen Sie das Sieb Gewicht vor der Filtration aus dem Sieb Gewicht mit unverdauten Gewebe. Der Verdauungsvorgang wird als zufriedenstellend angesehen , wenn nicht mehr als 5% des Gewichts der Probe auf dem Sieb bleibt (dh 5 g / 100 g Ausgangsmaterial). </li><li> Wenn die Menge an unverdauten Gewebe 5% übersteigt, wiederholen Sie den Test mit frischen Muskelproben. Wenn das verbleibende Gewebe überwiegend aus unverdauten Muskelgewebe besteht und frische Proben nicht verfügbar sind, verdauen die unverdaute Reste wieder und zusätzlich zu den Originalproben untersuchen. </li></ol></li><li> Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit <ol><li> Halten des gefilterten Verdauungsflüssigkeit in dem Scheidetrichter während 30 min. Wenn in Ruhe gelassen, wird die Trichinenlarven am Boden des Trichters zu begleichen. </li><li> Wenn gefrorene Proben verwendet werden, auf maximal 60 min die Sedimentationszeit erhöhen. </li><li> Sobald Sedimentation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Hahnmindestens 40 ml der Verdauungsflüssigkeit schnell ablaufen in einen Messzylinder (80 ml, wenn Muskelproben zuvor gefroren gewesen war) des Trenntrichter zu lassen. </li><li> Zunächst wird die Hälfte der Flüssigkeit in den Zylinder lassen und dann vollständig öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung 10 ml der Verdauungsflüssigkeit passieren zu lassen. Schließlich öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung für weitere 10 mL. Dieses Verfahren stellt sicher , dass Trichinella - Larven werden in den Hahn nicht eingeschlossen. Hinweis: Eine ausreichende Geschwindigkeit benötigt wird, um Larven zu vermeiden, in dem Scheidetrichter verbleibende, abnehmende Empfindlichkeit. </li></ol></li><li> Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit in dem Zylinder <ol><li> Lassen Sie das Sediment in dem Zylinder für 10 min Larven zu ermöglichen, zu sedimentieren. Entfernen Sie 30 ml Überstand mit einer Pipette Absaugen des 10 ml Sediment ohne zu stören. </li><li> Um die Menge an Gewebefasern in der Probe zu reduzieren, 30 ml Leitungswasser auf dem Sediment und lassen für weitere 10 mWiederholen Sie in., Bis die Flüssigkeit klar ist. </li><li> Überstand entfernen und übertragen die 10 ml Sediment zu einem gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken gewaschen. Spülen Sie den Zylinder mit 10 ml Leitungswasser und dann das Wasser auf die Probe hinzufügen. Hinweis: Da große Mengen von Verunreinigungen in der Probe , die die Identifizierung der Trichinenlarven verhindern kann (Abbildung 1), sollten weitere Waschschritte durchgeführt werden, falls erforderlich. </li></ol></li><li> Mikroskopische Untersuchung <ol><li> Verwenden Sie einen Trichinoskop oder ein Stereo-Mikroskop mit einer Unterstufe Durchlichtquelle mit einstellbarer Intensität bei einer 15 bis 20-facher Vergrößerung, die Proben unmittelbar nach den Waschschritten zu untersuchen. </li><li> Nachdem die Probe in die gerasterten Petrischale gegossen, untersuchen Sie die Schale / Becken systematisch Raster durch Gitter. Wenn keine verdächtigen Strukturen gefunden werden, bewegen sich sanft die Flüssigkeit in der gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken in einer kreisförmigen Art und Weise jede Trichinella la zu ermöglichenrvae, die möglicherweise übersehen wurden, in der Mitte der Petrischale zu akkumulieren. Wiederholen Sie die Prüfung. </li><li> Wenn ein Verdächtiger Struktur gefunden wird, erhöhen Vergrößerung auf 40 - 100X. Entfernen Trichinenlarven aus der Schale / Becken mit einer Pipette und sammeln sich in einem Rohr mit 90% Ethanol. </li><li> Nachdem das komplette Gericht untersucht worden ist, wiederholen Sie den Vorgang, aus dem leichtem Schütteln der Schale / Becken beginnen. Wiederholen Sie das Verfahren mindestens dreimal oder bis keine Larven gefunden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Larven. Korrelieren auf die Menge an Muskelgewebe getestet und Gegenwart als Larven pro Gramm (LPG). </li><li> Wenn zu viele Larven in der Verdauungsflüssigkeit sind die Larvenzahl zuverlässig zu bestimmen, kehren die Flüssigkeit die Larven in den Messzylinder enthält, Spülen mit Leitungswasser aus einer Spritzflasche, und lassen Larven auf den Boden absetzen. </li><li> Nach 10 min Sedimentationszeit, reduzieren den Überstand zu einem definierten Volumen (zB10 ml). Um das genaue Volumen, den Überstand in ein neues Zylinder mit einer Pipette bestimmen. </li><li> Suspend Larven homogen in der Flüssigkeit durch kräftiges Schütteln. Während der Schüttelbewegung, fügen Sie 12 Tropfen von 20 &amp; mgr; l Larvensuspension auf eine Petrischale. </li><li> Untersuchen Sie jeden Tropfen unter dem Mikroskop. Bestimmen Sie die Anzahl der Larven in 240 &amp; mgr; l und löschen Sie den höchsten und den niedrigsten zählen. Extrapolieren die Anzahl der Larven auf das Gesamtvolumen (zB 10 ml) des Überstandes. Hinweis: Die Qualität des Stereomikroskop ist von größter Bedeutung für die Identifikation von Trichinella - Larven. </li><li> Wenn Larven werden in ein Röhrchen mit einer Pipette gesammelt, sorgfältig zu prüfen, dass die Larven nicht an der Pipettenwand kleben haben, sind aber auf das Rohr übertragen. Hinweis: Positive Trichinella Erkenntnisse aus gepoolten Proben aus dem Pool zurückgeführt auf die Karkasse Herkunfts werden müssen. Hier sollte die Poolgröße schrittweise verringert werden, bis die positive Karkasse Iden istzierten. Die Stichprobengröße kann auch während dieses Prozesses erhöht werden Empfindlichkeit zu erhöhen. Bei der Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis wird eine weitere 20-g-Probe von jedem Schwein entnommen. Die 20 g-Proben von fünf Schweinen werden gepoolt und untersucht die beschriebene Methode verwendet. Auf diese Weise Proben aus 20 Gruppen von fünf Schweinen untersucht. Wenn Trichinella in einer Sammelprobe von fünf Schweinen festgestellt wird, 20 g Proben werden von den einzelnen Schweine in der Gruppe gesammelt und jeweils getrennt untersucht , bis die positive Karkasse Ursprungs erkannt wird. </li></ol></li></ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+distribution+of+sylvatic+and+domestic+Trichinella+larvae+in+production+animals+and+wildlife.">Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife.</a> Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).</li><li>Interisano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+latex+agglutination+test+for+the+detection+of+Trichinella+infections+in+pigs.">Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs.</a> Vet. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Obwohl die Magnetrührverfahren leicht durchgeführt werden, nicht unbedingt an den technischen Details Einhaltung führt zu einer unzureichenden Empfindlichkeit und damit die Gesundheit der Verbraucher gefährden. Die kritischen Kontrollpunkte wurden im Text oben hervorgehoben. Darüber hinaus ist die Verwendung von geeigneter Ausrüstung entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis des Tests. Alle Schiffe sollten mit Silizium an der Oberfläche das Anhaften von Larven zu reduzieren beschichteten aus Glas und Pipettenspitzen werden. Die Empfindlichkeit des Verdauungsmethode hängt von der Larvendichte in den Muskeln und das Ausmaß der Muskel getesteten Probe. Für einen Larvendichte von 3 bis 5 lpg von Muskelgewebe, wurde eine Empfindlichkeit von 100% angegeben, aber unter 1 lpg sank die Empfindlichkeit auf 40% 13. In Abhängigkeit von den getesteten Wirtstierarten kann die Empfindlichkeit des Tests durch die Erhöhung der Menge der Probe verbessert werden verwendet. Das infection Belastung in Tierwelt ist in der Regel gering, daher größere Proben Größen 14 verwendet. Prädilektionsstellen variieren auch bei den Wirtstieren. Dabei wird die geringere Verdaulichkeit von einigen Muskelgewebe wie die Zunge berücksichtigt werden muss, die auch in größeren Probe führen kann Größen 15. Ferner ist es wichtig, daß der Magnetrührer Verfahren internen Kontrollen nicht enthalten zu verstehen. Daher ist Qualitätsmanagement von der Probenahme bis hin zur Dokumentation wesentlich genaue und präzise Ergebnisse zu erhalten. Die Qualität der Laborleistung zu Trichinenlarven in Muskelproben erkennen sollte durch regelmäßige Teilnahme jedes Analyst in Eignungsprüfungen überwacht werden. Weitere Einschränkungen des Verfahrens sind, dass die endgültige Identifizierung Stufe der Muskellarven unter dem Mikroskop sehr subjektiv ist und heavily abhängig von der Kenntnis der Larvenmorphologie von der Prüfungs Analyst. Eine interessante Alternative Methode, dieses Problem zu umgehen, ist die Magnetrührverfahren / auf Filtertrennung gefolgt von Larven Erfassung durch einen Latex-Agglutinationstest. Doch nach EU - Gesetzgebung wird diese Methode nur dann als gleichwertig betrachtet für die Prüfung von Fleisch von Hausschweinen , aber nicht für Tiere , die 4 ein höheres Risiko einer Infektion wie Wildschweine sind. Die Identifizierung des Larven Antigen mit monoklonalen Antikörpern , macht den Test Ziel, bestreitet aber das Labor die Möglichkeit , 16 , um die Anzahl der Larven pro Gramm Fleisch zu bestimmen. Weitere Variationen des Magnetrührverfahren umfassen die mechanisch unterstützt Verdauung von Sammelproben-Methode / Sedimentation Technik, die mechanisch unterstützte Sammelprobe digestion Verfahren / auf Filterisolationstechnik und die automatische Verdauungsverfahren für Sammelproben von bis zu 35 g Technik. Diese Verfahren basieren alle auf der künstlichen Verdauung des Fleisches und die Visualisierung und Zählen von Trichinella Larven, unterscheiden sich aber in der Ausrüstung für die Filtration und Sedimentation Schritte verwendet. Die isolierte Larven können weiter auf Artenebene durch einen molekularen Test (zB Multiplex - PCR) 17 identifiziert werden. Nach der EU - Gesetzgebung, alle positiven Proben müssen an das nationale Referenzlabor oder auf EURLP für die Trichinenart Bestimmung weitergeleitet werden.

Nematoden der Gattung Trichinella in gestreifter Muskeln von carnivore und omnivore Säugetiere, Vögel und Reptilien weltweit nachgewiesen werden. Diese Zoonose-Nematoden können Menschen erreichen, wenn roh oder halb rohes Fleisch und Fleischprodukte aus Schwein, Pferd und Wildtiere aufgenommen werden. Diese Zoonose kann eine ernsthafte Erkrankung des Menschen durch pathognomonische Anzeichen und Symptome, zum Beispiel Durchfall, Fieber, periorbitales Ödem und Myalgie und mögliche Komplikationen wie Myokarditis, thromboembolischen Erkrankungen und Enzephalitis 1 gekennzeichnet sein. Trichinella spiralis ist die am weitesten verbreitete Erreger der Trichinella - Infektion bei Wild- und Haustieren und bewirkt , dass die meisten der Infektionen beim Menschen weltweit. In Europa, Nord- und Westafrika und Westasien, ist Trichinella britovi eine weitere Quelle von Infektionen beim Menschen. Zusätzlich sind zehn anderen Taxa weniger häufig als verursachendes berichtet<html> Agenten der Krankheit beim Menschen und sind in verschiedenen Regionen der Welt, in der Regel bei Wildtieren 2 gefunden. Neben Wildtiere wie Wildschweine, Bären, Walrosse und Dachse, stellt Schweinefleisch die wichtigste Quelle für eine Infektion beim Menschen weltweit. Der beste Weg , Trichinellose zu verhindern , ist durch den Verzehr von rohen Fleischprodukten zu verzichten und kein Fleisch zu kochen, vor allem Wildfleisch zu sicheren Temperaturen (&gt; 65 ° C für 1 min, das heißt , um die Fleischfarbe in den Kern des zu braun aus rosa ändern Fleischprodukt) 3. Die Europäische Union und USDA haben Einfrieren und Garzeiten und Temperaturen für Schweinefleisch - Produkte angegeben , die verwendet werden können , um T. spiralis Larven in Fleisch 4, 5 töten. Darüber hinaus Empfehlungen für die Inaktivierung von Trichinen in Fleisch und Fleischwaren wurden von der Internationalen Kommission für Trichinellose veröffentlicht&quot;xref&quot;&gt; 6. In Europa, zusätzlich zu der Einführung von kontrollierten Bedingungen in kommerziellen Schweineherden in denen das Risiko von Trichinen - Infektion vernachlässigbar ist, ist die Prävention von Menschen Trichinellose auf der Basis der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren 4. Für die Ernährungssicherheit, die Verdauung Assays sind die einzigen zuverlässigen Verfahren für den direkten Nachweis von Trichinella - Larven im Fleisch 3, 7. Wenn es auch mehrere Varianten des Verdauungstest sind, ist der Magnetrührer Verfahren der international akzeptierten Referenzverfahren 3, 4, 7. Dieser Test basiert auf dem Nachweis von Trichinen Larven in quergestreifter Muskeln. Nach der enzymatischen Verdauung von Muskelproben und anschließender Filtration und Sedimentation Schritte, Trichinella Larven werden durch Mikroskopie identifiziert. Je nach Handelsverpflichtungen und der nationalen Gesetzgebung, gibt es eine Vielzahl von kleinen Variationen in dem allgemeinen Protokoll des Magnetrührverfahren. Hier werden technische Details basierend auf den Anforderungen der EU 4, ISO - Spezifikationen 8, ICT - Richtlinien 6 und die Erfahrung der Europäischen Union Referenzlabor für Parasites (EURLP) und dem deutschen Referenzlabor für Trichinella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Knife,Scissors, Tweezers&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:363px;">Cutting samples and removing non-digestible tissue</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Blender&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">With a sharp chopping blade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">With thermostatically controlled heating plate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Stirring Rod</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Teflon-coated, approximately 5 cm long</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:220px;">Conical glass separation funnel</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity of at least 2 litres, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Stands, rings and clamps</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Sieve</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Funnel</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity 3 litres</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Glass measuring cylinder</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity 50 to 100 ml, or centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:220px;">Stereo-microscope</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:220px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">9 cm diameter, marked on their undersides into 10 &#215; 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Aluminium foil</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Alternatively a lid to cover the beakers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">25 % hydrochloric acid</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:220px;">Pepsin</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Strength: 1:10 000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2 000 FIP (F&#233;d&#233;ration internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">70-90% ethyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Tap water</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Heated to 46-48 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Balance</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Accurate to at least 0.1 g</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Metal tray</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Capacity 10 to 15 litres, to collect the remaining digestive juice</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Pipettes and pipette holder</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Different sizes (1, 10 and 25 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:220px;">Thermometer&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">Accurate to 0.5 &#176;C, temperature range at least from 20 &#176; C to 70 &#176; C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Siphon&#160;</td>
			<td style="width:356px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:363px;">For tap water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples

Trichinellose ist eine schwächende Krankheit beim Menschen und wird durch den Verzehr von rohen oder ungekochten Fleisch von infizierten Tieren mit der Nematodenlarven der Gattung Trichinella verursacht. Die wichtigsten Quellen von Infektionen beim Menschen weltweit sind Wildfleisch und Schweinefleisch oder Schweinefleischprodukte. In vielen Ländern ist die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis basierend auf der Identifizierung von infizierten Tieren mittels der künstlichen Verdauung von Muskelproben von anfälligen Tierkadavern. Es gibt mehrere Methoden, die auf die Verdauung von Fleisch, aber der Magnetrührer Methode wird als Goldstandard. Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis von Trichinen Larven durch Mikroskopie nach der enzymatischen Verdauung von Muskelproben und anschließender Filtration und Sedimentation Schritte. Obwohl dieses Verfahren nicht spezielle und teure Ausrüstung erfordert, können interne Kontrollen nicht verwendet werden. Daher sollten strengen Qualitätsmanagement Applie werdenwährend des gesamten Tests d. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es detaillierte Anweisungen zum Umgang und kritischen Kontrollpunkte des Verfahrens der Analysten zur Verfügung zu stellen, auf der Grundlage der Erfahrungen der Europäischen Union Referenzlabor für Parasiten und das nationale Referenzlabor in Deutschland für Trichinella.

<html> Nach dem Verdau kann die Form des infektiösen Larven Muskel variieren, erschwert Identifizierung. Typische Formen sind eng gewickelten Larven, leicht aufgerollt Larven oder C-förmigen oder vollständig abgewickelte Larven (2B - 2C). Die Anzahl der Larven pro Gramm gefunden kann beträchtlich variieren und von einer Larve zu einigen hundert Larven reichen kann. Die Morphologie der infektiösen Muskel Larve wird in 2A gezeigt. Trichinella Larven sind 0,7 bis 1,5 mm lang und etwa 0,3 mm in der Breite. Die Speiseröhre ist schmal und hat eine leicht abgerundete Ende. Die Nagelhaut ist glatt. In der vorderen Hälfte des Körperhohlraums, der stichosome, die eine Struktur eines langen schlanken Röhre durch eine Reihe von 45 bis 55 große Zellen (stichocytes) umgeben gebildet beobachtet werden. Das Rektum ist auch abgerundet ohne Vorsprünge oder Anhängsel 10, 11. t &quot;&gt; Andere Strukturen, neben Trichinenlarven kann nach Muskel Verdauung gefunden werden Einige Beispiele sind in den 3A gezeigt -.. 3F Wilde Tiere werden oft mit anderen Parasiten oder den Muskelproben zur Verfügung infizierte zum Testen während der Ausweidung Prozess durch belebtes verunreinigt oder unbelebter Strukturen / Organismen. die Länge der Larven, das Aussehen der vorderen und hinteren Enden und das Auftreten der stichosome Hilfe zwischen verschiedenen Nematodengattungen 12 zu unterscheiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die mikroskopische Untersuchung von Trichinenlarven Nach (A) Unzureichende und (B) ausreichend Spülschritte. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">um eine größere ve</a>rsion dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> Abbildung 2: Morphologie der Infektiöse Trichinenlarven Anzeigen der Rektum, Stichosome und Speiseröhren der Larve (A). Mögliche Formen der Muskel Larven nach der Verdauung zeigt (B) eng gewickelten und leicht aufgerollt Larven bewegen und (C) abgespult Larven. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiele für Zufallsbefunde nach der Verdauung von Muskel - Proben mit dem Magnetrührverfahren. (A) borstenartigen HaarenErde Wurm in Wildschwein gefunden; (B) Alaria alata von Wildschweinen; (C) Muskelfaser von Wildschweinen; (D) Metastrongylus sp. von Wildschweinen; Toxocara sp: (E) aus Pflanzenfasern in Wildschwein (F) gefunden. Larve von Wildschwein. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis in vielen Ländern der Welt wird durch Verfahren des Verdaus auf der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren basiert, von denen der Magnetrührer Verfahren der Goldstandard gilt.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

magnetic-stirrer-method-for-detection-trichinella-larvae-muscle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

28.5K Aufrufe.  Federal Institute for Risk Assessment.  Die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis in vielen Ländern der Welt wird durch Verfahren des Verdaus auf der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren basiert, von denen der Magnetrührer Verfahren der Goldstandard gilt. 

Serie: Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

Verwendung von fluoreszierenden Immuno-Chemie für den Nachweis von Edwardsiella ictaluri In Kanal Wels ( I. punctatus) Proben

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as with all these technologies, reproducible results depend on a laboratory workflow that incorporates appropriate precautions and controls. This is particularly important with low-biomass samples where contaminating bacterial DNA can generate misleading results. This article details a semi-automated workflow to identify microbes from human breast milk samples using targeted sequencing of the 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 region on a low- to mid-throughput scale. The protocol describes sample preparation from whole milk including: sample lysis, nucleic acid extraction, amplification of the V4 region of the 16S rRNA gene, and library preparation with quality control measures. Importantly, the protocol and discussion consider issues that are salient to the preparation and analysis of low-biomass samples including appropriate positive and negative controls, PCR inhibitor removal, sample contamination by environmental, reagent, or experimental sources, and experimental best practices designed to ensure reproducibility. While the protocol as described is specific to human milk samples, it is adaptable to numerous low- and high-biomass sample types, including samples collected on swabs, frozen neat, or stabilized in a preservation buffer.

A semi-automated workflow is presented for targeted sequencing of 16S rRNA from human milk and other low-biomass sample types.

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...