Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).
1. Probe lyse
Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein DNA/RNA-Extraktion-Kit in einem Reinraum wo gibt es technische und verfahrenstechnische Kontrollen, die Einführung von Umweltbakterien zu den Proben zu minimieren.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Das Biosafety-Kabinett (BSC) Arbeitsbereich sauber mit entsprechenden Oberflächen Reiniger, Nukleinsäure-Verunreinigungen zu beseitigen.</li>
		<li>Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer, und setzen Sie ihn auf 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium-Thiocyanat-Lyse-Puffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien)
	<ol>
<li>Überprüfen Sie die Lyse-Puffer für Ausscheidungen. Wieder lösen sich Ausscheidungen durch die Erwärmung bei 37 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 600 µL Lyse Puffer mit 6 µL β-Mercaptoethanol (β-ME) für jede Probe. Betrachten Sie ein extra 20 % Volumen pro Probe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Probe
	<ol>
<li>Wenn Vollmilch eingefroren ist, lassen tauen Sie es auf Eis auf. Aliquoten 5 mL des ganzen Milch in einem 15 mL oder eine 5 mL steriles Röhrchen im BSC und halten sie auf dem Eis.</li>
		<li>Drehen Sie die 5 mL Milch aliquoten für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C, pellet-Zellen.</li>
		<li>Die Fettschicht zu entfernen, jetzt die oberste Schicht in der Röhre, mit einem Kunststoffspachtel oder große Bohrung Pipettenspitze.</li>
		<li>Ohne zu stören das Pellet, entfernen des Überstands mit Ausnahme von 100 µL.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets von resuspending in 1 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Bereiten Sie 1 negative Kontrolle durch Zugabe von 1 mL sterile PBS, eine 5-mL-Tube.</li>
		<li>Die Aussetzung auf eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und spin in einem Microcentrifuge für 1 min (5.000 x g bei Raumtemperatur (RT)).</li>
		<li>Verwenden Sie eine 1.000 µL steriler gefilterter Pipettenspitze um die gesamte Ebene überstand/Fettsäuren zu verwerfen.</li>
		<li>Wenn nicht extrahieren am selben Tag snap frieren die Zelle pellet-indem man es in einem Ethanol/trocken Eis Gülle und sofort auf die-80 ° C Gefrierschrank zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probe-Störung und Homogenisierung (Wulst-schlagen)
	<ol>
<li>Fügen Sie 600 µL Lyse Puffer mit β-ME zum Pellet und übertragen Sie die Aussetzung zu einem Wulst-Schlauch.</li>
		<li>Jede Charge der Extraktion von 12 enthält 10 Proben, 1 Negativkontrolle (vorbereitet in Schritt 3.7 oben) und 1 positiv-Kontrolle (im nächsten Schritt vorbereitet).<ol>
<li>Bereiten Sie 1 Positivkontrolle mit Lyse-Puffer und 20 µL der bakteriellen mock Probe (mock Gemeinschaft verwendet hat eine Konzentration, die einmal extrahiert, von ca. 0,2 ng/µL DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex alle bead Tubes energisch für 15 s.</li>
		<li>Erwärmen Sie Proben über temperaturgesteuerte Vortexer bei 37 ° C für 10 min, mit Schütteln bei 700-800 u/min.</li>
		<li>Laden Sie Rohre in das automatisierte Sample Disruptor Adapterset.</li>
		<li>Wulst schlagen für 1 min bei 30 Hz.</li>
		<li>Zerlegen Sie das Adapter-Set und manuell wechseln des Adapters set mit die Musterplatten aus der linken Roboterarm, der rechts Roboterarm des Instruments.</li>
		<li>Wulst schlagen für ein weiteres 1 min bei 30 Hz.</li>
		<li>Zentrifuge Röhren 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie alle der Überstand mit einer 200 µL Pipette, wobei Sie darauf achten, nicht um eine der fetthaltigen Schicht an der Spitze der Probe oder die Perle Rückstände an der Unterseite der Probe, und gelten für eine Spalte Homogenisator.</li>
		<li>Zentrifuge Homogenisator Spalten mit maximaler Geschwindigkeit, 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie 350 µL Eluat auf ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch für den Einsatz mit dem automatisierten Instrument zur Reinigung von DNA und RNA (verwenden Sie nicht anderen Röhre). Achten Sie darauf, dass Sie keine verbleibende Fettschicht zu übertragen.</li>
		<li>Bei der Durchströmung Größe von weniger als 350 µL fügen Sie Lyse Puffer mit β-ME zu einem Endvolumen von 350 µL hinzu.</li>
		<li>Lassen Sie die Proben an RT für bis zu 2 Stunden bevor Sie fortfahren Nukleinsäure-Isolierung mit dem automatisierten DNA-Reinigung-Instrument oder Einfrieren bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reinigung Arbeitsbereich
	<ol>
<li>Sauber alle Oberflächen in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 min, dann sprühen Sie mit 70 % Ethanol und wischen Sie die Oberfläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) isolieren Sie DNA/RNA
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Schalten Sie den Heizblock und stellen Sie die Temperatur auf 70 ° C.</li>
		<li>Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.</li>
		<li>Wärmen Sie die Elution Puffer (EB) mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in einem 50-mL-Röhrchen bis 70 ° C.</li>
		<li>Wärmen Sie 350 µL eingefrorene Samenprobe Lysates in 2 mL Röhrchen bei 37 ° C, bis Sie vollständig aufgetaut ohne jede Niederschlag (ca. 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA-Reinigung
	<ol>
<li>Wirbel und Zentrifuge der 2-mL-Röhrchen mit kurz Probe (3000 X g für 10 s).</li>
		<li>Legen Sie 2 mL Röhrchen in den Shaker nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gemäß den Herstellerangaben.</li>
		<li>Bekommen Sie die Rotor-Adapter und richten Sie diese auf dem Tablett, basierend auf der Anzahl der Proben.</li>
		<li>Beschriften Sie jeden Rotor Adapter anhand des Beispiels Identifikation (ID).</li>
		<li>Schneiden Sie den Deckel und glätten Sie die Kanten der einzelnen Spin Spalten für DNA und RNA.</li>
		<li>Fügen Sie die DNA Spin Spalte ohne das Sammelröhrchen in den Rotor-Adapter. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen.</li>
		<li>Label 1,5 mL Röhrchen und Rotor-Adapter stecken.</li>
		<li>Rotor-Adapter in die Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.</li>
		<li>Tipp-Racks stecken Sie des Herstellers 1.000 µL Filterspitzen.</li>
		<li>Ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch basierend auf der Anzahl der Proben (je spezifischen Maschinenanweisungen Protokoll) fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu.</li>
		<li>Stecken Sie das Rohr in Rohr-Steckplatz "A" Microcentrifuge Schlauch Slots.</li>
		<li>Entsorgen Sie Reagenz, das in Flaschen Reagenz und füllen mit einem Mindestvolumen von 10 mL übrig bleibt.</li>
		<li>Das Reagenz Flaschenregal (außer EB Flasche) stecken Sie Reagenz Flaschen.</li>
		<li>Die Position der Reagenz Flasche 6 warme EB aus der 50-mL-Tube hinzufügen.</li>
		<li>Check-1,5 mL-Tuben sind eng in die Rotor-Adapter platziert.</li>
		<li>Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Extraktion Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Kit Name 350 µL Teil A Custom DNA" → Elution Lautstärke 100 µL (Standard) oder 50 µL für niedrigen Biomasse Proben → bearbeiten "Start."</li>
		<li>Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf dem Tablett.</li>
		<li>Entsorgen Sie die DNA Spin Spalte von Rotorposition Adapter 3.</li>
		<li>Rotor-Adapter nicht wegwerfen, RNA ist in der Position 2.</li>
		<li>1,5 mL Röhrchen mit eluierten DNA an Position 3 zu entfernen und speichern in −20 ° C.</li>
		<li>Sammeln Sie Probe-haltige Rohre im Shaker und Store in −20 ° C, wenn jede Probe, sonst verwerfen übrig ist.</li>
		<li>Fahren Sie mit dem Protokoll "Kit Name 350 µL Teil B RNA" für die weitere Reinigung der RNA.</li>
		<li>RNA-Reinigung erfolgt von der rund 350 µL durchströmten, die in der mittleren Position des Rotors Adapter ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA-Reinigung
	<ol>
<li>Fügen Sie die RNA Spin Spalte ohne seine Sammelröhrchen und Deckel in den Rotor-Adapter.</li>
		<li>Beschriften Sie neue 1,5 mL Röhrchen und in Rotor-Adapter setzen Sie ein, wie im Handbuch angegeben.</li>
		<li>Die Rotor-Adapter in der Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.</li>
		<li>Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Des Herstellers Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Standard Teil B RNA" → "Start."</li>
		<li>Nach Fertigstellung, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge zu und legen Sie sie auf dem Tablett.</li>
		<li>RNA-Spin-Spalte von Position 3 zu verwerfen.</li>
		<li>1,5 mL Röhrchen mit 30 µL eluiert RNA an Position 3 zu entfernen und Lagern bei −80 ° C.</li>
		<li>Reagenz-Flaschen zu entfernen.</li>
		<li>Rotor-Adapter Inhalt durch entsprechende Sondermüll Kanäle entsorgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sauberen Arbeitsplatz
	<ol>
<li>Spray alle automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments Zubehör wie Reagenz Racks, Tablett und einer anderen Oberfläche in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 Minuten und Spülen mit entionisiertem Wasser (DI), dann trocknen lassen.</li>
		<li>Spray die automatisierten Instrument mit nur Hersteller genehmigt nicht-enzymatische Dekontaminationslösung, wischen Sie die Innenseite der Zentrifuge zusammen mit allen Oberflächen lassen für 10 min und wischen Sie dann mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie andere Arten von Dekontamination Lösungen nicht, da diese das Gerät beschädigen können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gezielte 16 s PCR Setup
Hinweis: Das Setup für die 16 s-PCR wird in einem dafür vorgesehenen Vorverstärkung Arbeitsbereich befindet sich innerhalb der Reinraum durchgeführt. Die Reagenzien und Proben sind vorbereitet und dann auf einen flüssigen Handler durchführen die PCR für jede Probe in dreifacher Ausfertigung (30 Proben, darunter wahre Proben und Extraktion positive und negative Kontrollen, plus 2 PCR Wasser steuert in dreifacher Ausführung, für eine Gesamtmenge von 96 verladen kombinierten Proben und Kontrollen). Sobald die PCR-Reaktionen montiert und abgedichtet sind, ist ein Thermocycler befindet sich in einer Post-Verstärkung-Gebiet zum Radfahren Probenteller übertragen.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die PCR-Workstation. Spray, die alle Oberflächen mit einer RNase, DNase, DNA Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.</li>
		<li>Vorbereiten der 16 s-PCR-Arbeitsblatt (siehe gezielte 16 s PCR Arbeitsblatt) eine genaue Liste und weisen unterschiedliche Barcodes Primer an jede Probe-9. Drucken Sie das Arbeitsblatt und die Platte Karten (siehe Plate 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-master-Mix-Vorbereitung Hinweis: 16 s Grundierung Auswahl basiert auf der Region von Interesse für die Studie und kann durch Studium oder Probe-Typ ändern. Daher vor der Bestellung Primer, ist es wichtig, welchem Bereich der 16 s rRNA beste verstärkt die Mikroben von Interesse für die Studie zu bestätigen. Dieses Protokoll wie geschrieben ist für die Verstärkung der 16 s V4 Region. Verschiedenes Grundierungen/Region ausgewählt sind, kann die Anlasstemperatur in die Temperaturzyklen Anpassung verlangen.<ol>
<li>Arbeiten Sie in der PCR-Arbeitsstation, um alles vorzubereiten.</li>
		<li>Nehmen Sie 50-100 µL DNA-Proben von-20 ° C und alle benötigten Reagenzien und tauen sie auf Eis. Wirbel und kurz spin-down.</li>
		<li>Die Primer werden vorab zur Arbeit Konzentration von 5 µM in ein Mindestvolumen von 20 µL verdünnt.</li>
		<li>Bereiten Sie die PCR-master-Mix in der spezifischen 5 mL Tube mit nur die forward Primer nach der Berechnung auf dem Arbeitsblatt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Roboter liquiden Handlers für automatisierte PCR setup
	<ol>
<li>Für Proben ein 32-gut Instrument Probe Adapter herausnehmen, und 50-100 µL DNA-Proben nach der 96-Well-Platte-Karte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu laden.<ol>
<li>Für jede PCR-Platte 2 Negativkontrollen indem man 30 µL des PCR-Wasser in einem sauberen Probenröhrchen eingerichtet.</li>
			<li>Legen Sie alle Proben auf das 32-gut Instrument Probe Adapter mit Kappen verschlossen in Offenstellung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für reverse Primer9<ol>
<li>Entfernen Sie die Kappe von jedem rückwärts-Primer mit bestimmten Barcode # es eins zu einem Zeitpunkt (Handschuhe wechseln dazwischen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden).</li>
			<li>Legen Sie maximal 32 Primer auf das Instrument Reagenz Adapter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nehmen Sie eine 96-Well-PCR-Platte und beschriften Sie sie mit Studiennamen, Probennummer, Datum und Initialen des Technikers.</li>
		<li>Laden den Roboter liquiden handler<ol>
<li>Setzen Sie den Reagenz-Adapter auf B1. Um einen Effekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und langsam die andere Kante herab. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.</li>
			<li>Setzen Sie die Probe-Adapter in Position C1. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.</li>
			<li>Wirbel der 5-mL-master-Mix, öffnen Sie die Kappe, und legen Sie sie in Position A auf das Instrument master Mix und Reagenz Block.</li>
			<li>Legen Sie die PCR-Platte auf der 96-Well-Instrument-Adapter, der halb skirted PCR-Platten halten soll.</li>
			<li>Den Durchlauf starten und als neue Datei speichern.</li>
			<li>Folgen Sie den Anweisungen und Häkchen jeder Eingabeaufforderung: einerseits Tipps gibt es, zwei, Abfallbehälter ist verfügbar, und drei, starten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach der abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, es gab keine Fehler durch die Überprüfung der Maschine für Fehlermeldungen.</li>
		<li>Dichtplatte mit den 12 oder 8 Streifen Kappen, Strudel kräftig, spin-down für 1 min mit einem 96-Well-Platte-Spinner und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank stellen.</li>
		<li>Röhrchen mit reverse Primer und Proben zu entfernen.</li>
		<li>Nehmen Sie die 96-Well-Platte um den Post-Verstärkung-Raum und laden Sie die Platte auf den Thermocycler und Zyklus entsprechend der Tabelle des thermischen Radfahren Bedingungen (siehe Tabelle 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gezielte 16 s Post-PCR-Qualitätskontrolle mit Band-basierte Plattform für Gelelektrophorese
Hinweis: Post-PCR-Qualitätskontrolle (QC) und alle weiteren Schritte werden in einem bestimmten Bereich der Post-Verstärkung des Labors durchgeführt. Die DNA wird in einen automatisierten DNA/RNA Fragment Analyzer analysiert.
<ol><li>
Bereich Arbeitsvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die Arbeitsstation durch Spritzen, die alle Oberflächen mit RNase, DNase, DNA-Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.</li>
		<li>Sammeln Sie alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände benötigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Reagenzien
	<ol>
<li>Der temperaturgesteuerten Vortexer bei 25 ° C für mindestens 30 min entgegenbringen Sie Probenpuffer und Leiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während die Reagenzien Aufwärmen, bereiten Sie PCR Proben vor, durch die Bündelung der 3 PCR-Wiederholungen für jede Probe in ein einzelnes Rohr</li>
	<li>Proben am Instrument zu laden.</li>
	<li>Kurz Wirbel und Spin-down Rohre mit gepoolten PCR-Produkt.</li>
	<li>Platzieren Sie das Instrument 96-Well-Platte auf eine Zahnstange bei RT und beschriften Sie sie.</li>
	<li>Kurz nach unten Wirbel und Spin Probenpuffer und Leiter.</li>
	<li>Geben Sie 3 µL Probenpuffer in jedes der 96-well-Platte (Notwendigkeit mindestens 53 µL/Bildschirm Klebeband).</li>
	<li>Führen Sie eine gerade Anzahl von Proben; besteht eine ungerade Anzahl von Proben, geben Sie 4 µL Probenpuffer in eine leere.</li>
	<li>Hinzu kommt 1 µL Leiter Anlegeleiter gut.</li>
	<li>Nach der Karte hinzufügen 1 µL der gepoolten PCR-Produkt seiner ausgewiesenen gut.</li>
	<li>Abdeckplatte mit Folienversiegelung</li>
	<li>Wirbel der Platte mit des Instruments Vortexer und Adapter bei 2.000 u/min für 1 min.</li>
	<li>Drehen Sie wieder nach unten in Position, die die Probe an der Unterseite des Rohres, wenn es gibt Spin down sprudelt.</li>
	<li>Starten Sie die Software.</li>
	<li>Laden Sie Bildschirmtipps Band und laden in das Gerät.</li>
	<li>Proben in den Fragment-Analysator mit einem 96-Well-Adapter zu laden.</li>
	<li>Richten Sie ein mit der Controller-Software laufen.</li>
	<li>Achten Sie darauf, wählen geradzahligen Brunnen.</li>
	<li>Beispiel-IDs zu schreiben.</li>
	<li>Überprüfen Sie, dass die Brunnen des Bandes Bildschirm grau hervorgehoben werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Analyzer erkennt die Pipettenspitzen.</li>
	<li>Wählen Sie Start, und geben Sie einen Dateinamen, um die Ergebnisse zu speichern (Studie Probennummern, Name und Datum).</li>
	<li>Beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers für weitere Details.</li>
	<li>Nachdem das abgeschlossen ist, entsorgen Sie Tipp, Bildschirm Klebeband und Röhren.</li>
	<li>Analysieren von Daten für 16 s Peak nM (zwischen 315-450 bp für V4). Dieser Gipfel variieren je nach dem Primer ausgewählt.</li>
</ol>5. Bibliothek Berechnung, Pooling, Clean-Up, und QC
<ol><li>Nach der Bestimmung der Größe der Amplifikate und Molarity aller Proben, bündeln die Bibliotheken zur Erreichung der gewünschten Endvolumen und nM für die gepoolten Bibliothek (siehe Beispielrechnung).</li>
	<li>Clean-Up und Konzentrat die gepoolte Bibliothek mit einer Silica-Membran-basierten Läuterung kit für PCR-Produkte nach Angaben des Herstellers Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Eluieren Sie die DNA mit einem Endvolumen von 50 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie die Konzentration der gereinigten Bibliothek sofort mit den doppelten gestrandeten DNA-hohe Empfindlichkeit Kit für ein Fluorometer laut Protokoll des Herstellers.<ol>
<li>Verdünnen Sie 2 µL der gebündelt und gereinigte Bibliothek mit 198 µL des Verdünnungspuffer plus Farbstoff (1: 100 Verdünnung).</li>
		<li>Nehmen Sie den gemessenen Wert vom fluorometrisch Gerät und nach den Verdünnungsfaktor zu konvertieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit der Konzentration (ng/µL) für die gepoolten Bibliothek lesen, berechnen Sie die Bibliothek Molarity in nM. Verwenden Sie 1 µL unverdünnte Bibliothek der OD260/280 auf einem Microvolume Spektralphotometer messen. Hinweis: Der Wert von 1,8-2,0 gibt ausreichende Reinheit der Bibliothek.</li>
	<li>Speichern Sie die endgültige Bibliothek bei-20 ° C bis bereit für die nächste Generation-Sequenzierung.</li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu er...

Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,4. Diese investigativen Bemühungen ist die rasche Entstehung und erhöhte Zugänglichkeit der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien, die eine massiv parallele Plattform zur Analyse der mikrobiellen genetischen Inhalte (Mikrobiom) einer Probe. Für viele physiologische Proben, die damit verbundenen Microbiome ist komplex und reichlich (d.h., Hocker), aber für einige Proben ist das Mikrobiom durch geringe mikrobielle Biomasse (d.h., Muttermilch und unteren Atemwege) vertreten, wo Empfindlichkeit, experimentellen Artefakte und mögliche Verunreinigungen werden wichtige Themen. Die gemeinsamen Herausforderungen der Microbiome Studien und geeignete Versuchsanordnung wurden mehrere Review Artikel5,6,7,8.
Enthaltenen basiert eine robuste NGS experimentelle Pipeline auf gezielte Sequenzierung der rRNA 16 s V4 Region9 Mikrobiom der Muttermilch zu charakterisieren. Microbiome Analyse der menschlichen Milch ist kompliziert, nicht nur durch eine von Natur aus geringe mikrobielle Biomasse-10, sondern zusätzlich durch hohe Niveaus der menschlichen DNA Hintergrund11,12,13,14 und mögliche Übertragung von PCR-Inhibitoren15,16 in extrahierten Nukleinsäuren. Dieses Protokoll setzt auf handelsübliche Extraktion Kits und semi-automatischen Plattformen, die helfen können Variabilität auf Probe Vorbereitung Chargen zu minimieren. Es enthält eine wohldefinierte mock Bakteriengemeinschaft, die neben Proben verarbeitet wird, als eine Qualitätskontrolle überprüfen jeden Schritt im Protokoll und bieten eine unabhängige Metrik der Pipeline Robustheit. Obwohl das Protokoll als beschrieben für die Muttermilch Proben handelt, es ist leicht anpassbar an andere Probentypen wie Hocker, rektale und vaginale, Haut, areolar und mündliche Tupfer10,17, und dient als Ausgangspunkt für Forscher, die Microbiome Analysen durchführen möchten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">80204</td>
			<td style="width:395px;">DNA/RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eliminase</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">435532</td>
			<td>RNase, DNase, DNA decontaminant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Thermo Mixer</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>temperature-controlled vortexer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Buffer RLT plus</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>1053393</td>
			<td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#223;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td>&#223;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LME Beads</td>
			<td style="width:115px;">MP Biomedicals</td>
			<td>116914050</td>
			<td>bead tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen TissueLyzer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>automated sample disruptor adapter set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAshredder column</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>&#160;79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen RB tube</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
			<td>manufacturer&#39;s microcentrifuge tube in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAcube and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001292</td>
			<td>automated DNA/RNA purification instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">DNA exitus plus</td>
			<td style="width:115px;">Applichem</td>
			<td>A7089</td>
			<td>non-enzymatic decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">EB Buffer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">19086</td>
			<td>elution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAgility and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001532</td>
			<td>robotic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR water</td>
			<td style="width:115px;">MO BIO</td>
			<td>17000-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5PRIME HotMasterMix</td>
			<td style="width:115px;">Quantabio</td>
			<td>2200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Barcoded reverse primers</td>
			<td style="width:115px;">Eurofin</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>designed and ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">&#160;96 well PCR plate</td>
			<td style="width:115px;">USA scientific</td>
			<td style="width:153px;">1402-9708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tapestation 2200 and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D1000 reagents for Tapestation&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneStep PCR Inhibitor Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:153px;">50444470</td>
			<td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">28104</td>
			<td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;">Q32854</td>
			<td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq 300 V2 kit</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td>15033624/15033626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>next generation sequencer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.

Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-45...

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A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Aufrufe.  University of California at Los Angeles. Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Serie: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most biological materials do not contain dense elements capable of scattering electrons to create an image; therefore, a negative stain, which places dense heavy metal salts around the sample, is required. In order to visualize viruses in suspension under the TEM they must be applied to small grids coated with a transparent surface only nanometers thick. Due to their small size and fragility, these grids are difficult to handle and easily moved by air currents. The thin surface is easily damaged, leaving the sample difficult or impossible to image. Infectious viruses must be handled in a biosafety cabinet (BSC) and some require a biocontainment laboratory environment. Staining viruses in biosafety levels (BSL)-3 and -4 is especially challenging because these environments are more turbulent and technicians are required to wear personal protective equipment (PPE), which decreases dexterity. 
In this study, we evaluated a new device to assist in negative staining viruses in biocontainment. The device is a capsule that works as a specialized pipette tip. Once grids are loaded into the capsule, the user simply aspirates reagents into the capsule to deliver the virus and stains to the encapsulated grid, thus eliminating user handling of grids. Although this technique was designed specifically for use in BSL-3 or -4 biocontainment, it can ease sample preparation in any lab environment by enabling easy negative staining of virus. This same method can also be applied to prepare negative stained TEM specimens of nanoparticles, macromolecules and similar specimens.

This protocol provides instruction for negative staining virus samples which can easily be used in BSL-2, -3, or -4 laboratories. It includes the use of an innovative processing capsule, which protects the transmission electron microscopy grid and provides the user easier handling in the more turbulent environments within biocontainment.

Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...