Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Grow Iowa Werte Fund Award an BFBS zur Verfügung gestellt.

1. Oberflächenproben mit Sterile Klebeband <ol><li> Wählen Sie ein Band für die Probenahme zu verwenden. Die im Handel erhältlichen Fungi-Tape oder Con-Tact-It Probenahme Bänder sind steril und speziell verpackte für Benutzerfreundlichkeit. Allerdings haben wir festgestellt, dass transparent (optisch klar) generische Büro Band kann ebenfalls verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie einen Permanent-Marker auf 1 cm 2 Plätze auf der nicht-klebrige Seite eines 10 cm Stück Klebeband (ein Papier-Vorlage verwendet werden kann) zu zeichnen. Dies wird als visuelle Hilfe für die Feststellung, welcher Teil des Bandes verwendet wurde, um die Lebensmittel-oder Umweltproben Oberfläche Probe dienen. </li><li> Form eines &quot;C&quot;-förmigen Schleife der Band, mit der klebrigen Seite nach der Fläche in die Stichprobe. Um dies zu tun, halten Sie die klebrigen Enden mit dem Daumen und Mittelfinger und die Position der Zeigefinger gegen die gezogenen Quadrat auf der Rückseite (nicht-klebrige Seite) des Bandes (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie das Band auf der Oberfläche abgetastet und drücken Sie vorsichtig den markierten Bereich an die Oberfläche. Ohne die Freigabe der Ränder des Bandes, verwenden Sie den Zeigefinger, um sicherzustellen, dass die Klebeseite des Bandes in vollem Kontakt mit der Probenoberfläche kommt, blasenfrei. </li><li> Mit einer gleichmäßigen Bewegung, ziehen Sie das Band von der Probe entfernt, körperlich Extrahieren Oberflächen-gebundenen Mikroben. Befestigen Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Glasobjektträger mit generischen transparent Büro Band. Stellen Sie sicher, die richtige Spannung / Dehnung des Bandes, so dass eine ebene, nicht faltig Oberfläche entsteht. Dies wird dazu beitragen minimieren Probleme mit Deformation / Eisstock des Bandes bei der anschließenden Erwärmung während der Hybridisierung. </li></ol> 2. Solid-Phase-Enrichment und Flüssigkeitsoberfläche Miniculture <ol><li> Solid-Phase-Anreicherung ist, indem das Band der Vorderseite nach unten auf Xylose-Lysin-Tergitol 4 (XLT-4)-Agar-Platten, so dass die Proben-Zellen in direktem Kontakt mit der Agar-Oberfläche platziert werden durchgeführt. Die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes ist bündig mit der Agar-Oberfläche und ein Ende des Bandes lose an der Seitenwand der Petrischale geklebt um ein leichtes Entfernen des Bandes aus der Agar-Oberfläche folgende Bereicherung zu erleichtern. </li><li> Die Platten werden invertiert (um Kondensation zu vermeiden) resuspendiert und bei 35 bis 37 ° C, um eine ausreichende Wachstum von Salmonella spp ermöglichen. Die Länge der Inkubationszeit benötigt, um die Zellen auf ein nachweisbares Niveau bereichern wird bei der erstmaligen Kontamination mit Salmonellen abhängen. Wir haben ausgezeichnete Mikrokoloniebildung aus niedrigen anfänglichen Inokula beobachtet nach 8 h Anreicherung. </li><li> Nachdem die gewünschte Anreicherung Zeitraum, öffnen Sie die Agar-Platte. Das Band wird seine Klebrigkeit während der Inkubation zu behalten. Drücken Sie das Band vor dem Agar mit dem Zeigefinger, um die Rückforderung von Mikrokolonien auf der Band-Agar-Schnittstelle gebildet zu gewährleisten. Fassen Sie das Klebeband von der Kante an der Wand der Petrischale und entfernen Sie sie mit einem langsamen, gleichmäßigen Bewegung. Montieren Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 beschrieben. Fahren Sie mit &quot;Fixation und Dehydration&quot; step unten. </li><li> Für flüssige Oberfläche miniculture, durch die Befestigung des Bandes für die Probenahme auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 oben beschrieben, verwendet beginnen. Dann bedecken Sie die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes mit einer nicht sterilen Silikon Perfusionskammer (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), bilden eine geschlossene Kammer, deren Boden der Zelle geladenen Band besteht, nach oben. Fest, aber sanft drücken Sie die Kammer in Ort, um eine wasserdichte Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Mit einem flexiblen Gelbeladung Pipettenspitze, Transfer ≤ 500 ul Trypticase Soy Broth oder einem anderen geeigneten Anreicherungsmedium durch eine der Kammer ist klein Einlasskanäle. Seal beide Ports mit transparenten Büro-Band, um Verdunstung und inkubieren bei 35 -37 ° C zu verhindern, wie für eine ausreichende Anreicherung erforderlich. Obwohl alle Operationen nach guter Probenahme und Handhabung Praktiken durchgeführt werden sollte, ist die Sterilität von Port-Dichtband oder Perfusionskammern nicht während der Flüssigkeitsoberfläche miniculture erforderlich. Die Kombination von FISH und Durchflusszytometrie ermöglicht eine klare Diskriminierung von Salmonella spp. von Nicht-Ziel-Bakterien, die vorhanden sein, wobei der größte Anteil der Nicht-Ziel-Flora erwartet von der Probe selbst kommen können. Fahren Sie mit &quot;Fixation und Dehydration&quot; step unten. </li></ol> 3. Fixation und Dehydration <ol><li> Für die direkte Entnahme von Oberflächenproben oder für feste Phase Anreicherung von Salmonella spp. auf XLT-4-Agar, führen on-tape Zellfixierung für 30 min bei 25 ° C durch das Abdecken der Probe Kontaktfläche mit 500 ul 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Discard Fixativ in einem verschließbaren Behälter (unter einer chemischen Haube um die Exposition gegenüber irritierenden / giftige Dämpfe zu minimieren). </li><li> Entwässern in einem Ethanol-Reihe (50%, 80% und 95%, 300 ul / 3 min jeder Konzentration). Fahren Sie mit &quot;Hybridisierung&quot; step unten. </li><li> Zur Fixierung von 500 ul Flüssigkeitsoberfläche miniculture Probes sind Perfusionskammern entsiegelt worden sind, und eine flexible Gel-loading Pipettenspitze wird verwendet, um die enrichate extrahieren. Schnelle rauf und runter Pipettieren verwendet wird, um sicherzustellen, effektive Entfernung der übrigen Band-gebundenen Zellen. </li><li> Anschließend wird die gesamte 500 ul miniculture Lautstärke auf ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und abzentrifugiert bei 2.000 xg (5 min). Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30-60 s gevortext, dann in ein gleiches Volumen 10% resuspendiert neutral gepuffertem Formalin. Die Zellen werden für 30 min bei 25 ° C fixiert </li><li> Als nächstes Fixativ entfernt und die Probe wird in Zelle Speicher-Puffer, wie folgt. 60 s, die in einem gleichen Volumen von 50% nicht-denaturiertem Ethanol-50% resuspendiert Phosphat-- Die Probe wird bei 2.000 xg (5 min, 25 ° C) den Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30 gevortext gesponnen Kochsalzlösung. Fixierten Zellen können unbegrenzt gelagert werden (in Jahren) bei -20 ° C. Hinweis: Wenn Flüssigkeiten verändert werden (zum Beispiel bei der Einführung eines Fixativ oder verschiedene Puffer), ist es wichtig, gründlich resuspendieren (mit Vortex) das Zellpellet in einem minimalen Anteil (~ 10 bis 20 ul) des &quot;outgoing&quot; flüssigen Systems . Dadurch wird verhindert, Verklumpung und sicherzustellen, dass auch Suspensionen von einzelnen Zellen erhalten werden. Fahren Sie mit &quot;Hybridisierung&quot; step unten. </li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Hybridisierung / Waschpuffer mit der kommerziellen Molekularbiologie-Grade-Lösungen hingewiesen in Werkstoff-Tabelle. Finale Pufferkomponente Konzentrationen sind 0,7 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% Natriumdodecylsulfat, machte bis zur endgültigen gewünschte Lautstärke mit molekular-Grad Wasser und unter Verwendung einer 0,22 um Spritze oder eine Tasse Filter. Die gleichen Puffer, ohne den Zusatz von Sonden (siehe unten) wird als Waschpuffer verwendet. Vorheizen Hybridisierung und Waschpuffer bis 55 ° C. </li><li> Add fluoreszenzmarkierten Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5&#39;-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 &#39;) und Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3&#39; ) Oligonukleotid-Sonden (Werkstoff-Tabelle) vorgeheizt Hybridisierungspuffer. Insgesamt Sonde Konzentration von 5 ng ul -1 verwendet (z. B. 2,5 ng ul -1 jede Sonde; Bisha und Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Für Direct-to-Tape-und Festphase Bereicherung Proben, überlagern die Vorlagen Probe Kontaktfläche des Bandes mit 300 ul Hybridisierungspuffer mit der Sonde Cocktail und hybridisieren Band-gebundenen Zellen in einer feuchten, verschlossenen Inkubationskammer Satz bis 55 ° C. Wenn eine direkte Kontakt-Inkubator wie der Slide Moat Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden die Proben für 15 min hybridisiert und&gt; 20 Objektträger können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn ein Dreh-style Hybridisierungsofen wie der Bambino-Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden Folien in 50 mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für die Hybridisierung, eine Folie pro Röhrchen gegeben. Da die Wärmeübertragung nicht direkt, werden diese Proben über einen längeren Zeitraum (bis zu 30 min) hybridisiert. </li><li> Nach der Hybridisierung werden die Objektträger entfernt und die Sonde-haltigen Hybridisierungspuffer Overlay wird verworfen. Folien werden dann entweder kurz und sanft mit vorgewärmten Waschpuffer durch Pipettieren einem kleinen Volumen Puffer über eine geneigte Rutsche (3 Spülungen von 300 ul jeweils) gespült, oder formal gewaschen (bis zu 30 min) mit entweder einer Überlagerung von vorgewärmtem Waschpuffer oder Eintauchen in eine 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten Waschpuffer. Nach unserer Erfahrung ist, obwohl eine formelle waschen verbesserten Ergebnissen (weniger Dunst von ungebundenen Sonde) bieten wird, spülen Sie einfach ausreichend für eindeutige Nachweis von Salmonella spp. Anschließend werden Dias an der Luft getrocknet, bevor er nach der &quot;Detection&quot; Schritt unten. </li><li> Die Hybridisierung der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben wird durch Abzentrifugieren Proben (frisch fixiert oder auf Lager gehalten Puffer bei -20 ° C) für 5 min bei 2.000 xg durchgeführt, gefolgt von kräftigem Vortexen des Pellets und Resuspendierung in 100 ul vorgewärmte Hybridisierungspuffer mit die Sonde Cocktail. Die Proben werden bei 55 hybridisiert ° C für 30 min auf einem Heizblock oder einem anderen geeigneten Inkubationszeit Bahnhof (Werkstoff-Tabelle), durch Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer folgte. Wie bei Band-gebundenen Proben, können diese Proben formal gewaschen werden bis zu 30 min mit weiteren Inkubation bei 55 ° C in diesem Waschpuffer mit Intervallschaltung Vortexen. Alternativ können die Proben gründlich nach Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer verwirbelt werden, gefolgt von sofortiger Ernte für die Analyse (unten). </li><li> In Vorbereitung für den Nachweis von Salmonella spp. über Durchflusszytometrie, Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben bis auf 2.000 xg für 5 min gesponnen werden, der Überstand wird verworfen und die Proben werden in 300 ul Raumtemperatur resuspendiert (~ 25 ° C) PBS. Wenn Proben Transport benötigen, um eine entfernte Anlage, oder wenn eine Verzögerung zwischen Hybridisierung und Analyse zu erwarten ist, können die Proben im Kühlschrank gelagert werden oder statt auf dem Eis vor anaLyse. Alternativ können die Proben zu Zelle Pufferspeicher (50:50-Mischung aus PBS und absolutem Ethanol) übertragen werden und hielt bei -20 ° C bis zu einer Woche ohne nennenswerte Verluste in Sonde-verliehenen Fluoreszenz (Bisha und Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Erkennung <ol><li> Für on-tape Nachweis von Salmonella spp. via Fluoreszenzmikroskopie werden direct-to-Tape oder fester Phase Bereicherung Proben mit ~ 10 ul Vectashield H-1200 Montage-Medium mit den nuklearen Gegenfärbung 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI), mit einem Deckglas montiert überlagert, dann im Dunkeln für 10 min inkubiert. </li><li> Immersionsöl auf das Deckglas gelegt, und die Proben werden unter Verwendung eines High-Vergrößerung Öl-Objektiv (63x oder 100x). Die DAPI-Filter verwendet wird, um die Probe in den Fokus zu bringen, das Mikroskop wird dann an den entsprechenden Filter (grün oder rot, je nach dem verwendeten Farbstoff zu Ende-Label der Sonden) und Salmonella-Zellen abgeschaltet werden visuell nach ihrer Fluoreszenz (erzielte Fakten 2 und 3). </li><li> Für durchflusszytometrischen Nachweis der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben können verschiedene Instrumente verwendet, je nach lokaler Verfügbarkeit werden. In unserem Labor sind PBS suspendiert Proben zu 5 ml Rundboden Probenahme-Röhrchen (BD Falcon) überführt und unter Verwendung eines FACSCanto Durchflusszytometer mit einer Anregung bei 647 nm (Werkstoff-Tabelle). Für angereicherten Proben mit hohen Zahl von insgesamt Bakterien, ist die &quot;Low-Flow-Rate&quot;-Einstellung (10 l min -1) verwendet und 5.000-50.000 Ereignisse gesammelt werden. Daten werden mit Hilfe FlowJo Software (Version 8.8.6, Baum Star, Inc., Ashland, OR) oder andere geeignete Analyse-Software (Abbildung 4, Platten A und B). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von Salmonella spp. von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Typische Ergebnisse für direct-to-Tape-Probenahme-und FISH Detektion von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 von der Oberfläche der Tomaten (100 X Öl-Objektiv). Ein Zwei-Sonde Cocktail aus Texas Red-markierten Sonden (Sal3/Salm-63) wurde verwendet, zur Kennzeichnung dieser Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Mikrokolonien von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 auf der Oberfläche der Xylose-Lysin-Tergitol-4 (XLT-4)-Agar nach 8 h on-tape Bereicherung bei 37 ° C. Die anfängliche Inokulum von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten abgetastet wurde gebildet. Solid-Phase-Anreicherung steigt die Zahl der verfügbaren Zellen für die Detektion und verbessert auch die zelluläre rRNA Inhalt. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von S. enterica Serovar Typhimurium von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten, durch direkte Analyse über FISH und Durchflusszytometrie (Panel A) oder nach 5 h nicht-selektiven Flüssigkeitsoberfläche miniculture Bereicherung in einer Perfusionskammer mit 500 ul Trypticase Soy Broth (Panel B gefüllt, gefolgt ).

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces.">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li><li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+barley+(Hordeum+vulgare)+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp.">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li><li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips.">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li><li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations.">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li><li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves.">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li><li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

Einfache und schnelle Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern auf Oberflächen erzeugen kann zu einer Abschwächung Lebensmittelinfektionen durch rechtzeitige und verwertbare Daten. Klebeband-basierte Methoden zur Probenahme in Umwelt-, Klinik-und Lebensmittel-Mikrobiologie, seit den 1950er Jahren verwendet und beinhalten Drücken von &quot;Scotch&quot;-Stil Band auf Oberflächen zur Entfernung von Mikroorganismen, gefolgt von direkten mikroskopischen Untersuchung oder die Übertragung von anhaftenden Mikroorganism...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für Klebeband-basierte Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen, durch on-tape-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die schnelle Kultur-unabhängigen Nachweis von Salmonella spp. Cell-geladenen Bänder können auch verdeckt auf Selektivagar für Festphasen-Anreicherung gelegt werden, bevor die Erkennung. Alternativ kann mit geringem Volumen Flüssigkeit Anreicherungen (Flüssigkeitsoberfläche miniculture) auf der Oberfläche des Bandes in nicht-selektiven Brühe durch FISH und Analyse über die Durchflusszytometrie gefolgt durchgeführt werden. Um zu beginnen, sterile Klebeband ist in Kontakt mit frischen Produkten gebracht wird, wird sanfter Druck angewandt, und das Band entfernt wird, physisch Extrahieren Mikroben anwesend auf diesen Flächen. Tapes sind klebrig-Seite nach oben auf Objektträger aus Glas montiert und in der Stichprobe Zellen werden mit 10% igem Formalin (30 min) und entwässert mit einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 80 und 95%; 3 min jeder Konzentration) festgelegt. Als nächstes Zelle aufgeladen Bänder werden mit Puffer mit einem Salmonella-gezielte DNA-Sonde Cocktail gesichtet und hybridisiert für 15 bis 30 min bei 55 ° C, gefolgt von einer kurzen in einem Waschpuffer, um ungebundene Sonde zu entfernen spülen. Adhärente sind FISH-markierten Zellen werden dann mit den DNA-Farbstoff 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) gegengefärbt und die Ergebnisse betrachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für Festphasen-Anreicherung, sind Zell-geladenen Bänder Gesicht nach unten auf einen geeigneten selektiven Agar-Oberfläche gelegt und inkubiert, um in situ Wachstum von Salmonella Mikrokolonien durch FISH und Mikroskopie verfolgt, wie oben beschrieben zu ermöglichen. Für flüssige Oberfläche miniculture sind Zell-geladenen Bänder klebrigen Seite nach oben und ein Silikon Perfusionskammer angewendet wird, so dass das Band und Objektträger bilden den Boden einer wasserdichten Kammer, in die ein kleines Volumen (≤ 500 ul) von Trypticase Soy Broth (TSB) wird eingeführt. Die Einlassöffnungen sind versiegelt und die Kammern sind bei 35 inkubiert - 37 ° C, so dass das Wachstum-basierte Amplifikation von Tape-extrahierten Mikroben. Nach der Inkubation Einlasskanäle entsiegelt worden sind, Zellen abgelöst und unter kräftigem wieder gemischt und her Pipettieren geerntet durch Zentrifugation und in 10% neutral gepuffertem Formalin. Schließlich sind die Proben hybridisiert und untersucht per Durchflusszytometrie, um das Vorhandensein von Salmonella spp offenbaren. Wie hier beschrieben, können unsere &quot;Band-FISH&quot;-Ansatz bietet eine einfache und schnelle Probenahme und Nachweis von Salmonellen auf Tomaten Oberflächen. Wir haben auch diesen Ansatz für die Probenahme andere Arten von frischen Produkten, einschließlich Spinat und Chilischoten verwendet.

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce at JoVE.com

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt<em&gt; Salmonellen</em&gt; Mittels Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K Aufrufe.  Colorado State University. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt Salmonellen Mittels Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH).

Serie: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...