This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. Erzeugung von stabilen Zelllinien, die das Protein von Interesse <ol><li> Vorzubereiten Medien durch Zugabe hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin / Streptomycin, handelsübliche Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX-I, Pyruvat und 4,5 g / l D-Glucose. </li><li> Kulti HEK293 Zellen in Medien bei 37 ° C in 5% CO 2. Sub-Zellen zu kultivieren alle drei Tage. Entfernen Sie die Medien und Resuspendieren der Zellen in 15 ml frisches Medium. Pipette 1 ml in eine neue 75 cm 2 Zellkulturflasche und fügen Sie 14 ml Medien. </li><li> Analysieren Sie die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. </li><li> Seed HEK293-Zellen in einer 6-Well-Platte in einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 24 Stunden. </li><li> Für die Transfektion verwendet das Protokoll vom Hersteller des Transfektionsreagenz zur Verfügung gestellt. Transfektion von Zellen mit pEGFP-C2 oder pEGFP-C2-CAEB Verwendung des Transfektionsreagenz. Vor der Verwendung erwärmen die Transfektion REAGent und die auf RT erforderlichen Medien. Verwenden Sie einen 3: 1-Verhältnis von Transfektionsreagenz an DNA. <ol><li> Im einzelnen Pipette 1,5 ul Transfektionsreagenz direkt in 50 ul serumfreiem DMEM Medium. Für die Komplexbildung, Pipette 0,5 ug DNA mit Codierung für GFP oder GFP-CAEB zum Transfektionsreagenz enthaltende Mischung und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Transfektion von Zellen, die durch Zugabe der Reaktionsmischung in einem tropfenweisen Weise und bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Std. </li></ol></li><li> 1 mg / ml für die Selektion von GFP-positive Klone bei 37 ° C in 5% CO 2 Geneticin. </li><li> Nach 6 Tagen isolieren Einzelzellen durch Durchflusszytometrie Sortierung in einer 96-Well-Platte beherbergen Mediums und HEK293 Stand in einem 1: 1-Verhältnis. Erzeugen HEK293 Überstand aus konfluenten kultivierten HEK293 Zellen, die für 15 min bei 4.966 x g zentrifugiert. </li><li> Am folgenden Tag, ersetzen Kulturmedium mit Medium, das 1,50; mg / ml Geneticin. Ändern Medien einmal pro Woche. Wenn die Zellen eine konfluente Monoschicht, übertragen Sie sie auf einer 24-Well-Platte. Unterkulti Zellen zweimal die Woche in einem Verhältnis von 1: 5 in Medien, die 1,5 mg / ml Geneticin. Schließlich analysiert man den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen durch Immunoblot-Analyse und Durchflusszytometrie. </li></ol> 2. Analyse der stabilen Zelllinien durch Immunoblot-Analyse <ol><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C. </li><li> Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer. </li><li> Auslöschen Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Porengröße von 0.45 &amp; mgr; m) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle. </li><li> Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT. </li><li> Verdünnter 4 ul anti-GFP-Antikörper in 4 ml MPT und inkubieren Membranen O / N bei 4 ° C. </li><li> Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Membranen mit 0,8 &amp; mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper inkubieren in 4 ml MPT. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 2.6 beschrieben) und Meerrettich-Peroxidase-Aktivität zu detektieren mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen. </li></ol> 3. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. <ol><li> Die Zellen in PBS. Verwenden HEK293-Zellen als Negativkontrolle zu sc vorwärts einstellenAtter (FSC) und Seitenstreuung (SSC), so dass die Zellen auf der Skala. Zeichnen Sie ein Tor an lebenden Zellen durch den Ausschluss von Zell Dubletten, Zuschlagstoffe und Zelltrümmer. </li><li> Stellen Sie den Photomultiplier (PMT) Verstärkung, so dass die ungefärbten Zellen sind auf der anderen des Histogramms für die FL1-Kanal (488 nm Argonlaser) links. </li><li> Um die Fluoreszenzintensität von HEK293-GFP und HEK293-GFP-Zellen zu analysieren CAEB öffnen Sie das Histogramm des FL1-Kanal und zu erwerben 10.000 Events auf der gated Bevölkerung. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe von kommerziellen FACS-Analyse-Software. </li></ol> 4. Transfektion der stabilen Zelllinie mit dem induzierbaren Expressionsvektorsystem <ol><li> Samen HEK293-Zellen, die GFP oder GFP-CAEB in einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen / Vertiefung. </li><li> 19 Stunden nach der Aussaat, Co-Transfektion der Zellen mit Plasmid-Regler und Antwort Plasmid entweder kodiert Bax oder aktivierte Caspase-3. <ol><li> Co-Transfektion der stabilen HEK293-Zellenmit 100 ng pWHE125-P-Regler Plasmid (Figur 2) und 100 ng der Antwort Plasmide pWHE655-hBax oder pWHE655-revCasp3 (Abbildung 3) und 0,4 &amp; mgr; l Polyethylenimin. </li><li> Bereiten Sie die DNA und Polyethylenimin Transfektionsreagenz jedes in 75 &amp; mgr; l Opti-MEM-Medium und Inkubation für genau 5 min bei RT. Für die Komplexbildung, Inkubation sowohl Mischungen zusammen für 15 min bei RT. </li></ol></li><li> Füge das Polyethylenimin / DNA-Lösung tropfenweise zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 5. Induktion der Apoptose <ol><li> 5 h nach der Transfektion induziert die Expression der pro-apoptotische Proteine ​​durch Zugabe von 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin zum Kulturmedium. Inkubieren Zellen 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. Analyse der Wirtszell-Apoptose, die durch Immunblot-Analyse <ol><li> Untersuchen Zellen vor der hie Ernte unter dem Lichtmikroskop für Zelltodinduktion überprüfen. Apoptotische Zellen nachweisbaren durch die Anwesenheit von apoptotischen Körpern um die sterbende Zelle. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C. </li><li> Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer. </li><li> Blot Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Porengröße 0,45 um) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle. </li><li> Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT. </li><li> Verdünnter 4 μl anti-gespaltenen Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) Antikörper, der in 4 ml MPT und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Inkubieren Membranen mit 0,8 ul Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper in 4 ml MPT verdünnt. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), und erfassen Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen. </li><li> Entfernen gebundenen Antikörper durch 30 min Inkubation bei RT mit 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Nach drei Waschungen mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), zu sondieren, die Membranen mit 4 &amp; mgr; l anti-Aktin-Antikörper in 4 ml MPT O / N bei 4 ° C. </li><li> Nach drei Waschschritten mit MPT (wie in 6.7 beschrieben), Inkubation der Membranen mit 0,8 ul horseradish Peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper in 4 ml MPT verdünnt. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben, und detektieren Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Wenden Standard-Ausrüstung für die Filmentwicklung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Anmerkung: Alle Inkubationsschritte wurden auf einem Plattenschüttler für die angegebene Zeit und Temperatur durchgeführt. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Viele pathogene Bakterien beherbergen Sekretionssysteme zur Sekretion oder translozieren bakteriellen Effektorproteine ​​in die Wirtszelle. Diese Effektor-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Prozesse und Pfade in der Wirtszelle zu modulieren, so dass die Bakterien zu überleben und zu replizieren, innerhalb ihrer jeweiligen intrazelluläre Nische. Das Verständnis der biochemischen Aktivitäten und die molekularen Mechanismen der Effektor-Proteine ​​werden zu einem besseren Verständnis der Pathogenität zu hel...

Die Virulenz von vielen Gram-negative bakterielle Erreger hängt von spezialisierten Sekretionssysteme zu eukaryotischen Wirtszellen zu entführen. Bakterien nutzen diese Sekretionssysteme bakterieller Virulenzproteine ​​(Effektoren) in die Wirtszelle injiziert werden, um eine Vielzahl von zellulären und biochemischen Aktivitäten modulieren. Das Studium der Effektorproteine ​​nicht nur bemerkenswerten Einblick versehen, in grundlegende Aspekte der Wirt / Pathogen-Interaktionen als auch in die grundlegende Biologie von eukaryotischen Zellen 1. Modulation der Wirtszelle Apoptose wurde gezeigt, dass ein wichtiger Mechanismus für die Virulenz viele intrazelluläre Pathogene zu sein, und eine Anzahl von Effektor-Proteine ​​modulieren Apoptose identifiziert wurden 2-9. , Ihren genauen molekularen Mechanismen der Tätigkeit bleiben jedoch schwer in vielen Fällen. Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf eine Infektion 10. Zwei Hauptwege, die zu Apoptose habenidentifiziert: zur Förderung der Mitochondrien (intrinsische Apoptose) oder direkte Weiterleitung des Signals über den Zelltod-Rezeptoren an der Plasmamembran (extrinsische Apoptose). Die intrinsische oder Mitochondrien vermittelte Zelltod wird durch intrazelluläre Signale ausgelöst und beinhaltet die Aktivierung von Bax und Bak, zwei proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Diese Familie wird von pro- und anti-apoptotischen Regulatorproteine, die den Zelltod 11-14 steuern zusammen. Die Aktivierung der Apoptose führt zu Oligomerisierung von Bax und Bak, gefolgt von nachfolgenden Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran, was zu einer Freisetzung von Cytochrom c in das Zytoplasma. Freisetzung von Cytochrom c initiiert Aktivierung der Effektor-Caspasen 3 und 7 durch die Aktivierung von Caspase-9 in der apoptosome 15. Dies führt zu einer Proteolyse von ausgewählten Substraten, die unter anderem führt die Exposition von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche 16 und befreit einen dedizierten DNase, die CH-Fragmentenromatin 17,18. Um zu bestimmen, wo innerhalb der Apoptosekaskade eine individuelle Effektorprotein stört, wurde ein induzierbares Expressionssystem 19 eingesetzt wird. Regulierungssysteme für die bedingte Expression von Transgenen wurden ein wertvolles Werkzeug in der Funktion eines Proteins innerhalb der Zelle oder ihrer Bedeutung für Gewebe, Organ und Entwicklung des Organismus, als auch während der Initiation, Progression und Wartung der Krankheit 20-23 analysiert. Typischerweise induzierbare Kontrollsysteme, wie das Tet-System 24 hier verwendet wird, bilden einen künstlichen Transkriptionseinheit (siehe Abbildung 1). Eine Komponente ist eine künstlich konstruierte Transkriptionsfaktor genannt tTA (Tetracyclin-abhängige Transkriptionsaktivator), durch Fusion des bakteriellen Transkriptionsrepressor TetR 25 an einen Säugetier-Protein-Domäne, die die transkriptionale Aktivierung vermittelt oder Schalldämpfer 24,26 gebildet. Die zweite Komponente ist ein HybridPromotor bezeichnet TRE (tetracycline-responsive element), bestehend aus einem eukaryontischen minimalen Promotor, mindestens eine TATA-Box und eine Transkriptionsinitiationsstelle enthält, verbunden mit mehrfachen Wiederholungen der passenden DNA-Bindungsstelle für TetR, tetO 24,25. Die dritte Komponente ist der natürliche Ligand von TetR, Tetracyclin oder eines seiner Derivate, wie Anhydrotetracyclin und Doxycyclin 25. Bei Ligandenzugabe zum Kulturmedium verliert TetR seine Affinität für tetO und distanziert von der TRE. Als Ergebnis wird die Transkription des Zielgens aufgelöst. Transgen-Expression kann somit fest in einer zeit- und dosisabhängigen Art und Weise sowohl in der Zellkultur und in Tier 20,23,24 gesteuert werden. Mit tTA tritt Transgen-Expression konstitutiv, außer in Gegenwart von Tetracyclin. Dies kann ein Nachteil in der Studie von cytotoxischen oder onkogene Proteine ​​sein, weil Tetracyclin zunächst vom System entfernt werden, bevor Transgen expression erfolgt und Wirkungen des Zielproteins auf der Zelle überwacht werden. Dies kann zeitaufwendig sein und ist nicht immer vollständig, insbesondere in transgenen Tieren 27. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein TetR-Mutante mit einer umgekehrten Reaktion auf die Anwesenheit von Doxycyclin verwendet, um einen neuen Transkriptionsfaktor zu erzeugen, rtTA (reverse tTA) 28. Es bindet nur an dem TRE und damit einhergehend die Transkription in Gegenwart von Doxycyclin. Restundichtheit des Systems, dh., Transgen-Expression in Abwesenheit von TRE-gebundenen Transkriptionsfaktor Ursprung entweder (i) von Positionseffekten in einer genomischen Integrationsstelle, (ii) von der TRE selbst 29 oder (iii) aus nicht -spezifische Bindung von tTA / rtTA 28 wurde durch Einführung eines zusätzlichen transkriptionalen Schalldämpfer gerichtet, sogenannte TTS (Tetracyclin-abhängige Transkriptions Schalldämpfer) 30 an das System. Es bildet sich ein Zweiregler Netzwerk zusammen mit rtTA (siehe Abbildung 1).In Abwesenheit von Doxycyclin, bindet TTS TRE und schaltet alle verbleibenden Transkription aktiv. In Gegenwart von Doxycyclin, distanziert tTS von TRE und rtTA bindet gleichzeitig Induktion der Expression des Zielgens. Diese zusätzliche Schicht aus Stringenz ist oft notwendig, hochaktive zytotoxische Proteine ​​31-34 exprimieren. Mit diesen streng kontrollierten Doppelregler-System kann die Apoptosekaskade bei einer definierten Schritt kann Analysen, ob die gegebene Effektorprotein mit Apoptose stören initiiert werden. Dieses Verfahren kann nicht nur verwendet werden, um die anti-apoptotische Aktivität von bakteriellen Effektorproteine ​​studieren, sondern auch für die induzierbare Expression von pro-apoptotischen oder toxische Proteine ​​oder zum Präparieren Interferenzen mit anderen Signalwegen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt es, zu analysieren, zu dem Schritt für ein Zielprotein, oder alternativ ein kleines Molekül, interagiert mit den Komponenten eines Signalwegs. Das Verfahren basiert auf der einen Seite, auf der die induzierbare Expression eines spezifischen Proteins mit einem Signalisierungsereignis zu einem definierten und vorgegebenen Schritt in der gewählten Signalkaskade initiieren. Gleichzeitige Überexpression, andererseits aus dem Gen von Interesse ermöglicht dann der Prüfer zu beurteilen, ob die Aktivität des exprimierten Zielprotein stromaufwärts oder stromabwärts von dem eingeleiteten Signalereignisses, abhängig von der Ablesung der Signalweg, der gewonnen wird. Hier wurde die Apoptosekaskade als definierte Signalweg zum Protokollfunktionalität zu demonstrieren ausgewählt. Pathogene Bakterien, wie Coxiella burnetii, translozieren Effektorproteinen, die mit dem Host-Zelltod-Induktion in der Wirtszelle eingreifen, um Überleben der Bakterien in der Zelle zu gewährleisten und zur Förderung ihrerVerbreitung im Organismus. C. burnetii Effektorprotein CAEB wirksam inhibiert Wirtszelle Tod nach Induktion der Apoptose mit UV-Licht oder mit Staurosporin. Zu verengen, bei der Schritt CAEB stört die Ausbreitung des apoptotischen Signals wurden ausgewählte Proteine ​​mit gut charakterisierte pro-apoptotische Aktivität vorübergehend in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise exprimiert. Wenn CAEB wirkt stromauf dieser Proteine ​​wird Apoptose ungehindert ablaufen. Wenn CAEB wirkt stromabwärts wird Zelltod gehemmt werden. Die Testproteine ​​wurden ausgewählt Bax, die auf der Ebene der Mitochondrien und Caspase 3, die die Hauptscharf Protease wirkt. CAEB stört Zelltod durch Bax-Expression induziert, aber nicht von Caspase-3-Expression. CAEB somit in Wechselwirkung mit der apoptotischen Kaskade zwischen diesen beiden Proteinen.

Zunächst wurden HEK293-Zelllinien, stabil das Protein von Interesse (CAEB) Exprimieren als GFP-Fusionsprotein hergestellt. Als Kontrolle wurden HEK293-Zelllinien, die stabil GFP generiert. Expression von GFP und GFP-CAEB wurde durch Immunoblot-Analyse verifiziert. Der Vertreter Immunoblot (4A) zeigt stabile und klar nachweisbare Expression von GFP und GFP-CAEB. Jedoch kann dieser Assay nicht bestimmen, ob alle Zellen exprimieren GFP oder GFP-CAEB. Daher wurden die stabil transfizierten HEK293-Zelllinie...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Aufrufe.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Serie: Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Aufzucht und Injektion von<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven zu bakteriellen Virulenz beurteilen

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

In Vivo-Infektion mit Leishmania amazonensis zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...