Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in einer Vielzahl von Bereichen zu beantworten, die eine bedingte und vorübergehende Inaktivierung eines Gens von Interesse erfordern, indem eine dominante negative Version umgekehrt über-ausdruckend ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nur eine partielle Ablation in der Proteinaktivität zulässt, wodurch eine restliche endogene Expression erhalten bleibt. Obwohl wir hier die Zustandsinaktivierung von RB-Protein beschreiben, das in einer multimerischen Baugruppe funktioniert, kann diese Methode auch auf monomere Proteine angewendet werden.
Umesh Pyakurel, unser Labortechniker und Co-Autor im Manuskript, wird die Verfahren demonstrieren. Zunächst können Sie NIH3T3-Zellen nach den Vorgaben des Herstellers bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 anbauen und dabei das empfohlene Zellkulturmedium verwenden, das 10% fetales Rinderserum enthält. Um die Zellen mit pTet-Splice- und pCMV-Tet3G-Vektoren zu kotranstranstranssektieren, mischen Sie zunächst zwei bis vier Mikroliter des lipidbasierten Transfektionsreageims pro Brunnen und einen Milliliter unvollständigen DMEM pro Brunnen in einer 15-Milliliter-Röhre und brüten fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Fügen Sie dem DMEM-Mix dieses Transfektionsreagenzs zwei bis drei Mikrogramm Plasma-DNA pro Brunnen hinzu. Mischen und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie einen Milliliter der Mischung, die DNA und das Transfektionsreagenz in DMEM enthält, zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platte mit NIH3T3-Zellen hinzu.
Nach drei bis vier Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2, fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium hinzu. Dann fügen Sie 2 Mikroliter Doxycyclin-Lager zu jedem Brunnen und markieren Sie die Platte als Plus-Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2.
Um die Funktionalität des TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Konstrukts bei der Förderung der ungeplanten Zellproliferation zu bewerten, kulturen HEI-OC1-Zellen in DMEM, die 10%FBS enthalten, unter freizügigen Bedingungen. Für Zellproliferationsstudien zählen Sie die HEI-OC1-Zellen mit einem Zellzähler. Platte 10 000 HEI-OC1-Zellen pro Brunnen auf einer 96-Well-Platte in jeweils 200 Mikroliter Volumen.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 33 Grad Celsius mit 5%CO2. Um die transgene Expression zu induzieren, fügen Sie einer Teilmenge der transfizierten HEI-OC1-Zellen ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hinzu. Verwenden Sie die andere Teilmenge, die als Minusdoxycyclin gekennzeichnet ist, und die nicht transfizierten HEI-OC1-Zellen als Steuerelemente, und inkubieren Sie die Zellen als 33 Grad Celsius mit 10 % CO2.
Um die Zellproliferation zu bewerten, 48 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 100 Mikroliter 1x 1x Farbstoffbindungslösung aus einem Zellproliferationskit zu jedem Brunnen der Mikroplatte hinzu. Folgen Sie dem Herstellerprotokoll und brüten Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser, um die Fluoreszenzintensität jeder Probe zu messen.
Um die Zellproliferation mittels Immunzytochemie weiter zu bewerten, verankern Sie die HEI-OC1-Zellen auf einem Deckglas, das in jedem Brunnen einer 12-Well-Platte in DMEM platziert ist. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 33 Grad Celsius. Am folgenden Tag kotransfieren Sie die Zellen in zwei Brunnen mit den pTet-Splice- und pCMV-Tet3G-Vektoren und führen Sie dann die Doxycyclin-Behandlung an einer gut wie mit den NIH3T3-Zellen durchgeführt.
Verwenden Sie eine untransfizierte gut als Steuerung. Um die Zellen für die Ki-67-Etikettierung zu verarbeiten, fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Danach dreimal mit eiskaltem PBS für jeweils fünf Minuten waschen.
0,25% nichtionisches Reinigungsmittel in PBS hinzufügen und 10 Minuten brüten. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten. Verwenden Sie 10%serum, um die Zellen zu blockieren.
In einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Fügen Sie 500 Mikroliter Ki-67 Primärantikörper hinzu und brüten über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten.
Fügen Sie einen Milliliter des sekundären Antikörpers hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach dem Entfernen der sekundären Antikörperlösung die Zellen im Dunkeln dreimal für fünf Minuten in PBS waschen. Um die HEI-OC1-Zellen mit Phalloidin zu kennzeichnen, inkubieren Sie sie in 1:200 Phalloidin für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Um die Zellkerne zu beschriften, inkubieren Sie die Zellen mit fünf Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Lieferung der transgenen Mäuse, Genotyp die Welpen mit einem Primer-Set spezifisch für die CBRb1-Fusionsregion, wie in der Handschrift beschrieben. Züchten Sie erwachsene TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Mäuse an die ROSA-CAG-rtTA und Tetrecyclin-Induktorlinie, um experimentelle DN-CBRb-Mäuse zu erzeugen, und genotypieren Sie ihre Nachkommen, wie im Manuskript beschrieben.
NIH3T3 exprimiert kein endogenes RB1-Protein, daher ist die robuste RB1-Expression, die hier zu sehen ist, auf die Transgeninduktion in Gegenwart von Dox zurückzuführen, jedoch nicht in seiner Abwesenheit, was die effiziente Aktivierung des TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Mix-RB1-Konstrukts bestätigt. Im Gegensatz dazu haben HEK293-Zellen eine endogene RB1-Expression. Die Zugabe von Doxycyclin führte zur TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Aktivierung und RB1-Down-Regulierung.
Der RB1-Ausdruck wurde 21 Stunden nach der Entfernung von Doxycyclin aus den Medien wieder aufgenommen. HEI-OC1-Zellen, die mit den gleichen Vektoren kotransfiziert wurden, zeigten eine bescheidene, aber signifikante Zunahme der Zellzahl nach der Doxycyclin-Behandlung im Vergleich zu transfizierten Zellen, die nicht mit Doxycyclin behandelt wurden, und den untransfizierten Zellen. Fluoreszierende In-situ-Hybridisierung bestätigte die genomische Insertion von TetO-DN-CB-myc6-RB1-Transgen bei Mäusen.
Es gab einen anfänglichen Anstieg der gesamten RB1-Proteinexpression in Cochlea der transgenen Mäuse, die drei Tage lang mit Doxycyclin behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe. In Gruppen, die sieben und zehn Tage lang mit Doxocyclin behandelt wurden, wurde jedoch eine signifikante Verringerung der RB1-Expression beobachtet. Unabhängig vom analysierten Gewebe wurde eine signifikante Reduktion des RB1-Proteins bei transgenen Mäusen beobachtet, die mit Doxocyclin behandelt wurden, jedoch nicht in der Kontrollgruppe, was die Effizienz des TetO-DN-CB-myc6-RB1-Konstrukts bestätigte.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, zu überprüfen, ob jedes der Kodierungselemente des Transgens im Rahmen miteinander ist. Wenn die in diesem Bericht beschriebenen Kodierungsregionen Kathepsin B und Retinoblastom zufällig ablätsgemäß miteinander verbunden wären, würde dies nicht das beabsichtigte Fusionsprotein ergeben. Daher muss die DNA-Sequenzverifizierung durchgeführt werden, bevor das Transgen in einzellige Mausembryonen injiziert wird.
Nach diesem Verfahren kann der allgegenwärtige CAG-Promotor durch spezifische Promotoren ersetzt werden, um die Genfunktion auf spezifische Weise zu untersuchen.
