Die Autoren danken für wertvolle Kommentare und gründlichen Lektüre unserer Handschrift S-Y Choi (Chonnam National University). Diese Arbeit wurde durch einen Forschungsfonds der Chungnam National University unterstützt.

1. Subcloning Transgen
<ol><li>Wählen Sie eine entsprechende Restriktionsenzym Anerkennung Seite (oder Seiten) in der MCS pEUI(+) und subclone das Gen des Interesses in die gewünschte Richtung (Abbildung 1). Hinweis: Wiederholen Sie EGFP oder Flagge Epitop-Tags Ankyrin-Repeat-(AR)-Domäne 13A (ANKRD13A) Transgen EcoRI Standort des pEUI(+)-Vektors mit T4-DNA-Polymerase in einer Sequenz-Ligatur unabhängig und Klonen Methode19subcloned wurde.</li>
	<li>Linearisieren der pEUI(+) mit EcoRI für 1 h bei 37 ° C. Mix 50 ng/µL linearisiert pEUI(+) mit 40 ng/µL des PCR verstärkt EGFP oder ANKRD13A, und reagieren mit T4-DNA-Polymerase (1 HE) für 1 min bei Raumtemperatur (RT) vor der Inkubation auf Eis für 10 min. Fügen Sie 10 µL des Reaktionsgemisches direkt mit 100 µL DH10B kompetente Zellen für die folgende Transformation experimentieren. Hinweis: Obwohl die MCS pEUI(+) (Abbildung 1 b) mehrere Anerkennung Beschränkungsenzymsites hinzugefügt wurden, empfehlen wir das Zielgen in die EcoRI-Website subcloning Ligatur-unabhängige Klonen Technologie19,20.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Einlage durch Sequenzierung und dann reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Reinigung-Kit zur Transfektion geeignet ist.</li>
</ol>(2) Transiente Transfektion und Teb Behandlung
<ol><li>Bereiten Sie vier Zelle Kultur Gerichte (60 mm Durchmesser) mit frisch passagiert HEK293 Zellen in 5 mL Medium Dulbeccos modifizierten Eagle (DMEM) ergänzt mit 5-10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika (100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin). Im folgenden stellt "Zellkulturmedium" oder einfach "Nährboden" der DMEM mit FBS und Antibiotika ergänzt. Pflegen Sie die HEK293 Zellen bei 37 ° C.</li>
	<li>Transfizieren Sie 1 µg der gereinigte DNA in HEK293 Zellen bei 50-60 % Dichte mit 3 µL Transfection Reagens. Die Transfektion Reagenz zu 200 µL des Verdünnungsmittels (DMEM ohne FBS und Antibiotika) hinzufügen, die die DNA enthält. Fügen Sie nach der Inkubation der Reaktionsmischung für 30 min bei RT die Mischung auf HEK-293-Zellen in der Kulturschale. Verwenden Sie zwei Gerichte zur Transfektion, und lassen Sie die anderen beiden unbehandelt als Steuerelemente.</li>
	<li>Fügen Sie nach 12-24 h Transfektion Teb (Endkonzentrationen, 0,2 - 10 µmol) zu einem der transfizierten Proben und eines der Steuerelemente nicht transfiziert. Lassen Sie die anderen beiden Proben als experimentelle Kontrolle unbehandelt. Hinweis: Der Teb-Stammlösung (50 mM in Dimethyl Sulfoxid aufgelöst) kann im Zellkulturmedium, DMEM oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine geeignete Konzentration vor der kultivierten Zellen abhängig von den experimentellen Parameter hinzufügen verdünnt werden. Vermeiden Sie jedoch durch die geringe Löslichkeit des Teb in wässriger Lösung, Vorbereitung einen master-Mix mit einer hohen Konzentration von Teb in Medium; Stattdessen ersetzen Sie die komplette Zellkulturmedium mit frischen Teb auf die gewünschte Konzentration-haltigem Medium.</li>
	<li>Pflegen der Teb-behandelten und unbehandelten Zellen für 12-48 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Wenn mit EGFP einfügen, analysieren Sie EGFP Ausdruck unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ( Abbildung 2). Ansonsten Ernten der Zellen für eine Immunoblotting-Assay.<ol>
<li>Spülen Sie für die Immunoblotting-Assay die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS und dann kratzen sie heraus mit einem Schaber Zelle.</li>
		<li>Für die Zellen häufen, spin-down die Ernten in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Nach der PBS komplett verwerfen, hinzufügen 0,5 mL eiskaltes Säugetier-Protein Extraktion Reagenz (M-pro), zusammen mit Protease-Inhibitor (5 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail), um das Diabolo, wenn die Zellen in einer 60 mm Petrischale kultiviert werden.</li>
		<li>Wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit mehreren Verhandlungsrunden pipettieren und inkubieren Sie die suspendierten Zellen für 15 min bei 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Drehen Sie die Zelle lysate 21.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie die wässrigen Überstands zu einem frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Den Überstand durch Immunoblotting, folgende standard-Protokolle mit entsprechenden Antikörpern zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generation von stabilen HEK293 Zelllinien mit genomischen Integration der pEUI(+) Gene Switch
<ol><li>Transfizieren Sie 5-10 µg des gereinigten pEUI(+) mit das Transgen in HEK293 Zellen, die 50-60 % Zusammenfluss in der Kulturschale 90 mm Durchmesser Zelle mit 15-30 µL des Transfection Reagens. Die Transfektion Reagenz zu 500 µL des Verdünnungsmittels (DMEM ohne FBS und Antibiotika) hinzufügen, die die DNA enthält. Fügen Sie nach der Inkubation der Reaktionsmischung für 30 min bei RT die Mischung auf HEK-293-Zellen in der Kulturschale.</li>
	<li>Ermöglichen Sie nach der Transfektion die Transfectants wachsen und express Puromycin-Widerstand Genprodukte unter nicht-selektiven Kulturmedium (ohne Puromycin) für 24-48 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Die Zellen von den Kultur-Speisen durch Trypsinization zu distanzieren. Spülen Sie nach verwerfen das Kulturmedium die Transfectants mit vorgewärmten PBS (37 ° C), fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 1 min bei 37 ° c inkubieren Nach dem abschrecken Trypsin/EDTA durch Zugabe von vorgewärmten Kulturmedium (10 mL, 37 ° C), Ernten Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, gefolgt durch Zentrifugieren in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C.</li>
	<li>Wieder aussetzen der Transfectants in 50 mL vorgewärmten Kulturmedium (37 ° C) und Transfer 10 mL der Zellen in 90 mm Frischzellen-Kultur Gerichte. Kulturzellen bei 37 ° C bis 50-60 % Konfluenz vor der Puromycin-Behandlung (in der Regel dauert dies etwa 24-48 h).</li>
	<li>Pflegen Sie die Transfectants bei 37 ° C im Zellkulturmedium für 3-4 Wochen mit 3 µg/mL Puromycin ergänzt. Während der Auswahl ändern Sie das Zellkulturmedium mit Puromycin (3 µg/mL) alle 2-3 Tage um Selektionsdruck zu erhalten. Wenn die Zellen voll konfluierende werden, teilen Sie sie nach den Verfahren in Schritten 3.3 3.4, mit Puromycin-haltigen Kulturmedium. Die restlichen Zellen in das Kulturmedium zu verwerfen, wenn nicht benötigt. Hinweis: Puromycin Selektionsbedingungen müssen experimentell für bestimmte Zelltypen hergestellt werden. Wir haben 3 µg/mL von Puromycin in Zellkulturmedium verwendet; Dies war genug, um Zelltod in nicht-transfizierten HEK293 induzieren.</li>
	<li>Ernte der Zellen aus einzelnen Kolonien, mit einem Klon Zylinder, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.<ol>
<li>Entsorgen Sie das Zellkulturmedium. Spülen Sie die Platte zweimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS, schwimmende Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Mit sterilen Pinzette set Klonen Zylinder über den einzelnen Kolonien.</li>
		<li>Jeder Zylinder 0,2 mL 0,35 % Trypsin/EDTA hinzufügen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C für 1 min, bis die Zellen freistehende sind, und fügen Sie ein paar Tropfen Kulturmedium vorgewärmt (37 ° C) zu den Zylindern.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen von jeder Zylinder auf individuelle Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 2 mL Kulturmedium und 1 µg/mL Puromycin in jede Vertiefung. Hinweis: Wenn die Zellen konfluierende werden, Skalieren Sie die Kultur. Clone(s) kann jetzt festgelegt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie individuelle Klone im Zellkulturmedium mit 1 µg/mL Puromycin ergänzt.</li>
	<li>Einzelne Kolonien durch die Prüfung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Teb Behandlung (Endkonzentration, 10 µM) für 24 h Test der Reaktionsfähigkeit der Klone, die Teb analysiert die Expression des Transgens mit Immunoblotting überprüft. Wählen Sie einen gewünschten Klon (oder Klonen). Pflegen Sie eine Teb behandelt und eine unbehandelte Probe in Kulturmedium für 12-48 h bei 37 ° C vor der Analyse der Induktion-Ebene des Transgens. Die Expression des Transgens kann durch Immunoblotting, nach den Verfahren in Schritten 2.5.1 - 2.5.7 gemessen werden.</li>
</ol>4. Abbau der Teb
<ol><li>Die Teb Reize indem Teb enthaltenden Zellkulturmedium mit Teb-freies Medium zu stillen. Hinweis: Es wird empfohlen, die Wachstumsmedien zu ersetzen, ohne ersten Seeding der Zellen auf eine neue Kulturschale. Verbleibende Teb scheint an der Plastikschale festhalten und eine starken Hintergrund-Expression des Transgens zu entlocken. Vor dem Seeding der Zellen auf eine neue Kultur-Platte, spülen Sie die geernteten Zellen mehrmals mit Kulturmedium oder PBS.<ol>
<li>Die Zellen von den Kultur-Speisen durch Trypsinization zu distanzieren. Spülen Sie nach verwerfen die Teb mit Nährmedium die Teb-stimulierten Zellen zweimal mit vorgewärmten PBS (37 ° C), fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/EDTA und 1 min bei 37 ° c inkubieren Nach dem abschrecken Trypsin/EDTA durch Zugabe von vorgewärmten Teb-freien Kulturmedium (10 mL, 37 ° C), Ernten Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, gefolgt durch Zentrifugieren in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 50 mL vorgewärmten Teb-freien Kulturmedium (37 ° C) und Transfer 5 mL der Zellen in drei 60 mm Frischzellen-Kultur Gerichte. Die Zellen bei 37 ° C für 24, 48 und 72 h bzw. Kultur.</li>
		<li>Ernte der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten und die Expression des Transgens mithilfe Immunoblotting zu messen. Hinweis: Unter diesen Versuchsbedingungen wurde die Expression des Transgens nicht nachweisbar etwa 3 Tage Post-Kultur der Zellen in der Teb-freies kulturelles Medium (Abbildung 3). Die Expression des Transgens kann durch Immunoblotting, gemäß Schritte 2.5.1 - 2.5.7 gemessen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Wir haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Der größte Nachteil der Verwendung eines binären Genschalter Ausdruck ist die Notwendigkeit, zwei separate Plasmide (Fahrer und Effektor) gleichzeitig in die Zielzelle zu liefern. Dies führt zu einer ungleichen Verteilung von Plasmiden und Ergebnis in einer inkonsistenten Antwort des Schalters auf der Induktoren1,2,3. Ein weiterer Nachteil der zwei-Vektor-System ist, dass ein Minimum von zwei Runden von Antibiotika Auswahl e...

Mehrere verschiedene Genschalter wurden für ihre Fähigkeit, präzise regulieren Transgene Expression in Zellkulturen und Tiermodellen, mit unterschiedlichem Erfolg1,2,3untersucht. Potenzielle gen Schaltanlagen sollten mehrere strenge Kriterien, einschließlich treffen: präzise gerichtete Expression des Transgens, Dosierung und zeitabhängig Reaktionsvermögens zu induzieren, vernachlässigbar Undichtigkeit des Promoters, Reversibilität des Transgens Aktivierung durch Entfernung der Induktor und Induktor Toxizität erträglich zu Zell-Linien und Labor Tiere1,2,3. Mehrere kleine Molekül Induktoren wurden ausgebeutet, einschließlich Tetracyclin4,5, Rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, und Ecdyson11,12,13,14. In der Regel diese Systeme erfordern mindestens zwei Plasmide mit zwei oder drei diskrete Ausdruck Einheiten, ein oder zwei davon zu komponieren ein regulatorisches Element (Induktor Plasmid), das bindet eine kleines Molekül-Induktor transkriptionelle Aktivität zu gewinnen; und ein weiteres Plasmid (Effektor Plasmid), enthält das Transgen unter der Kontrolle einer regulatorischen DNA-Region, die den Zugang von der Induktor-gebundenen regulatorisches Element ermöglicht. Der größte Nachteil des binären Systems ist, dass es die gleichzeitige Einführung der beiden Vektoren (Induktor und Effektor) in die Zielzelle erfordert. In Transienten Transgene Ausdruck Experimente produziert die gleichzeitige Transfektion von zwei Plasmide unweigerlich eine Population von Zellen, die einzeln mit dem Induktor oder der Effektor transfiziert oder Co ungleich transfiziert. Darüber hinaus erfordert das binäre System mindestens zwei Runden von Antibiotika Auswahl, stabilen Zelllinien zu etablieren, das ist zeitaufwändig und mühsam. So verbindet alle Komponenten für die Expression des Transgens erforderlich und Verordnung in einem einzigen Vektor wäre ideal, um den gleichzeitigen Ausdruck alle erforderlichen Elemente in einer einzelnen Zelle zu gewährleisten und ermöglichen für die Regulierung der Expression des Transgens durch die Behandlung mit kleinen Moleküls induzieren.
Um die Mängel der binären Genschalter zu überwinden, entwickelten wir vor kurzem eine singuläre Genschalter mit einem Drosophila Melanogaster EcR-basierte gen induzierbaren System15. Ecdyson vermittelt Genexpression, wenn es um die EcR/Ultraspiracle (USP)-Heterodimer, bindet die Bindung von der EKR auf DNA-regulatorischen Elementen3,11wiederum induziert. Der vertebrate Retinoid X-Rezeptor (RXR), ein Ortholog des Insekts USP, Rekruten EcR um eine aktive transcriptional Aktivator16bilden. So, für die gezielte Expression von Transgen in vertebrate Zellen oder Gewebe, die EcR und RXR Co ausgedrückt gleichzeitig muss vor stimuliert durch Ecdyson oder seine Agonisten. Da die endogene RXR Ebene, Padidam Et Aldie heterodimerisierenden Funktion des Schalters EcR-basierte gen beeinflusst werden kann. ersetzt die EcR DNA-Bindung und Aktivierung Domains mit heterologen GAL4 DNA-Bindung, Herpes-Simplex-Virus-Protein-vmw65 (VP16) Aktivierung Domänen miteinander verschmolzen, die EcR Liganden-bindende Domäne, die dann wurde reagiert nicht auf endogene RXR und bildeten ein Homodimer transkriptionelle Aktivität17zu gewinnen. Die EcR-basierte Genschalter wurde weiter verbessert, durch den Bau ein chimäres Protein bestehend aus minimal VP16 Aktivierungsdomäne, kombiniert mit GvEcR, die ein Homodimer gebildet und in der Zellflüssigkeit in Ermangelung Ecdyson Agonist, Teb16lokalisiert, 18. Durch die Bindung an Teb, verändert die GvEcR seiner subzelluläre Lokalisation aus dem Zytosol in den Zellkern zu erkennen, ein Hybrid-Promotor bestehend aus Zebrafisch E1b minimal Förderer mit einem zehn Tandem kombiniert wiederholt vorgelagerten Aktivierung Sequenzen (Drohnen) zu initiieren die Transkription der Ziel-gen16.
Zur Vereinfachung der bisher gemeldeten EcR-basierte Gens schaltet16,18, wir kombiniert die binäre Funktionen des Systems in einen einzigen Vektor, ausgestattet mit allen erforderlichen Elementen für anregende Transgene Ausdruck und dann bezeichnet die neu generierten Vektor, pEUI(+) (GenBank Zbl-Nummer: KP123436, Abbildung 1A)15. Der Effektor reagieren auf den GvEcR-Treiber (im folgenden Treiber) besteht aus zehn Tandem UAS neben einem E1b minimal Förderer, gefolgt von einer Site mit mehreren Klonen (MCS) wiederholt mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Erkennungssequenzen (Abbildung 1 b). Zusätzlich, um die Auswahl zu erleichtern transfizierten Zellen, einer SV40 Projektträger-gesteuerte Puromycin N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen wurde zwischen den Fahrer und Effektor Regionen weiterhin stabilen Zelllinien (Abbildung 1) gelegt.
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die transiente und stabile Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+). Darüber hinaus bieten wir detaillierte Anweisungen für den erfolgreichen Einsatz von Teb als Agonist Ecdyson.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Präzise Steuerung des Transgens Ausdruck ist in biologischen und klinischen Studien wünschenswert. Jedoch, da die binäre Funktion der derzeit eingesetzten Genschalter die Übertragung von zwei therapeutische Ausdruck Einheiten gleichzeitig in eine einzelne Zelle erforderlich ist, beschränkt sich die praktische Anwendung des Systems für die Gentherapie. Um die Transgen-Expressionssystem zu vereinfachen, haben wir einen Genschalter als pEUI(+) umfasst einen kompletten Satz von Transgen Ausdruck Module in einem einzigen Vektor generiert. Bestehend aus der GAL4 DNA-bindende Domäne und modifizierte EcR (GvEcR), eine minimale VP16 Aktivierungsdomäne verschmolzen mit einem GAL4 DNA-bindende Domäne sowie eine modifizierte Drosophila Ecdyson Rezeptor (EcR), ist die neu entwickelte einzigartige Genschalter hoch auf die Gabe von chemischen Induktor in einer Zeit-Dosis-abhängigen Weise reagieren. Der pEUI(+)-Vektor ist ein potenziell leistungsfähiges Werkzeug zur Verbesserung der Kontrolle des Transgens Ausdruck in der biologischen Forschung und prä-klinischen Studien. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Modulation eines transiente und stabile Transgen Ausdrucks mit pEUI(+) Vektor durch die Behandlung von Tebufenozide (Teb). Darüber hinaus geben wir wichtige Hinweise für die Verwendung von Teb als eine chemische Induktor.

Die GvEcR-basierte singuläre Genschalter ist in Figur 1Adargestellt. Der pEUI(+) Vektor wurde durch die Behandlung mit Teb für regulierte Transgene Ausdruck optimiert. Die Effektor-Region des pEUI(+) umfasst eine 10xUAS und ein E1b minimal Projektträger eine MCS mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Anerkennung Beschränkungsenzymsites folgen. Ein SV40 poly(A) Signal wurde hinter der MCS (Abbildung 1 b) hinzugefügt. Ein ...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Aufrufe.  Chungnam National University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Serie: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...