Die Autoren möchten die Vertex Pharmaceuticals und den Cystic Fibrosis Research Innovation Award für die Finanzierung von R. Quinn und der NIH / NIAID zur Finanzierung von 1 U01 AI124316-01, einem systembiologischen Ansatz zur Behandlung von Multi-Arzneimittelresistente Pathogenen, anerkennen. Wir danken auch der Abteilung für Mechanische und Luft- und Raumfahrttechnik bei UCSD&#39;s Undergraduate Maschinenbau Senior Design Design für die Erleichterung der Zusammenarbeit mit den technischen Aspekten dieser Arbeit.

1. Herstellung von Aktien für die Artificial Sputum Medien <ol><li> Erstellen Sie eine 5% Mucin Lösung. Hinzufügen 1,0 g entwässertes Schweinemagen zu 20 ml entionisiertem Wasser Mucin. Autoclave die resultierende Lösung. HINWEIS: Die Mucin-Sterilisation wird seine inhärente Struktur zerstören; andere Verfahren, die die Muzin in ihrer trockenen Form umfassen UV-Bestrahlung und Sterilisation zu sterilisieren. Diese Verfahren sind nicht für das WinCF System jedoch ausgiebig genutzt. </li><li> In 2,2 g KCl auf 50 ml entsalztem Wasser und lassen für die Auflösung. Hinzufügen von 5,0 g NaCl zu 50 ml entionisiertem Wasser und ermöglichen für die Auflösung. Autoclave diese beiden Lösungen. </li><li> Je 100 mg Lachssperma-DNA zu 10 ml sterilem deionisiertem Wasser. Erhitzen Sie diese Lösung auf etwa 85 ° C in einem Wasserbad für einige Stunden Auflösung zu gewährleisten. </li><li> Hinzufügen 5,0 mg Ferritin bis 5,0 ml sterilem deionisiertem Wasser. </li></ol> 2. Herstellung des künstlichen Sputum Medium <ol><li> KombinierenDie folgenden Komponenten: 16 ml Mucin-Stammlösung, 2,0 ml KCl-Stammlösung, 2,0 ml NaCl-Stammlösung, 200 μl Eigelb-Emulsion, 5,6 ml DNA-Stammlösung, 120 μl Ferritin-Stammlösung, 5,78 ml essentiell Aminosäurelösung, 5,78 ml nicht essentielle Aminosäurelösung und 2,44 ml steriles Wasser. <ol><li> Wenn kleine Mengen von Sediment erscheinen, schütteln Sie sanft zu mischen. </li><li> Pipettieren Sie 5,0 ml Medium in acht sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die chemischen Bedingungen jedes Röhrchens können wie gewünscht manipuliert werden. Zum Beispiel können Pufferlösungen und pH-Indikatoren zu jedem Röhrchen hinzugefügt werden, um das mikrobielle Verhalten bei verschiedenen pH-Werten zu vergleichen. Eine Demonstration hiervon zeigt sich im repräsentativen Ergebnisbereich mit 8 verschiedenen pH-Werten von 5,0 bis 8,5 in 0,5 pH-Schritten. </li></ol></li><li> Sobald die chemischen Bedingungen der Medien erfolgreich manipuliert sind, frieren Sie für spätere Verwendung. Die Medien bleiben stabilZen bei -20 ° C für mehrere Monate. Vortex beim Auftauen. </li></ol> 3. Vorbereitung eines Kontrolllaufs der Kapillarrohre <ol><li> In einem sterilen Biohood füllen Sie acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 250 μl Medium. </li><li> Erwerben Sie acht weitere sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei jedes Röhrchen einem in Schritt 3.1 genannten Mikrozentrifugenröhrchen entspricht. <ol><li> Sterilisieren Sie ein Papiertuch mit 70% iger Ethanol-Lösung und trocknen lassen. Sobald es getrocknet ist, reißen Sie das Handtuch in Stücke von etwa vier Quadrat-Zoll und zerbröckeln jedes Stück in der Unterseite eines 15-ml-Zentrifugenröhrchens. Für zusätzliche Röhrchen, Spray und trockene zusätzliche Papiertücher nach Bedarf. </li><li> Mit einem Klumpen Papier an der Unterseite jedes Zentrifugenröhrchens, dämpfen Sie jeden Papierklumpen mit ca. 1,0 ml sterilem Wasser, um eine feuchte Umgebung zu erzeugen. </li></ol></li><li> Erhalten Sie drei Glas-Kapillarröhrchen für jedes in Schritt 3.1 hergestellte Mikrozentrifugenröhrchen und einen Block aus Kapillarrohr-Kitt SealaNt </li><li> Für jedes Mikrozentrifugenröhrchen füllen Sie drei Kapillarrohre mit Medien bis etwa 5 mm von der blauen Markierung in der Nähe der Oberseite des Röhrchens ab. <ol><li> Füllen Sie, indem Sie ein Ende des Rohres im Mikrozentrifugenröhrchen halten und in Richtung der horizontalen Ausrichtung kippen, so dass Kapillarwirkung das Medium in das Röhrchen führen kann (siehe Abbildung 1 ). </li><li> Stoppen Sie die Füllung, indem Sie sanft einen Handschuh über das offene Ende des Rohres legen und dann das andere Ende des Rohres abdichten, indem Sie es in den Dichtungsblock drücken. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiel pH-Gradient, Füllen Kapillarrohr mit künstlichem Sputum Medium. Das Medium wird durch Einsetzen eines Endes des Röhrchens in die Flüssigkeit und Kippen hinzugefügt, um die Kapillarwirkung zu erleichtern. Die mittlere Färbung in diesem Beispiel ist aufgrund der pH-Indikator hinzugefügt, um Dämon zu helfenNach der Inkubation potenzielle Säureänderungen durchführen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="5"><li> Legen Sie jeden Satz von drei Kapillarröhrchen in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit Papiertüchern gefüllt sind, die vollständig mit sterilem Wasser angefeuchtet wurden, Kitt-versiegelte Seite nach unten. Kappe die Tube und Etikett. Diese drei Kapillarröhren dienen zur Replikation jeder Kontrollbedingung. </li><li> Wenn alle 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den dafür vorgesehenen Kapillarrohren gefüllt sind, legen Sie die Röhrchen in einen Halterahmen. Stellen Sie das Gestell so auf, dass die Röhrchen horizontal inkubiert werden (um Gasblasen zu fangen) (siehe Abbildung 2 ). Inkubieren Sie die Kapillarröhrchen innerhalb der Zentrifugenröhrchen (mit den befeuchteten Papierklumpen) bei 37 ° C für 48 h. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiel pH - Gradient, Kapillarröhrchen Bereit Inkubation. Sobald drei Kapillarröhrchen gefüllt wurden und versiegelt, werden sie in einem Zentrifugenröhrchen mit einem feuchten Papiertuch an der Unterseite angebracht. Dieses Rohr wird dann verschlossen und in ein Gestell gelegt. Das Rack muss während der Inkubation orientiert seitwärts, wie hier dargestellt, so dass die Gasproduktion beobachtet werden kann, sobald die Inkubation abgeschlossen ist. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Imaging der Kontroll Kapillarröhrchen nach Inkubation <ol><li> Entfernen Sie die Ständer von Zentrifugenröhrchen aus dem Inkubator, um sicherzustellen, die Rohre horizontal zu halten. gleiten sorgfältig die Kapillarröhren aus den Zentrifugenröhrchen, wobei jeder Satz aus drei getrennt von anderen Sätzen zu halten. </li><li> Ordne die Kapillarröhren nebeneinander auf einem Leuchtkasten, alle aufgereiht, so dass der Inhalt der Röhren sind visUnd beleuchtet Lassen Sie eine Lücke alle drei Röhren, um verschiedene chemische Bedingungen zu trennen. </li><li> Mit den Rohren ausgerichtet und lightbox eingeschaltet, foto von oben oben. (Siehe Abbildung 3 ) </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiel pH-Gradient, Kontrolllauf, Vorinkubation, kein Sputum hinzugefügt. Künstliches Sputum-Medium nach der Zugabe zu Kapillarröhrchen in Sätzen von drei, Erhöhung des pH-Werts von links nach rechts. Die Kombination der Indikatoren, die dem Medium hinzugefügt wurden, führt zu mehr sauren Röhrchen, die mehr gelb erscheinen, während weniger saure Röhrchen lila werden. Die Rohre sind horizontal angeordnet und werden von unten beleuchtet, von oben fotografiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> EntsorgenKontrollmaterialien in biologischen Abfällen. </li></ol> 5. Inokulation des WinCF Kapillarröhrchen mit einem Sputumprobe <ol><li> In einem sterilen biohood füllt acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit 225 &amp; mgr; l Medium pro Person. </li><li> Homogenisieren der Sputumprobe durch Herausziehen und Auswerfen des Sputums wiederholt mit einer 3 ml-Spritze (eine Plastikspritze ohne Nadel). Tun Sie dies, bis der Auswurf der glatten Konsistenz ist. </li><li> Zugabe von 25 &amp; mgr; l Sputum homogenisierte zu jedem Reaktionsgefäß (1/10 Verdünnung in ASM media), hergestellt in Schritt 5.1. Dann vortexen die Röhrchen für 30 s ausreichend zu mischen. </li><li> Fügen Sie die Medien Kapillaren nach dem gleichen Verfahren wie 3.2 bis 3.5 Schritte. </li></ol> 6. Imaging von Probe Kapillarröhrchen nach Inkubation <ol><li> Nach der Inkubationszeit von 48 h, entfernen und Bild der Kapillarröhrchen nach dem gleichen Verfahren wie die Schritte 4.1 bis 4.3. </li><li> Wenn Luftblasen in den Rohren vorhanden sind, machensicher, dass die zeigen aufgenommenen Fotografien deutlich die Abgrenzung zwischen den Blasen und Medien in den Rohren. Wenn Biofilm vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass die Fotos eindeutig seine Präsenz als auch darstellen kann. </li></ol> 7. Entfernen von Medien für Downstream-Anwendungen <ol><li> Zur Erleichterung des Downstream-Analyse, entfernt die Medien aus den Kapillarröhrchen nach der Bebilderung. Mögliche Anwendungen umfassen die Kultivierung und DNA / RNA-Sequenzierung und metabolomic Profilierung. Achtung: Die Glaskapillarröhren gefüllt mit Krankheitserregern sind ein bedeutender Biohazard, so müssen diese Schritte sehr sorgfältig mit der speziellen Ausrüstung durchgeführt werden. Wenn Kapillaren brechen, entsorgen Behälter richtigen Biohazard sharps. </li><li> Verwenden blunt ended Nadeln von 25 Gauge und 0,5 Zoll in der Länge, die Medien zu entfernen. Legen Sie die blunt ended Nadel in das verstopfte Ende der Röhre um die Dichtung zu brechen. </li><li> Nachdem die Dichtung zu brechen, drehen das Kapillarrohr den Kopf und die Medien aus dem oberen Teil heraustropfen. ichWenn die Medien nicht leicht abtropfen, verwenden Sie eine Pipette mit einer 200 μl Spitze und vertreiben Sie das Medium aus dem Schlauch heraus, indem Sie den Pipettenkolben nach unten drücken, wenn er in das Ende des Kapillarrohres eingeführt wird. Das ausgestoßene Röhrchenmedium in einem geeigneten Behälter (1,5 mL Zentrifugenröhrchen) sammeln. HINWEIS: Für die transkriptomische oder andere RNA-Analyse können die Medien direkt in RNA-stabilisierende Puffer ausgewiesen werden. </li></ol> 8. Das WinCF FLUD System HINWEIS: Das WinCF Fluid Loading Utility Device (FLUD) System ist eine optionale Suite von komplementären Geräten zur Optimierung des Durchsatzes des WinCF Systems. Das WinCF FLUD System besteht in erster Linie aus 3D bedruckbaren Materialien. 3D gedruckte Fertigung ermöglicht einen schnellen und einfachen Austausch von Materialien, um minimale Ausfallzeiten für Forscher sowie minimale Fertigungsanforderungen zu gewährleisten. Entwürfe, Stl-Dateien, 3D-Druckanweisungen und das WinCF FLUD-Handbuch finden Sie im Online-SupplemeNt <ol><li> Medien für die Kapillarrohrbeladung vorbereiten <ol><li> In einem sterilen Biohood füllen Sie acht sterile 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit je 900 μl Medium. </li><li> Homogenisieren Sie alle Sputumproben, indem Sie das Sputum wiederholt mit einer 3-ml-Spritze (einer Plastikspritze ohne Nadel) abziehen und ausstoßen. Tun Sie dies, bis das Sputum ist von glatter Konsistenz. </li><li> 100 μl homogenisiertes Sputum zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen (1/10 Verdünnung in Medium), hergestellt in Schritt 8.1.1, zugeben. Dann die Röhrchen für 30 s vortexen, um ausreichend zu mischen. </li><li> Schlitz die gefüllten und offenen Mikrozentrifugenröhrchen in den Rotatorrohrhalter, der so ausgerichtet ist, dass die Rohre vertikal sind. </li></ol></li><li> Platzierung von Kapillarrohren <ol><li> Drei Kapillarröhrchen für jedes Mikrozentrifugenröhrchen in Schritt 8.1 abholen. </li><li> Schieben Sie drei Röhrchen in die Gummi-Wiege, so dass sie mit den Mikrozentrifugenröhren am anderen Ende des Gerätes ausgerichtet sind.Vergewissern Sie sich, dass die markierten Enden der Rohre von den Mikrozentrifugenröhrchen abgewandt sind. Setzen Sie die drei Löcher auf die Unterseite der Wiege richtig über die drei Bolzen auf dem Wiege stehen. </li><li> Wenn die platzierten Kapillarröhrchen in ihren Führungskanälen auf dem Apparat ruhen, legen Sie den Gummistoß sicher über den Mittelteil, um ein Verschieben zu verhindern. (Siehe Abbildung 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Abbildung 4: Das FLUD-System, das vollständig mit Kapillarrohren beladen ist, die durch den Gummistoß über ihre Mittelsektionen gesichert sind. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Einlegen von Medien in die Kapillarrohre <ol><li> Verwenden Sie sorgfältig eine Hand, um das Ende des Gerätes zu erfassen, wo die Kapillarrohre liegenaded, und die andere Hand den Rotator Gestell, in dem die Mikrozentrifugenröhrchen geladen zu halten. </li><li> Delikat drehen, um die Mikrozahnstange, so dass die Mikrozentrifugenröhrchen fast horizontal sind und schreiten langsam die Zahnstange in Richtung der Kapillarröhren zu schieben. (Siehe Abbildung 5) </li><li> Wenn die Enden der Kapillarröhren Kontakt mit den Medien in den Mikrozentrifugenröhrchen machen, stellen Sie sicher, dass sofort Kapillarwirkung beginnt die Kapillaren zu füllen. Um Füllrate einstellen und Füllstand, drehen Sie vorsichtig die Vorrichtung als Ganzes. Während dies zu tun, seien Sie vorsichtig nicht Medien aus den Mikrozentrifugenröhrchen zu verschütten. (Siehe Abbildung 6) </li><li> Wenn die Kapillarröhrchen auf gewünschte Pegel gefüllt sind, stellen die Vorrichtung Ebene auf einer Oberfläche und vorsichtig noch schnell das Gestell von Mikrozentrifugenröhrchen von den Enden der Kapillarröhrchen ziehen einzustellen füllt. Die Reaktionsgefäße können nun den ganzen Weg zurück zur vertikalen Position zurückgezogen und geschlossen werden. </li><li> Abdichten des überstehenden Endes der Kapillarröhrchen durch einen Dichtungsblock auf jeden Satz dreifachen Ausführung Pressen, Dichtungs- einen Satz zu einer Zeit, bis alle Sätze abgedichtet sind. Um das Risiko der Kontamination zu reduzieren, drücken , um einen anderen Teil des Dichtungsmittelblockes auf jede dreifachen Ausführung eingestellt ist (siehe Abbildung 7). </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Abbildung 5: Das FLUD - System mit Mitteln Tubes Eingesetzt in eine horizontalen Ausrichtung, fertig Kontakt mit Kapillarröhrchen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Abbildung 6: Das FLUD - System mit Kapillarröhrchen mit Medien über Kapillarwirkung Laden. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Abbildung 7: Abdichten gefüllte Kapillarrohre auf dem FLUD-System Ein Triplicate Set zu einem Zeitpunkt mit einem Sealant Block. Dieser Dichtungsblock hatte an den Kanten Kunststoff, der abgeschnitten wurde, um den Kontakt mit benachbarten dreifachen Sätzen während des Versiegelns zu verhindern. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> Inkubation <ol><li> Entfernen Sie den Gummistoß über den Teller-Mittelteil und heben Sie die Gummi-Wiege vom Hauptgerät ab. Das sollten alle Kapillarrohre mitnehmen. Setzen Sie nun die Wiege und die Röhren auf das Imaging-Rack. Dieses raCk hat drei Stubs, die in die Wiege passen, sowie kleine Führungskanäle, um die Rohre einzusetzen. </li><li> Stellen Sie das Imaging-Rack als Ganzes in die klare Kunststoff-Inkubationsbox ein. Kleine Mengen steriler Papiertücher in steriles Wasser einweichen und an den beiden kürzeren Seiten der Schachtel anbringen, um während der Inkubation Feuchtigkeit zu liefern. (Siehe Abbildung 8 ) </li><li> Schließen Sie die Schachtel vollständig und stellen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator ein und achten Sie darauf, die Rohre waagerecht zu halten. Inkubieren für 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Abbildung 8: Kapillarrohre in der Gummi-Wiege vom FLUD-System auf ein Imaging-Rack übertragen, das in einer klaren Inkubationsbox neben feuchten Papiertüchern angeordnet wurde, um Feuchtigkeit zu liefern. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version von th anzuzeigen</a>Ist Figur. <ol start="5"><li> Bildgebung und Extraktion <ol><li> Entfernen Sie das Imaging-Rack, das die Rohre hält, aus der Inkubationsbox und legen Sie es auf einen Leuchtkasten, der von unten beleuchtet ist. Bei den Röhren, die sich bereits im Imaging-Rack befinden, werden die Triplicate-Sets richtig beabstandet und sofort fertig. </li><li> Fokussieren Sie die Kamera auf die Röhren, so dass alle sichtbar sind im Sichtfeld und Licht aus dem Lichtkasten bietet ausreichend Kontrast und Visualisierung der Farbe in den Röhrenfarbstoffen. Foto von direkt oben. </li><li> Um den Inhalt der Rohre zu extrahieren, entfernen Sie die Kapillarrohre aus der Gummi-Wiege einen Satz von Triplikaten zu einer Zeit. Heben Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Wiege heraus und schieben Sie sie heraus. </li><li> Für jeden Satz von Triplikaten folgen Sie den in den Schritten 7.1 bis 7.3 beschriebenen Extraktionsverfahren. </li></ol></li></ol>

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	<li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Winogradsky-based+culture+system+shows+an+association+between+microbial+fermentation+and+cystic+fibrosis+exacerbation.">A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation.</a> ISME J . 9, 1024-1038 (2015).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+of+the+cystic+fibrosis+lung.">Microbial ecology of the cystic fibrosis lung.</a> Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).</li><li>Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+lung+microbiome:+Opportunities+to+reconsider+management+of+airway+infection.">Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection.</a> Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).</li><li>Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+human+airway+microbial+ecology+reveals+a+pervasive+signature+for+cystic+fibrosis.">Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).</li><li>Willner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+microbial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung.</a> ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).</li><li>Delhaes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+microbiota+in+cystic+fibrosis:+a+complex+fungal+and+bacterial+community--implications+for+therapeutic+management.">The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management.</a> PloS one. 7 (4), e36313 (2012).</li><li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D.+Bacterial+diversity+in+cases+of+lung+infection+in+cystic+fibrosis+patients:+16S+ribosomal+DNA+(rDNA)+length+heterogeneity+PCR+and+16S+rDNA+terminal+restriction+fragment+length+polymorphism+profiling.">D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling.</a> J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).</li><li>Stenbit, A. E., Flume, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+exacerbations+in+cystic+fibrosis.">Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).</li><li>Twomey, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+metabolite+profiling+reveal+specific+alterations+in+bacterial+community+structure+and+environment+in+the+cystic+fibrosis+airway+during+exacerbation.">Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation.</a> PloS one. 8 (12), e82432 (2013).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cystic+fibrosis+airway+microbiota+at+pulmonary+exacerbation.">Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation.</a> Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).</li><li>Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+Cystic+Fibrosis+Sputum+Can+Be+Chemically+Dynamic,+Anoxic,+and+Extremely+Reduced+Due+to+Hydrogen+Sulfide+Formation.">Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation.</a> mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).</li><li>Sriramulu, D. D., L&#252;nsdorf, H., Lam, J. S., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).</li><li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogeochemical+forces+shape+the+composition+and+physiology+of+polymicrobial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung.</a> mBio. 5 (2), (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die mikrobiologische Make-up einer Lunge mit CF enthält eine Vielzahl von Organismen, aber die Bedingungen innerhalb der Lunge haben wahrscheinlich einen signifikanten Einfluss auf welche Arten von Mikroben überleben und gedeihen können 13 , 15 . Spezifische Mechanismen, durch die sich diese Bedingungen ändern und die genauen Wirkungen auf das Lungenmikrobiom sind im Allgemeinen unklar. In dieser experimentellen Methode stellen wir eine Analyse der mikrobiol...

Die in diesem Manuskript beschriebene Methode heißt das WinCF-System 1 . Das übergeordnete Ziel von WinCF ist es, eine experimentelle Einrichtung zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, die Umgebung eines mit Schleim gefüllten Lungenbronchiole zu simulieren. Dies ermöglicht ein traktierbares System, um mikrobielle Pathogene von Lungenerkrankungen mit einem Schleim-Hypersekretionsphänotyp einschließlich zystischer Fibrose (CF), chronisch obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), Asthma und anderen zu untersuchen. Das Verfahren wurde speziell für die Untersuchung von CF entwickelt, die durch Mutationen gekennzeichnet ist, die dazu führen, dass Lungensekrete dick und schwer zu klären sind, schließlich füllende Bronchiolen und andere kleine Durchgänge mit Schleim 2 . Solche Blockaden in der Lungen hemmen Gasaustausch, weil inhalierte Luft nicht mehr in der Lage ist, viele Alveolen zu erreichen und auch einen Lebensraum für die Bakterienkolonisation 3 , 4 zu schaffen . Die Unfähigkeit, das mikrobielle Wachstum zu verhindernübermäßige Lunge Schleim führt schließlich zu der Entwicklung von komplexen chronischen Infektionen der Atemwege. Diese Gemeinschaften enthalten eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Viren, Pilze und Bakterien , wie Pseudomonas aeruginosa, die alle in Wechselwirkung miteinander , 5, 6, 7, 8. Die Aktivität der CF Lungen microbiome wird angenommen , in Leuchtsignale von Symptomen pulmonale Exazerbationen 1, 9, 10, 11 genannt beteiligt sein. WinCF ermöglicht Studie der mikrobiellen Gemeinschaft Verhalten rund um diese Exazerbationen und jetzt erweitert wird als Basis experimentelles System zu handeln Lunge mikrobielle Ökologie zu studieren. Traditionell wurden Exazerbationen durch direkte Analyse von Proben aus der Lunge entnommen suchen. Viele Störfaktoren machen direkte Analyse der mikrobiellen bVerhalten in der Lunge herausfordernd, mit dem WinCF-System werden viele dieser Faktoren entfernt und das Verhalten des Lungenmikrobioms kann direkt untersucht werden, was eine feinere Analyse der Bakterienaktivität in einem Schleimhautbronchiole ermöglicht. Das WinCF-System bietet eine Methode zum Bilden und Analysieren von Bakterien in einer Weise, die die Lungenumgebung effektiv nachahmt. Traditionelle Methoden zum Aufwachsen von Lungenbakterien beteiligten sich oft an der Kultivierung von Proben auf traditionellen Agarplatten. Diese Methoden lassen die Proben dem atmosphärischen Sauerstoff offen und vernachlässigen die hypoxischen und oft anoxischen Zustände bei Lungenbronchiolen, die mit dem Schleim 12 , 13 verbunden sind . Die Kultivierung auf Agar unter aeroben Bedingungen ist nichts wie die Umgebung der CF-Lunge und kann Kliniker und Forscher über das Verhalten der Krankheitserreger, die sie behandeln wollen, irreführen. Zusätzlich sind die Nährstoffe für Bakterien auf Agarplatten erhältlichSind unähnlich zu denen, die in der tatsächlichen Sputum, die in WinCF durch die Verwendung von künstlichen Sputum Medien (ASM) berücksichtigt wird. Wie die Pseudomonas- Kulturen in Sriramulu et al. 14 , ASM enthält einen bestimmten Satz von Komponenten, die die verfügbaren Ressourcen für Sputum-Mikroben nachbildet und auch die physikalische Konsistenz von Sputum repliziert. Weil eine kranke Lunge ein spezifisches Mikrobiom hat, sollte das Studium solcher Mikroorganismen idealerweise auch in den spezifischen Bedingungen der Lunge stattfinden. Das WinCF-System ermöglicht eine schnelle Analyse und eine einfache Manipulation der experimentellen Bedingungen, um mikrobielle Veränderungen zu beobachten, ähnlich wie sie bei einer tatsächlichen Lungenbronchiole auftreten würden. Diese Technik ermöglicht die Inokulation einer Vielzahl von verwandten Probenarten einschließlich Sputum, Speichel, andere Körpersekrete und reine oder gemischte Bakterienkulturen. Die Natur des experimentellen Aufbaus ermöglicht eine sofortige visuelle Interpretation vondas mikrobielle Gemeinschaft Verhalten und ist so konzipiert, leicht nachgeschaltete Anwendung einer Vielzahl von mikrobiologischen und omics Verfahren zu ermöglichen. Solche Studien sind wichtig, weil bakterielle Veränderungen Gemeinschaft Zusammensetzung basierend auf den physikalisch-chemischen Bedingungen ihrer Umwelt. Mit WinCF die chemischen Bedingungen der Medien manipuliert werden, um die Auswirkungen auf die bakterielle Aktivität zu analysieren. Zum Beispiel kann der Säuregehalt der Medien geändert werden, bevor mit einer Probe der Inokulation. Nach der Inkubation kann die bakterielle Aktivität in jedem dieser Bedingungen direkt miteinander verglichen werden und Rückschlüsse darüber, wie Bakterien in diesen Sputum-Proben verhalten sich als Reaktion auf verschiedene pH gezogen werden. Hier erläutern wir die Verfahren zur Anwendung des WinCF System und Beispiele dafür, wie die Medien Chemie manipuliert werden kann, die Auswirkungen auf die Lunge microbiome zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Color-Coded Capillary Tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-260943</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cha-seal Tube Sealing Compound</td>
			<td style="width:93px;">Kimble-Chase</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mucin from porcine stomach</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferritin, cationized from horse spleen</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)</td>
			<td style="width:93px;">AppliChem Panreac</td>
			<td>A2159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Egg Yolk Emulsion, 50%</td>
			<td style="width:93px;">Dalynn Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">VE30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P2157500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the wincf model - an inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections

Viele chronische Atemwegserkrankungen führen zu Schleimverschluss der Atemwege. Lungen eines Individuums mit zystischer Fibrose sind ein exemplarischer Fall, bei dem ihre Schleimhautbronchiolen einen günstigen Lebensraum für die mikrobielle Kolonisation schaffen. Verschiedene Pathogene gedeihen in dieser Umgebung, die miteinander interagieren und viele der mit CF-Krankheit assoziierten Symptome antreiben. Wie jede mikrobielle Gemeinschaft haben die chemischen Bedingungen ihres Lebensraumes einen erheblichen Einfluss auf die Gemeinschaftsstruktur und die Dynamik. Beispielsweise gedeihen unterschiedliche Mikroorganismen in unterschiedlichen Konzentrationen von Sauerstoff oder anderen gelösten Konzentrationen. Dies gilt auch in der CF-Lunge, wo Sauerstoffkonzentrationen geglaubt werden, um die Physiologie und Struktur der Gemeinschaft zu treiben. Die hier beschriebenen Methoden sind so ausgelegt, dass sie die Lungenumgebung nachahmen und die Erreger in einer Weise erhöhen, die derjenigen ähnlich ist, aus der sie eine Krankheit hervorrufen. Manipulation der chemischen Umgebung dieser Mikroben wird dann verwendet, um zu untersuchen, wie die chemistry von Lungeninfektionen regelt seine mikrobielle Ökologie. Das Verfahren, das WinCF System bezeichnet wird, basiert auf künstlichen Sputum Medium und schmalen Kapillarröhrchen bedeutete einen Sauerstoffgradienten bereitzustellen, die ähnlich zu der in Schleim verstopft Bronchiolen existiert. Manipulieren chemische Bedingungen, wie beispielsweise die Medien pH-Wert des Sputums oder Antibiotika Drucks, ermöglicht die Visualisierung der mikrobiologische Unterschiede in den Proben, farbige Indikatoren, die gerade für Gas oder Biofilm-Produktion, oder Extrahieren und die Sequenzierung des Nukleinsäure Inhalts jeder Probe.

Das mikrobiologische Wachstum über die verschiedenen chemischen Zustände, die in den Proben induziert wurden, variierte drastisch in einigen Fällen und subtiler in anderen. Viele Veränderungen in der Aktivität waren in der Natur visuell, sobald die Inkubationszeit endete. Im Beispiel der pH-Manipulation variierten die Proben über dem pH-Spektrum stark, wie durch mehrere Faktoren gezeigt wurde, die nach der Inkubation sichtbar wurden. Wenn dem Medium keine Sputumproben zugesetzt wur...

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The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Der Schleim verstopft die Atemwege von zystischer Fibrose (CF) Patienten sind eine ideale Umgebung für die mikrobielle Krankheitserreger zu gedeihen. Das Manuskript beschreibt ein neuartiges Verfahren der CF-Lunge microbiome in einer Umgebung für die Untersuchung, dass imitiert, wo sie Krankheit und wie Veränderungen der chemischen Bedingungen verursachen mikrobielle Dynamik antreiben kann.

Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

the-wincf-model-an-inexpensive-tractable-microcosm-mucus-plugged

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9.0K Aufrufe.  University of California, San Diego.  Der Schleim verstopft die Atemwege von zystischer Fibrose (CF) Patienten sind eine ideale Umgebung für die mikrobielle Krankheitserreger zu gedeihen. Das Manuskript beschreibt ein neuartiges Verfahren der CF-Lunge microbiome in einer Umgebung für die Untersuchung, dass imitiert, wo sie Krankheit und wie Veränderungen der chemischen Bedingungen verursachen mikrobielle Dynamik antreiben kann. 

Serie: The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test, Messung der Lungenfunktion und Fixierung der Lunge, um die Auswirkungen von Übergewicht und beeinträchtigter Stoffwechsel auf pulmonale Ergebnisse studieren

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...